CN117645961A - 一种芽孢杆菌全水溶高密度5l发酵罐发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法。本发明使用的芽孢杆菌全水溶发酵培养基中使用的发酵原料都是水溶性很好的物料，使得发酵培养基的水溶性好，有利于芽孢杆菌水溶性发酵液的制备和加工。另外，发酵培养基中使用高浓度的镁盐，可以加强菌株代谢，缩短发酵时间，提高发酵液含菌量和芽孢得率；同时，为了配合镁盐在发酵过程中能够发挥加强菌株代谢的作用，本发明提供了较高的溶氧条件、丰富的碳源和较强的酸碱缓冲能力。采用本发明所述的发酵方法使5L的发酵罐的含菌量稳定提升到200亿CFU/mL，且多株芽孢杆菌使用此方案进行培养均能取得好的发酵效果。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法。
背景技术
目前芽孢杆菌发酵培养的培养基一般还是以生物质原料为主，比如玉米粉，豆饼粉，花生饼粉等等。这些原料有一个最大的问题就是发酵培养得到的菌液含有大量的颗粒物，无法直接用于加工水溶性菌剂产品，需要先将发酵液进行过滤才能进行后续水溶性菌剂产品的加工。不仅费时费力，过滤中还会浪费很多的菌体，还会带来二次污染。研发全水溶的发酵培养基可以解决上述问题。
但是，全水溶发酵配方一般需要使用酵母粉和蛋白胨成本较高的精料代替低成本的玉米粉粗料，使得成本高昂，因而需要全水溶发酵配方能够实现高密度发酵，才能够有益于工业生产。另外，全水溶配方的含菌量一般很低，极大可能的原因是玉米粉、豆饼粉这些生物质原料里面有一些无法明确和量化的生物因子，使得全水溶性发酵配方没有明确的改进方向。
再者，目前国内外的芽孢杆菌发酵厂家普遍采用分批发酵的生产方式。一次性投料一次性放罐，此种发酵方式经济实惠，容易操作，且不容易污染杂菌。但是一次性大量地投入高浓度的营养物质，尤其是碳源，比如葡萄糖和淀粉，会导致出现底物抑制的情况，很难实现芽孢杆菌高密度发酵，所以现有技术多采用补料培养的发酵方式，将造成底物抑制的营养物质先加入一部分，等到菌体旺盛生长代谢消耗的时候再进行流加来实现芽孢杆菌的高密度发酵。但是这样操作容易污染，操作流程复杂，发酵周期长。
因而，现有技术中缺少实现芽孢杆菌的全水溶高密度发酵培养基及配套的发酵方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，所述5L发酵罐发酵方法能够实现芽孢杆菌的全水溶高密度发酵，且发酵周期较短。
本发明提供了一种芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，包括如下步骤：
在规格为5L的发酵罐中，将芽孢杆菌的种子液接种于芽孢杆菌全水溶发酵培养基中进行振荡发酵培养，得到发酵产物；
所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：玉米淀粉35～50g/L、每克玉米淀粉添加10～15酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉15～20g/L、蛋白胨10～20g/L、轻质碳酸钙5～7g/L、硫酸镁12～30.73g/L、磷酸氢二钾3～6g/L、硫酸锰0.01～0.02g/L、葡萄糖15～20g/L和氯化钾1～3g/L；所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的pH值为7～7.5；
所述振荡发酵培养的转速为700～800r/min，通气量为1：1.5～1：2。
优选的，所述震荡发酵培养时的罐压为0.03～0.08MPa。
优选的，所述种子液的接种量为所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基体积的5％～15％。
优选的，所述振荡发酵培养的温度为32～37℃，时间为20h。
优选的，所述5L的发酵罐中芽孢杆菌全水溶发酵培养基的装液量为2～3L。
优选的，所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或多种。
优选的，所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基包括以下浓度的组分：玉米淀粉40.57g/L、每克玉米淀粉添加10酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉18.52g/L、蛋白胨15.78g/L、轻质碳酸钙5.2g/L、硫酸镁16.6g/L、磷酸氢二钾3.33g/L、硫酸锰0.017g/L、葡萄糖15.67g/L和氯化钾1.11g/L；所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的pH值为7。
优选的，所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：
将玉米淀粉、中温α-淀粉酶和水进行第一混合，得到第一混合料；
将所述第一混合料、酵母粉、蛋白胨、轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸锰、葡萄糖和氯化钾第二混合，得到第二混合料；
调节所述第二混合料的pH为7～7.5后，和硫酸镁第三混合，得到芽孢杆菌全水溶发酵培养基。
优选的，所述制备方法还包括：在所述第三混合后，将得到的第三混合物料与消泡剂混合后进行灭菌，得到芽孢杆菌全水溶发酵培养基；所述第三混合物料与消泡剂的体积比为1000：3。
本发明还提供了上述技术方案所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法在全水溶芽孢杆菌发酵液的工业生产中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，包括如下步骤：将芽孢杆菌的种子液接种于芽孢杆菌全水溶发酵培养基中进行振荡发酵培养，得到发酵产物；所述发酵培养于规格为5L的发酵罐中进行；所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：玉米淀粉35～50g/L、每克玉米淀粉添加10～15酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉15～20g/L、蛋白胨10～20g/L、轻质碳酸钙5～7g/L、硫酸镁12～30.73g/L、磷酸氢二钾3～6g/L、硫酸锰0.01～0.02g/L、葡萄糖15～20g/L和氯化钾1～3g/L；所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的pH值为7～7.5；所述振荡发酵培养的转速为700～800r/min，通气量为1：1.5～1：2。本发明所述5L发酵罐发酵方法中使用的芽孢杆菌全水溶发酵培养基中使用的发酵原料都是水溶性很好的物料，使得发酵培养基的水溶性好，有利于芽孢杆菌水溶性发酵液的制备和加工。另外，发酵培养基中使用高浓度的镁盐，可以加强菌株代谢，缩短发酵时间，提高发酵液含菌量和芽孢得率；同时，为了配合镁盐在发酵过程中能够发挥加强菌株代谢的作用，本发明所述发酵方法在发酵过程提供了较高的溶氧条件、丰富的碳源和较强的酸碱缓冲能力。而较高的溶氧条件体现在较高的发酵转速和通气量；使用中温α-淀粉酶促进培养基中淀粉的水解，为芽孢杆菌的发酵提供丰富碳源；同时以轻质碳酸钙代替常规发酵培养基中使用的重质碳酸钙，使发酵培养基具有较强的酸碱缓冲能力。采用本发明所述的发酵方法使5L的发酵罐的含菌量稳定提升到200亿CFU/mL，，且仅需要20h即能够完成发酵。且多株芽孢杆菌使用此方案进行培养均能取得好的发酵效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2中枯草芽孢杆菌KCXM的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图2为实施例2中解淀粉芽孢杆菌908的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图3为实施例2中枯草芽孢杆菌191的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图4为实施例2中枯草芽孢杆菌9407的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图5为实施例2中枯草芽孢杆菌2-1的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图6为实施例2中解淀粉芽孢杆菌9121的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图7为实施例2中解淀粉芽孢杆菌BS02的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图8为对比例1中枯草芽孢杆菌B201的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图9为对比例2中枯草芽孢杆菌B201的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
图10为实施例3中枯草芽孢杆菌B201的发酵过程中pH值和溶氧随时间的变化图；
具体实施方式
本发明提供了一种芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，包括如下步骤：
将芽孢杆菌的种子液接种于芽孢杆菌全水溶发酵培养基中进行振荡发酵培养，得到发酵产物；所述发酵培养于规格为5L的发酵罐中进行；
所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：玉米淀粉35～50g/L、每克玉米淀粉添加10～15酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉15～20g/L、蛋白胨10～20g/L、轻质碳酸钙5～7g/L、硫酸镁12～30.73g/L、磷酸氢二钾3～6g/L、硫酸锰0.01～0.02g/L、葡萄糖15～20g/L和氯化钾1～3g/L；所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的pH值为7～7.5；
所述振荡发酵培养的转速为700～800r/min，通气量为1：1.5～1：2。
本发明优选制备芽孢杆菌的种子液，所述芽孢杆菌的种子液的制备方法优选包括如下步骤：将芽孢杆菌在NA固体培养基上进行划线培养，挑取单菌落接种至NA液体培养基中进行振荡培养，得到所述芽孢杆菌的种子液。本发明对所述划线培养的具体过程没有特殊限定，采用本领域中常规过程和步骤即可，以达到活化芽孢杆菌的作用。本发明所述振荡培养优选于规格为250mL的三角瓶中进行，所述NA液体培养基的使用量优选为50mL。本发明所述振荡培养的温度优选为32～37℃，更优选为37℃；转速优选为180～200r/min，更优选为180r/min；时间优选为10～15h，更优选为12h。
得到所述芽孢杆菌的种子液后，本发明将所述芽孢杆菌的种子液接种于芽孢杆菌全水溶发酵培养基中进行振荡发酵培养，得到发酵产物。
本发明所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：玉米淀粉35～50g/L、每克玉米淀粉添加10～15酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉15～20g/L、蛋白胨10～20g/L、轻质碳酸钙5～7g/L、硫酸镁12～30.73g/L、磷酸氢二钾3～6g/L、硫酸锰0.01～0.02g/L、葡萄糖15～20g/L和氯化钾1～3g/L，优选包括如下组分：玉米淀粉40.57g/L、每克玉米淀粉添加10酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉18.52g/L、蛋白胨15.78g/L、轻质碳酸钙5.2g/L、硫酸镁16.6g/L、磷酸氢二钾3.33g/L、硫酸锰0.017g/L、葡萄糖15.67g/L和氯化钾1.11g/L，更优选由如下组分组成：玉米淀粉40.57g/L、每克玉米淀粉添加10酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉18.52g/L、蛋白胨15.78g/L、轻质碳酸钙5.2g/L、硫酸镁16.6g/L、磷酸氢二钾3.33g/L、硫酸锰0.017g/L、葡萄糖15.67g/L和氯化钾1.11g/L。本发明所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的pH值优选为7～7.5，更优选为7。本发明所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基中的组分来源于常规市售。本发明所述中温α-淀粉酶的酶活力优选为3000U/g。
本发明的芽孢杆菌全水溶发酵培养基中所使用的物料都是水溶性很好的物料，因而本发明的发酵培养基水溶性好，有利于芽孢杆菌水溶性菌剂产品的加工。另外，芽孢杆菌全水溶发酵培养基中使用高浓度的镁盐，可以加强菌株代谢，缩短发酵时间，提高发酵液含菌量和芽孢得率。同时，以轻质碳酸钙代替常规发酵培养基中使用的重质碳酸钙，使发酵培养基具有较强的酸碱缓冲能力。
本发明所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的制备方法优选包括如下步骤：将玉米淀粉、中温α-淀粉酶和水进行第一混合，得到第一混合料；
将所述第一混合料、酵母粉、蛋白胨、轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸锰、葡萄糖和氯化钾第二混合，得到第二混合料；
调节所述第二混合料的pH为7～7.5后，和硫酸镁第三混合，得到芽孢杆菌全水溶发酵培养基。
本发明将玉米淀粉、中温α-淀粉酶和水第一混合，得到第一混合料。
本发明所述第一混合于逐步升温的条件下进行，通过加热使中温α-淀粉酶发挥作用将玉米淀粉水解；在所述第一混合过程中进行匀速搅拌，直到玉米淀粉完全水解；所述第一混合料为玉米淀粉水解液。
得到所述第一混合料后，本发明将所述第一混合料、酵母粉、蛋白胨、轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸锰、葡萄糖和氯化钾第二混合，得到第二混合料。
本发明对所述第二混合的参数没有特殊限制，以组分充分溶解为准。
得到所述第二混合料后，本发明调节所述第二混合料的pH值为7～7.5后，和硫酸镁第三混合，得到芽孢杆菌全水溶发酵培养基。
本发明所述pH值优选为7。本发明调节所述第二混合料的pH值所采用的试剂优选为氢氧化钠溶液；所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度优选为4mol/L。
本发明在调节所述第二混合料的pH值为7后，再和硫酸镁混合，是由于本发明的发酵培养基中使用的硫酸镁的量比较大，如果先加入硫酸镁后再加入氢氧化钠会导致氢氧根离子优先和培养基中的镁离子反应生成大量的氢氧化镁沉淀，会大大增加氢氧化钠的用量，平均氢氧化钠的消耗量增加40％。此外，加入硫酸镁后培养基的pH值会轻微下降，例如从7.0降到6.9，这是由于一部分硫酸镁和氢氧化钠反应生成了氢氧化镁，但培养基灭菌后pH会升高，因而在调节所述第二混合料的pH值后，再和硫酸镁混合这一步骤对培养基的pH值的影响不大。
在所述第三混合后，本发明优选还包括将第三混合后的混合料与消泡剂混合后进行灭菌。本发明所述消泡剂优选为有机硅改性聚醚消泡剂；所述第三混合后的混合料与消泡剂的体积比优选为1000：3。本发明所述灭菌的方式优选为离位灭菌，所述灭菌的温度优选为115℃，时间优选为30min。由于本发明的发酵培养基中含有大量的葡萄糖，所以灭菌温度不能用121℃，会发生焦糖化反应。
在本发明中，所述振荡发酵培养的转速为700～800r/min，优选为750r/min；通气量为1：1.5～1：2，优选为1：2；所述通气量指的是培养基装液量与每分钟进入发酵罐中空气容量的体积比，如培养基的装液量为2.5L时，每分钟进入罐体的空气的容积为5L。本发明所述振荡发酵培养时的罐压优选为0.03～0.08MPa，更优选为0.05MPa。本发明所述转速、通气量和罐压的参数能够保证发酵培养时的溶氧量，以辅助配合培养基中高浓度的镁盐在发酵过程中能够加强菌株代谢。
本发明所述振荡培养的温度优选为32～37℃，更优选为34℃；时间优选为20h。
在本发明中，所述种子液的接种量优选为所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基体积的5％～15％，更优选为10％。本发明所述5L的发酵罐中芽孢杆菌全水溶发酵培养基的装液量优选为2～3L，更优选为2.5L。
本发明所述芽孢杆菌优选包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或多种，更优选包括枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
采用本发明所述的发酵方法使5L的发酵罐的含菌量稳定提升到200亿CFU/mL，，且仅需要20h即能够完成发酵。且多株芽孢杆菌使用此方案进行培养均能取得好的发酵效果。
基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法在全水溶芽孢杆菌发酵液的工业生产中的应用，优选为辅助全水溶芽孢杆菌发酵液在工业生产中的放大生产。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
枯草芽孢杆菌B201全水溶高密度5L发酵罐发酵培养，步骤如下：
1.1培养基的制备
培养基的配方如下：玉米淀粉40.57g/L，中温α-淀粉酶(按每克淀粉10酶活单位添加，酶活性为3000U/g)酵母粉18.52g/L，蛋白胨15.78g/L，轻质碳酸钙5.2g/L，硫酸镁16.6g/L，磷酸氢二钾3.33g/L，硫酸锰0.017g/L，葡萄糖15.67g/L，氯化钾1.11g/L，pH调节7.0。先将玉米淀粉和淀粉酶放在水中搅拌，边搅拌边加热，微沸后倒入不含硫酸镁的其他物料中，调节培养基pH到7，后加入硫酸镁搅拌。发酵培养基的配制体积为2.5L，培养基配制好后加入千分之三有机硅改性聚醚消泡剂(加入消泡剂的量为7.5mL)，灭菌方式为离位灭菌，灭菌温度115度，灭菌时间30min。
1.2种子液的制备
将冰箱保存的枯草芽孢杆菌B201(由中国农业大学保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.5786，且在中国专利CN105907661B中进行过公开)在NA固体平板上划线培养，活化培养24h后接单菌落于NA液体培养基中，种子瓶使用250mL三角瓶，培养基装液量为50mL，培养温度37℃，转速为180r/min，培养时间12h。
1.3发酵培养
种子液以培养基体积10％的接种量接入5L发酵罐中，温度34℃，转速750r/min，通气量1：2，罐压0.05MPa，培养约20小时即可完成发酵。最终结果统计如下表1所示。
表1各重复发酵统计结果
| 项目 | 重复1 | 重复2 | 重复3 |
| 发酵培养基装液量 | 2.5L | 2.5L | 2.5L |
| 接种量 | 10％ | 10％ | 10％ |
| 发酵培养20h产孢率 | ＞95％ | >95％ | ＞95％ |
| 发酵培养20h含菌量(亿CFU/mL) | 223 | 242 | 256 |
实施例2
本发明的方案同样适用于其他相关芽孢杆菌的高密度发酵培养，步骤如下：
1.1培养基的制备
培养基的配方如下：玉米淀粉40.57g/L，α-淀粉酶(按每克淀粉10酶活单位添加，酶活性为3000U/g)酵母粉18.52g/L，蛋白胨15.78g/L，轻质碳酸钙5.2g/L，硫酸镁16.6g/L，磷酸氢二钾3.33g/L，硫酸锰0.017g/L，葡萄糖15.67g/L，氯化钾1.11g/L，pH调节至7.0。先将玉米淀粉和淀粉酶放在水中搅拌，边搅拌边加热，微沸后倒入不含硫酸镁的其他物料中，调节培养基pH到7，后加入硫酸镁搅拌。发酵培养基的配制体积为2.5L，培养基配制好后加入千分之三有机硅改性聚醚消泡剂(加入消泡剂的量为7.5mL)，灭菌方式为离位灭菌，灭菌温度115度，灭菌时间30min。
1.2种子液的制备
将冰箱保存的其他芽孢杆菌(具体见表2，均由中国农业大学植物保护学院植物病害生物防治与微生态学实验室分离保藏)在NA固体平板上划线培养，活化培养24h后接单菌落于NA液体培养基中，种子瓶使用250mL三角瓶，培养基装液量为50mL，培养温度37℃，转速为180r/min，培养时间12h。
1.3发酵培养
种子液以发酵培养基体积10％的接种量接入5L发酵罐中，温度34℃，转速750r/min，通气量1：2，罐压0.05MPa，培养20h即可完成发酵。最终结果统计如表2和图1～7所示。
表2各种芽孢杆菌的发酵统计结果
由表2结合图1～7可以得出：使用本发明的方法可以实现芽孢杆菌的高密度发酵培养。根据溶氧随时间的变化曲线可以得出：发酵培养前期溶氧的下降表明芽孢杆菌在旺盛地生长，溶氧下降的越快表明芽孢杆菌生长地越快，此外溶氧很长一段时间是趴底的，且趴底的时间较长，这段时间菌体都在旺盛地生长，所以表明菌体不仅长的快，而且维持高速增长的时间较长，到了后面溶氧快速提升，表明它产芽孢是比较顺利且快速的。
依据pH值的变化曲线可以得出，pH值只有在发酵初期有一次很明显的下降，之后没有很明显的下降，表明培养基中碳氮源的比例设置是合理的，同时也表明发酵条件的设置是合理的，溶氧供给是充足的，可满足菌体的生长。
对比例1
使用溶氧和转速相偶联的发酵方式对枯草芽孢杆菌B201进行发酵培养，具体步骤如下：
培养基的配方如下：玉米淀粉40.57g/L，α-淀粉酶(按每克淀粉10酶活单位添加，酶活性为3000U/g)酵母粉18.52g/L，蛋白胨15.78g/L，轻质碳酸钙5.2g/L，硫酸镁16.6g/L，磷酸氢二钾3.33g/L，硫酸锰0.017g/L，葡萄糖15.67g/L，氯化钾1.11g/L，pH调节7.0。先将玉米淀粉和淀粉酶放在水中搅拌，边搅拌边加热，微沸后倒入不含硫酸镁的其他物料中，调节培养基pH到7，后加入硫酸镁搅拌。发酵培养基的配制体积为2.5L，培养基配制好后加入千分之三有机硅改性聚醚消泡剂(加入消泡剂的量为7.5mL)，灭菌方式为离位灭菌，灭菌温度115度，灭菌时间30min。
将冰箱保存的枯草芽孢杆菌B201在NA固体平板上划线培养，活化培养24h后接单菌落于NA液体培养基中，种子瓶使用250mL三角瓶，培养基装液量为50mL，培养温度37℃，转速为180r/min，培养时间12h。
种子液以培养基体积10％的接种量接入5L发酵罐中，培养温度为34℃，转速调节范围为300～600r/min，步进值为20r/s，发酵0～5小时溶氧下限设定为30％，5小时后溶氧下限调整为10％，初始通气量为1：0.8，发酵到3h的时候，通过转速调整很难把溶氧水平维持在30％以上，因此将通气量调整为1：1.5，发酵到6小时，最高通气量调整到1：2并维持不动，最终发酵没有成功，发酵到30h停止发酵(如图8所示)，发酵到30h刚有产孢迹象，进而说明使用常规的培养条件进行培养整个发酵过程长时间的溶氧偏低。本次实验表明现有的培养条件无法满足本发明中发酵培养基配方的发酵需求。
对比例2
在对比例1的培养基的基础上，寻找合适的发酵培养条件，步骤如下：
种子液的制备方法同对比例1，得到种子液。
种子液以培养基10％的接种量接入5L发酵罐中，发酵罐的培养温度为34℃，发酵培养的初始转速为400r/min，初始的通气量为1：0.8，整个发酵培养条件的调整过程如表3所示。
表3发酵培养条件调整过程
将对比例2中手动分段式调整的枯草芽孢杆菌B201发酵培养方式与采用同实施例1相同方法进行枯草芽孢杆菌B201全水溶高密度5L发酵罐发酵培养方式(记为实施例3)的结果进行比较，结果如表4和图9～10所示。
表4对比例2和实施例3中枯草芽孢杆菌B201发酵培养结果比较
| 项目 | 对比例2 | 实施例3 |
| 发酵培养基装液量 | 2.5L | 2.5L |
| 接种量 | 10％ | 10％ |
| 发酵结束产孢率 | ＞95％ | >95％ |
| 发酵结束含菌量(亿CFU/mL) | 223 | 231 |
由表4和图9～10中的结果可以发现使用本发明的发酵方法进行枯草芽孢杆菌B201的发酵培养需要较高的溶氧水平的发酵条件，对比例2中的分段式调整的发酵培养方式操作繁琐，不利于后续中试放大。
本发明设计的发酵培养条件全程可为发酵过程提供较高的溶氧条件，操作简便。最终在5L发酵罐中实现了枯草芽孢杆菌B201的全水溶高密度发酵。
对比例3
全可溶培养基的不同配制方法对枯草芽孢杆菌B201发酵结果的影响，步骤如下：
本对比例通过摇瓶实验探究了培养基的配制方法对菌株B201发酵结果的影响，目的是为了说明本发明中培养基配制方法被确定的过程。培养基的配方如下：玉米淀粉40.57g/L，α-淀粉酶(按每克淀粉10酶活单位添加，酶活性为3000U/g)酵母粉18.52g/L，蛋白胨15.78g/L，轻质碳酸钙5.2g/L，硫酸镁16.6g/L，磷酸氢二钾3.33g/L，硫酸锰0.017g/L，葡萄糖15.67g/L，氯化钾1.11g/L，pH调节7.0。
培养基配制方法：先将玉米淀粉和淀粉酶放在水中搅拌，边搅拌边加热，微沸后倒入不含硫酸镁的其他物料中，调节培养基pH至7，后加入硫酸镁搅拌，搅拌均匀后分装于三个500mL挡板摇瓶中，每瓶装入100mL，记为对照组。
使用本发明配制方法配制的培养基作为对照组，后改变培养基的配制方法，配制各处理组培养基，各处理组的培养基配制好后也是分别分装于三个500mL的挡板摇瓶中，每瓶装入100mL。培养基不同的配制方法及发酵24小时的发酵结果如表5所示，种子液的制备方法同对比例1，
表5培养基的不同配制方法对枯草芽孢杆菌B201发酵结果的影响
由以上实施例可以得出：本发明所述5L发酵罐发酵方法能够实现芽孢杆菌的全水溶高密度发酵。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
在规格为5L的发酵罐中，将芽孢杆菌的种子液接种于芽孢杆菌全水溶发酵培养基中进行振荡发酵培养，得到发酵产物；
所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：玉米淀粉35～50g/L、与玉米淀粉的比例为1g：10～15酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉15～20g/L、蛋白胨10～20g/L、轻质碳酸钙5～7g/L、硫酸镁12～30.73g/L、磷酸氢二钾3～6g/L、硫酸锰0.01～0.02g/L、葡萄糖15～20g/L和氯化钾1～3g/L；所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的pH值为7～7.5；
所述振荡发酵培养的转速为700～800r/min，通气量为1：1.5～1：2。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述振荡发酵培养时的罐压为0.03～0.08MPa。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述种子液的接种量为所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基体积的5％～15％。
4.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述振荡发酵培养的温度为32～37℃，时间为20h。
5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述5L的发酵罐中芽孢杆菌全水溶发酵培养基的装液量为2～3L。
6.根据权利要求1所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基包括以下浓度的组分：玉米淀粉40.57g/L、每克玉米淀粉添加10酶活单位的中温α-淀粉酶、酵母粉18.52g/L、蛋白胨15.78g/L、轻质碳酸钙5.2g/L、硫酸镁16.6g/L、磷酸氢二钾3.33g/L、硫酸锰0.017g/L、葡萄糖15.67g/L和氯化钾1.11g/L；所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的pH值为7。
8.根据权利要求1或7所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述芽孢杆菌全水溶发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：
将玉米淀粉、中温α-淀粉酶和水进行第一混合，得到第一混合料；
将所述第一混合料、酵母粉、蛋白胨、轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸锰、葡萄糖和氯化钾第二混合，得到第二混合料；
调节所述第二混合料的pH为7～7.5后，和硫酸镁第三混合，得到芽孢杆菌全水溶发酵培养基。
9.根据权利要求8所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在所述第三混合后，将得到的第三混合物料与消泡剂混合后进行灭菌，得到芽孢杆菌全水溶发酵培养基；所述第三混合物料与消泡剂的体积比为1000：3。
10.权利要求1～9任一项所述的芽孢杆菌全水溶高密度5L发酵罐发酵方法在全水溶芽孢杆菌发酵液的工业生产中的应用。
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