CN117643310A - 用于工业用途的细菌孢子组合物 - Google Patents

Abstract

在一个方面中，本发明涉及涂覆有包含细菌孢子和萌发化合物的组合物的植物或植物部分。在另一个方面中，本发明涉及增强植物或植物部分的生长的方法，包括用这样的组合物涂覆该植物或植物部分。再在另一个方面中，本发明涉及包含细菌孢子和萌发化合物的组合物，其中这样的组分以无活性形式维持。本发明还涉及所述组合物在废水处理、环境治理、油回收、水产养殖***和直接饲喂微生物中的用途。

Description

用于工业用途的细菌孢子组合物

本申请是申请日为2015年8月6日、申请号为201580053801.7、发明名称为“用于工业用途的细菌孢子组合物”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求2014年8月6日提交的美国临时申请系列No.62/033,825；2015年8月6日提交的美国申请系列No.14/819,577；和2015年8月6日提交的美国申请系列No.14/819,583的优先权权益，其由此通过引用全文并入。

技术领域

本发明一般地涉及用于工业用途的细菌孢子组合物，所述工业用途如农业、环境治理、堆制肥料、甲烷生产、保洁(clean supplies)、采油和直接饲喂微生物。

背景技术

孢子形成细菌物种具有广泛的工业应用，包括在农业、环境治理、堆制肥料、甲烷生产、采油和保洁中的用途。根据使用的特定细菌种，其中包含细菌的组合物可能特别地适用于农业、园艺、环境、益生剂(probiotic)、水生动植物、工业和卫生用途。几种孢子形成细菌物种在许多行业中具有实用性。例如，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)用作农业杀真菌剂，并且用于废水处理、清洁产品和直接饲喂微生物中。

关于农业应用，使用孢子形成细菌来增强植物的健康是本领域公知的。例如，Zhang等(2009，Plant J 58:568-577)教导了促进植物生长的细菌枯草芽孢杆菌GB03提高了植物的铁吸收和光合作用能力。Xie等(2009，Plant Signaling and Behavior 4(10):948-953)教导了这一相同的枯草芽孢杆菌菌株产生的挥发物提高了植物生长和种子计数。Han等(2014，Frontiers in Plant Science 5(525):1-8)报道了在接种了枯草芽孢杆菌GB03的土壤中生长的白三叶草植物在芽高度、根长度、植物生物量、叶面积和叶绿素含量方面显著高于非接种的对照。也可以将此类细菌的孢子涂覆于种子或其他植物繁殖材料上，使得一旦播种或种植，则可以建立支持种子萌发、植物生长的刺激或种子和所得到的植物的生物防护的增强环境。例如，能够在豆类植物中实现固氮的共生细菌，如来自根瘤菌(Rhizobium)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)属的那些，可以用于接种豆类植物以有助于根瘤形成。可以通过涂覆种子、对种子或作物的农田喷撒(dusting)或在种植时在犁沟中放置接种物来完成接种。

孢子形成细菌还可以用于环境治理方法中，如生物治理(bioremediation)。生物治理涉及使用微生物将化合物转化成无害或不太有害的化合物。生物治理技术通常比竞争的物理技术成本低，并且可以适用于更宽范围的污染问题和现场条件的变化。参见US2002/0090697。

可以用细菌处理受污染的介质以促进水、土壤和工业废水中有机污染物的生物降解。例如，Lupton等(美国专利No.5,062,956)讨论了一种除去可溶性Cr(VI)的方法，其使用厌氧细菌将Cr(VI)还原成Cr(III)并作为不溶性氢氧化物(其作为固定沉淀出来)固定。Lupton等还描述了在连续生物反应器中处理含有不合需要量的Cr(VI)的水性残留物。Turick等(美国专利No.5,681,739)描述了一种降低液体水性残留物中的Cr(VI)浓度的方法，包括提供Cr(Vi)-还原细菌、将液体水性残留物与营养介质(例如，糖蜜、醋酸、氨基酸、酪蛋白氨基酸、尿素)混合并将混合物接触厌氧细菌来增强Cr(VI)还原成Cr(III)的步骤。这种方法可以用于六价铬污染的土壤和/或地下水的生物治理。

一个与使用此类细菌相关的困难是它们必须处于营养体状态以提供这种益处，但难以将芽孢杆菌种和其他孢子形成细菌以营养体形式配制而使得它们具有适当的储存期。此外，营养体形式的芽孢杆菌种可能不能在工业用途需要的苛刻条件下存活，如在适合于种子萌发发生的条件之前种子或其他植物繁殖材料所经历的条件。相反，这些物种的孢子形式的制剂对于商业和实际应用合适得多。例如，如Cartman等(2008，Applied andEnvironmental Microbiology，8月，p.5254-5258)提到的，“细菌孢子特别适合用作活微生物产品，因为它们是代谢休眠的且对于环境应激具有高度恢复力。这些固有特性从商业角度来看是高度需要的且意味着基于孢子的产品具有长保存期和在分配和储存期间保持其生存力”。

某些化合物(特别是某些L-氨基酸)刺激芽孢杆菌孢子萌发的用途已经在文献中报道。例如，Foerster等(1996，Journal of Bacteriology91(3):1168-1177)公开了L-丙氨酸添加到水性溶液中的孢子混悬液中引起多种芽孢杆菌种的萌发。然而，在工业用途中使用细菌孢子和萌发化合物的组合的一个挑战是在萌发化合物的存在下将孢子保持在无活性形式直至需要孢子萌发。例如，用细菌孢子组合物处理的植物繁殖材料(如种子)可以在种植前经历几个月的储存期。因此，存在着对于可以刺激细菌孢子在有利条件下快速萌发同时还防止孢子太早萌发直至需要孢子萌发的细菌孢子制剂的需求。

此外，用于农业或工业用途的细菌可以暴露于不利于细菌孢子萌发的广泛的环境条件，如低土壤pH、高盐浓度(例如，NaCl)和高金属浓度(例如，铜和铝)。因此，存在着对研发能够在这些不利条件下萌发的细菌孢子制剂的需求。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及涂覆有包含细菌孢子和萌发化合物的组合物的植物繁殖材料。在某些实施方案中，将孢子和萌发化合物保持在无活性形式，使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直至组合物经历活化环境。组合物可以进一步包含阻止细菌孢子和萌发化合物相互作用直至组合物经历活化环境的物质。在某些实施方案中，所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。在某些实施方案中，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。

在某些实施方案中，植物繁殖材料选自花、种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、芽、苗、种子、叶、秧苗和移植物。在特定实施方案中，植物繁殖材料是种子。植物繁殖材料可以在萌发后或从土壤出芽后移栽。

在上述植物繁殖材料的某些实施方案中，细菌孢子选自土壤芽孢杆菌(Bacillusagri)、Bacillus aizawai、白色芽孢杆菌(Bacillus albolactis)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌(Bacillusbutanolivorans)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、Bacillus kurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌(Bacilluslactimorbus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌(Bacillus medusa)、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popillae)、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)、多刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria thornei)、Pasteurianishizawae和链霉菌属(Streptomyces)的种。

在上述植物繁殖材料的某些实施方案中，萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。在特定实施方案中，细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；和萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。组合物可以进一步包含种子涂层聚合物。在某些实施方案中，组合物进一步包含选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂的物质。

在另一个方面中，本发明涉及增强植物繁殖材料的生长或产量的方法，包括用包含细菌孢子和萌发化合物的组合物涂覆植物繁殖材料，其中所述植物繁殖材料的生长或产量相对于没有涂覆所述组合物的相应植物繁殖材料的生长或产量得到增强。在某些实施方案中，将孢子和萌发化合物保持在无活性形式，使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直至组合物经历活化环境。在一些实施方案中，组合物进一步包含阻止细菌孢子和萌发化合物相互作用直至组合物经历活化环境的物质。在一些实施方案中，所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。

在上述方法的某些实施方案中，组合物包含细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。在某些实施方案中，植物繁殖材料选自花、种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、芽、苗、种子、叶、秧苗和移植物。在特定实施方案中，植物繁殖材料是种子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在萌发后或从土壤出芽后移栽所述植物繁殖材料。

在某些实施方案中，上述方法中使用的细菌孢子选自土壤芽孢杆菌、Bacillusaizawai、白色芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌、Bacillus kurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌、扬氏梭菌、丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae和链霉菌属的种。

在上述方法的某些实施方案中，萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。在一些实施方案中，细菌孢子选自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)；且萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。上述方法中使用的组合物可以进一步包含种子涂层聚合物。在特定实施方案中，组合物包含表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂中的一种或多种。

在另一个方面中，本发明涉及包含细菌孢子和萌发化合物的组合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在无活性形式，使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直至组合物经历活化环境。在一些实施方案中，组合物进一步包含阻止细菌孢子和萌发化合物相互作用直至组合物经历活化环境的物质。在一些实施方案中，所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。

在上述组合物的特定实施方案中，细菌孢子选自土壤芽孢杆菌、Bacillusaizawai、白色芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌、Bacillus kurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌、扬氏梭菌、丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae和链霉菌属的种。

在上述组合物的一些实施方案中，萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。在特定实施方案中，细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；和萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。在一些实施方案中，组合物是干粉形式。在一些实施方案中，组合物包括阻止细菌孢子和萌发化合物相互作用直至组合物经历活化环境的物质。在某些实施方案中，组合物是乳液形式。

在另一个方面中，本发明涉及用组合物涂覆的植物或植物部分，所述组合物包含：a)细菌孢子；和b)萌发化合物。在另一个方面中，本发明涉及制备涂覆有组合物的植物或植物部分的方法，所述组合物包含：a)细菌孢子；和b)萌发化合物，所述方法包括用组合物处理植物或植物部分。在某些实施方案中，孢子和萌发化合物保持在无活性形式，使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直至组合物经历活化环境。在某些实施方案中，组合物进一步包含阻止细菌孢子和萌发化合物相互作用直至组合物经历活化环境的物质。在某些实施方案中，所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。在某些实施方案中，组合物包含细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。

在某些实施方案中，植物或植物部分选自花、种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、芽、苗、种子、叶、秧苗和移植物。在某些实施方案中，植物或植物部分是种子。在某些实施方案中，在萌发后或从土壤出芽后，用组合物涂覆植物或植物部分。在某些实施方案中，在萌发前或从土壤出芽前，用组合物涂覆植物或植物部分。在某些实施方案中，植物或植物部分是植物繁殖材料。

在某些实施方案中，细菌孢子选自土壤芽孢杆菌、Bacillus aizawai、白色芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌、Bacilluskurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌、扬氏梭菌、丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae和链霉菌属的种。

在某些实施方案中，萌发化合物选自果糖、葡萄糖、钾、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。在某些实施方案中，细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；和萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。

在某些实施方案中，组合物进一步包含种子涂层聚合物。在某些实施方案中，组合物进一步包含选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂的物质。

在另一个方面中，本发明涉及增强植物或植物部分中的产量相关性状的方法，包括用组合物处理植物或植物部分，所述组合物包含a)细菌孢子；和b)萌发化合物，其中植物或植物部分中的产量相关性状相对于没有用所述组合物涂覆的相应植物或植物部分的产量相关性状得到了增强。在某些实施方案中，将孢子和萌发化合物保持在无活性形式，使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直至组合物经历活化环境。在某些实施方案中，组合物进一步包含阻止细菌孢子和萌发化合物相互作用直至组合物经历活化环境的物质。在某些实施方案中，所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。在某些实施方案中，组合物包含细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。

在上述方法的某些实施方案中，植物或植物部分是植物繁殖材料。在某些实施方案中，植物或植物部分是种子。在某些实施方案中，植物或植物部分选自花、种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、芽、苗、种子、叶、秧苗和移植物。在某些实施方案中，所述方法包括在萌发后或从土壤出芽后，用组合物处理植物或植物部分。在某些实施方案中，所述方法包括在萌发前或从土壤出芽前，用组合物处理植物或植物部分。

在某些实施方案中，细菌孢子选自土壤芽孢杆菌、Bacillus aizawai、白色芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌、Bacilluskurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌、扬氏梭菌、丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae和链霉菌属的种。

在某些实施方案中，萌发化合物选自果糖、葡萄糖、钾、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。在某些实施方案中，细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；和萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。在某些实施方案中，组合物进一步包含种子涂层聚合物。在某些实施方案中，组合物进一步包含表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂中的一种或多种。

在另一个方面中，本发明涉及用于处理废水的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物加入废水中。

在另一个方面中，本发明涉及用于环境治理的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于土壤或水。

在另一个方面中，本发明涉及用于处理水产养殖***中的水的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物接触水产养殖***中的水。在某些实施方案中，水产养殖***包括动物。

在另一个方面中，本发明涉及用于在水产养殖***中饲喂动物的方法，包括将包含组合物的动物饲料给予水产养殖***中的动物，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。

在上述方法的某些实施方案中，动物选自鱼、虾或软体动物。在某些实施方案中，水产养殖***包括选自弧菌属(Vibrio)的种、气单胞菌属(Aerononas)的种和黄杆菌属(Flavobacterium)的种的病原体。在某些实施方案中，动物的生长相对于没有用组合物处理的水产***中的动物得到了提高。在某些实施方案中，组合物是颗粒、压块(briquettes)、丸状、药片或胶囊的形式。

在另一个方面中，本发明涉及包含组合物和可接受载体的益生剂，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。在某些实施方案中，可接受载体选自动物饲料、奶、酸奶、奶酪、发酵奶、谷物、发酵谷物、汁液、冰激凌或用于婴儿或儿童的配方食品(formulation)。

在另一个方面中，本发明涉及制备益生剂的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物与可接受载体混合。在某些实施方案中，可接受载体选自动物饲料、奶、酸奶、奶酪、发酵奶、谷物、发酵谷物、汁液、冰激凌或用于婴儿或儿童的配方食品。

在另一个方面中，本发明涉及用于饲喂动物的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物给予动物。在某些实施方案中，动物选自家禽、反刍动物、牛、猪、兔子、马、甲壳类、软体动物、鱼和宠物。

在另一个方面中，本发明涉及包含组合物和可接受载体的直接饲喂微生物，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。在某些实施方案中，载体选自动物饲料、代乳品、乳清、植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酸酯80、丙二醇、丁羟基茴香醚、柠檬酸、乙氧喹、石灰石、稻壳、酵母培养物、麦芽糊精(malodextrin)、蔗糖、右旋糖、干淀粉和铝硅酸钠。

在另一个方面中，本发明涉及制备直接饲喂微生物的方法，包括将包含孢子和萌发化合物的组合物与可接受载体混合。在某些实施方案中，可接受载体选自动物饲料、代乳品、乳清、植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酸酯80、丙二醇、丁羟基茴香醚、柠檬酸、乙氧喹、石灰石、稻壳、酵母培养物、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉和铝硅酸钠。

在另一个方面中，本发明涉及包含组合物和可接受载体的清洁产品，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。在某些实施方案中，可接受载体选自去污剂、肥皂和香精。

在另一个方面中，本发明涉及制备清洁产品的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物与可接受载体混合。在某些实施方案中，可接受载体选自去污剂、肥皂和香精。

在另一个方面中，本发明涉及从废料产生甲烷的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于废料。

在另一个方面中，本发明涉及处理动物废物、草垫或褥草的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于动物废物、草垫或褥草。

在另一个方面中，本发明涉及制备青贮饲料的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于青贮饲料。

在另一个方面中，本发明涉及用于微生物增强采油(MEOR)方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于油井。在某些实施方案中，细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌。

在另一个方面中，本发明涉及一种治疗或预防易感疾病或患有疾病的受试者的疾病的方法，包括将有效量的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物给药于受试者，由此治疗或预防受试者的疾病。在某些实施方案中，疾病是细菌疾病、真菌疾病或病毒疾病。在某些实施方案中，疾病是坏死性肠炎。在某些实施方案中，受试者是鸡、火鸡或鸭。在某些实施方案中，受试者感染了产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。在某些实施方案中，治疗或预防疾病导致与没有施用组合物的受试者相比，降低死亡率、减少病变数量和提高增重。

在上述任一方法的某些实施方案中，将孢子和萌发化合物保持在无活性形式，使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直至组合物经历活化环境。

在上述任一方法的某些实施方案中，组合物进一步包含阻止细菌孢子和萌发化合物相互作用直至组合物经历活化环境的物质。在上述任一方法的某些实施方案中，所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。

在上述任一方法的某些实施方案中，组合物包含细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物，其中细菌孢子和萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。

在上述任一方法的某些实施方案中，细菌孢子选自土壤芽孢杆菌、Bacillusaizawai、白色芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌、Bacillus kurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌、扬氏梭菌、丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae和链霉菌属的种。

在上述任一方法的某些实施方案中，萌发化合物选自果糖、葡萄糖、钾、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。

在上述任一方法的某些实施方案中，细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；和萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。

在上述任一方法的某些实施方案中，组合物是干粉形式。

在上述任一方法的某些实施方案中，组合物是乳液形式。

具体实施方式

在一个方面中，本发明的混合物由细菌孢子和萌发化合物组成。所采用的细菌物种可以是形成孢子的任何物种，且通常是在人体或动物中表现出所需的益生菌活性的物种。但是，具有其它工业用途的细菌物种(包括可用于农业、环境治理、堆肥或甲烷生产、保洁等的那些)也可以使用。例如，由于其合成多种酶的能力及其环境可接受性，将芽孢杆菌属的种用于众多商业应用中。根据所用的特定细菌物种，细菌的组合物可能特别适用于农业、园艺、环境、益生剂、水生动植物、工业和卫生用途。针对任何特定孢子/萌发化合物紧密混合物所使用的特定组合物将取决于这种混合物所打算的用途。

在某些实施方案中，本发明涉及用包含：(a)细菌孢子；和(b)萌发化合物的组合物涂覆的植物或植物部分。细菌孢子包括增强植物生长的物种，其通常通过作为杀虫剂(例如，杀真菌剂、杀线虫剂或杀昆虫剂)发挥作用；或通过增强用于生长的繁殖材料周围的环境(例如，通过提高可利用营养素如氮的量)来增强植物生长。萌发化合物有助于细菌从其孢子快速转化成其营养体状态，由此能够使细菌更快速地增强植物的生长。

植物部分包括，但不限于，叶、茎、根、花、芽、果实、种子、块茎、球茎和根茎。

在某些实施方案中，植物或植物部分是植物繁殖材料。如本文中使用的，术语“植物繁殖材料”用于包括植物的所有生殖部分，如种子和营养性植物材料，如插条和块茎(例如，马铃薯)，其可以用于植物的繁殖。这包括种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、芽、苗、秧苗和移植物，即，在萌发后或从土壤出芽后移栽的幼苗。这些移植物也可以通过浸没或浇灌进行全部或部分处理，在移栽前进行保护。优选，植物繁殖材料是种子。

在本发明中特别有用的植物包括单子叶植物和双子叶植物，包括但不限于选自槭属(Acer spp.)、葱属(Allium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、菠萝Ananas comosus、旱芹(Apium graveolens)、花生属(Arachis spp.)、芦笋(Asparagus officinalis)、甜菜(Betavulgaris)、芸薹属(Brassica spp.)(例如，甘蓝型油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassicarapa)亚种[加拿大油菜(canola)、油菜籽(oilseed rape)、白菜型油菜(turnip rape)])、茶树(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、***(Cannabis saliva)、辣椒属(Capsicum spp.)、栗属(Castanea spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、椰子属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea spp.)、芜荽(Coriandrum sativum)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、南瓜属(Cucurbita spp.)、黄瓜属(Cucumis spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山毛榉属(Fagusspp.)、无花果(Ficus carica)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如，大豆(Glycine max)、Soja hispida或Soja max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如，向日葵(Helianthusannuus)、木槿属(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如，大麦(Hordeumvulgare)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、莲属(Lotus spp.)、丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、番茄属(Lycopersicon spp.)(例如，番茄(Lycopersicon esculenturn)、樱桃番茄(Lycopersicon lycopersicum)、Lycopersiconpyriforme)、苹果属(Malus spp.)、苜蓿(Medicago sativa)、薄荷属(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属(Musa spp.)、烟草属(Nicotianaspp.)、木犀榄属(Olea spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如，水稻(Oryza sativa)、阔叶野生稻(Oryza latifolia))、黍稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、百香果(Passiflora edulis)、欧芹(Petroselinum crispum)、菜豆属(Phaseolus spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、杨属(Populus spp.)、李属(Prunus spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、醋栗属(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、柳属(Salixsp.)、接骨木属(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、芝麻属(Sesamum spp.)、芥属(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如，马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)、假高粱(Sorghum halepense)、菠菜属(Spinacia spp.)、酸角(Tamarindus indica)、可可(Theobroma cacao)、车轴草属(Trifolium spp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属(Triticum spp.)(例如，小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、莫迦小麦(Triticum macha)、马卡小麦(Triticum sativum)或面包小麦(Triticum vulgare)、越橘属(Vaccinium spp.)、蚕豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属(Vitis spp.)和玉米(Zea mays)的草料或草料豆类、观赏植物、粮食作物、树木或灌木。尤其优选的是水稻、油菜籽、加拿大油菜、大豆、玉米(corn)(玉米(maize))、棉花、甘蔗、苜蓿、高粱和小麦。

本发明的组合物中使用的细菌包括任何具有工业用途的孢子形成细菌，所述用途如增强植物的生长、环境治理、废水处理或用于水产养殖***中。例如，植物生长的增强可以是形成生长的植物可利用的另外的资源的形式，如增强氮可利用率，例如，如通过根定殖细菌(rhizobacterium)或提供植物生长促进物质(如氨基酸、有机酸或激素)来提供的。或者，细菌可以对植物(例如，植物繁殖材料)提供免受植物致病真菌或细菌和/或土生动物(如，属于线虫门(Nematoda)和袋形动物门(Aschelminthes)的那些)的有害影响的保护。对抗植物寄生线虫和寄生微生物的保护作用可以通过对这些土生动物有害的和/或对微生物群体有害的几丁质分解、蛋白分解、胶原蛋白分解或其他活性来发生。呈现这些杀线虫、杀真菌和杀细菌特性的细菌可以包括，但不限于，包括Bergey’s Manual of SystematicBacteriology，第二版(2009)(其通过引用全文并入)中所列的厚壁菌门(Firmicutes)的孢子形成成员和放线菌门(Actinobacteria)的孢子形成成员。说明性的物种包括嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、高地芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、解淀粉芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus aneurinolyticus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、Bacillus aquaemaris、萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus)、Bacillusboronophilus、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、热溶芽孢杆菌(Bacillus caldolyyicus)、中孢芽胞杆菌(Bacillus centrosporus)、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌(Bacillus flavothermus)、梭形芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、球芽胞杆菌(Bacillus globigii)、深层芽孢杆菌(Bacillus infernus)、幼虫芽孢杆菌(Bacilluslarvae)、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌(Bacillus mesentericus)、莫海威芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillus pantothenicus、乳状芽孢杆菌(Bacillus popilliae)、多粘芽胞杆菌(Bacillus polymyxa)、假炭疽杆菌(Bacillus pseudoanthracis)、短小芽孢杆菌、施氏芽胞杆菌(Bacillus schlegelii)、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、热葡糖苷酶芽胞杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)、苏云金芽胞杆菌、Bacillus vulgatis、韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)、热纤梭菌、杨氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌和丁酸梭菌。优选的物种包括解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、简单芽胞杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteurianishizawa和链霉菌属的种。

特别优选的细菌物种包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌和短小芽孢杆菌。

萌发化合物可以包括有效地引起所用的特定孢子形成细菌物种的萌发的任何化合物。通常，这样的萌发化合物是L-氨基酸，包括L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。这样的类似物可以由本领域普通技术人员通过在基础化学物质的基团上或基团内进行取代而产生。因此，例如，L-丙氨酸的类似物包括：L-Leu-L-Ala、L-Ala-L-Leu、L-Pro-L-Ala、L-Ala-L-Pro、a-L-Glu-L-Ala、L-Ala-L-Glu、L-His-L-Ala、L-Ala-L-His、L-Ala-L-Ala、Gly-L-Ala、L-Ala-Gly、(N42-甲基磺酰基)乙氧基羰基-L-丙氨酸二环己基铵盐(N-MSOC-L-Ala)、N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸(N-t-BOC-L-Ala)、N-乙酰基-L-丙氨酸(N-Ac-L-Ala)、N-2,4-二硝基苯基-L-丙氨酸(N-DNP-L-Ala)、N苄氧羰基-L-丙氨酸(N-CBZ-L-Ala)、5-二甲基氨基-l-萘磺酰基-L-丙氨酸环己基胺盐(N-丹磺酰基-L-Ala)、N-苯甲酰基-L-丙氨酸(N-Bz-L-Ala)、L-丙氨酸甲基酯盐酸盐、L-丙氨酸乙基酯盐酸盐、L-丙氨酸叔丁基酯盐酸盐、L-丙氨酸苄基酯盐酸盐、L-丙胺酰胺、L-丙氨酸对-硝基酰替苯胺盐酸盐和L-丙氨醇。优选的萌发化合物包括L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。最优选地，这种萌发化合物是L-丙氨酸。

这些氨基酸可以作为单独的化合物或以多肽的形式使用，如蛋白质水解产物，例如酪蛋白水解产物。有用的多肽通常包含至少50％的作为萌发剂发挥作用的氨基酸和不超过20％的作为抑制剂发挥作用的氨基酸，这样的百分比是基于多肽中氨基酸的数目。

在某些实施方案中，除了L-氨基酸外，还可以使用另外的萌发化合物来优化细菌孢子的萌发和生长反应。例如，在某些实施方案中，组合物包含至少一种L-氨基酸和选自果糖、葡萄糖和钾离子的其他萌发化合物。

特别优选的芽孢杆菌/萌发化合物组合包括：

L-丙氨酸+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+丁酸梭菌

L-缬氨酸+枯草芽孢杆菌、L-缬氨酸+地衣芽孢杆菌、L-缬氨酸+短小芽孢杆菌、L-缬氨酸+解淀粉芽孢杆菌、L-缬氨酸+凝结芽孢杆菌、L-缬氨酸+蜡状芽孢杆菌、L-缬氨酸+克劳氏芽孢杆菌、L-缬氨酸+丁酸梭菌

L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌

L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+枯草芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+地衣芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+短小芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+解淀粉芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+凝结芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+蜡状芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+克劳氏芽孢杆菌、L-天冬酰胺+葡萄糖+果糖+钾离子(GFK)+丁酸梭菌

L-丙氨酸+肌苷+枯草芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+地衣芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+短小芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+解淀粉芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+凝结芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+蜡状芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+克劳氏芽孢杆菌、L-丙氨酸+肌苷+丁酸梭菌

L-脯氨酸+葡萄糖+巨大芽胞杆菌、L-脯氨酸+巨大芽胞杆菌、L-乳酸+丁酸梭菌。

萌发化合物以足以引起所使用的细菌孢子萌发的量存在。虽然这可以容易地通过常规实验对于任何特定细菌孢子/萌发化合物混合物来确定，但这些萌发化合物通常在干燥之前以0.0001mg/mL-170mg/mL的浓度配制。在一些实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.0003mg/mL-170mg/mL，0.0003mg/mL-30mg/mL，0.001mg/mL-100mg/mL或0.001mg/mL-10mg/mL的浓度配制。在优选的实施方式中，萌发化合物在干燥之前以0.001mg/mL-1mg/mL的浓度配制。

为了进一步增强萌发，优选将孢子休克。可以以各种标准方法将孢子休克，所述方法例如渗透压休克、热休克、压力休克、营养剥夺和/或暴露于某些酸。热休克涉及在足以诱导热休克蛋白产生的温度下将孢子加热足够长的时间段。将细菌孢子休克的方法是本领域已知的。例如，Atluri等(2006,Journal of Bacteriology 188(1):28-36)描述了一种用于枯草芽孢杆菌的这种热休克处理。

本发明的组合物包含(a)细菌孢子和(b)萌发化合物；其特征在于所述孢子和萌发化合物保持在无活性形式，使得萌发化合物不会诱导孢子的萌发直至所述组合物经历活化环境。这样的组合物可用于产生本发明的涂覆的植物或植物部分(例如，植物繁殖材料)，以及本文中所述的其他用途，如环境治理、废水处理、疾病预防或治疗、油回收或用于水产养殖***中。

如本文中使用的，术语“活化环境”是指允许萌发化合物和孢子相互作用而使得孢子被诱导进入营养体状态的环境。这样的活化环境可以涉及添加水(通过雨水、土壤中的水分或在种植前添加到涂覆的植物繁殖材料的水)，或其可能需要如温度、水分、pH和盐度的因素的组合。

因此，这样的组合物可以包含孢子和萌发化合物的干燥混合物；或它们可以包括阻止孢子和萌发化合物相互作用的其他材料(例如，低温熔化蜡)，直至达到需要的环境标准。可以用于组合物中来防止孢子和萌发化合物相互作用的其他材料包括，但不限于，表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂和染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。此外，这样的组合物可以采用乳液的形式，其中由于存在于不同的相中，孢子和萌发化合物保持没有相互作用。

在某些实施方案中，孢子和萌发化合物彼此在紧密混合物中。

如本文中使用的，术语“紧密混合物”是指其中孢子和萌发化合物保持在邻近的位置直到它们到达有利于萌发的环境(即，活化环境)的混合物。

这种紧密混合物可以使用如喷雾干燥、冻干、空气干燥或滚筒干燥的方法获得。在优选的实施方式中，紧密混合物通过喷雾干燥或冻干产生。当形成这样的紧密混合物时，重要的是孢子和萌发化合物不会在允许萌发化合物引起孢子萌发的条件下混合在一起，因为这可能引起过早萌发而对于混合物的保存期具有不利影响。这可以通过在喷雾干燥器中使用单独的流(或者通过使用两个喷嘴或者使用允许同时喷雾两个单独的流的单一喷嘴)，或者通过在不利于萌发的条件(例如，温度)下冻干来避免。过早萌发也可以通过紧接在干燥之前将孢子块引入含有萌发化合物的溶液中来避免。

在优选的实施方式中，萌发化合物被紧密混合物中的细菌孢子吸附或吸收。在进一步的实施方式中，细菌孢子和萌发化合物精细地分散在整个紧密混合物中。在更进一步的实施方式中，细菌孢子和萌发化合物微观地分散在整个紧密混合物中，以使得基本上由细菌孢子组成的单个颗粒和基本上由萌发化合物组成的单个颗粒对于裸眼不可见。

在一个实施方式中，紧密混合物通过在干燥之前在溶液中组合细菌孢子和萌发化合物制备。优选地，细菌孢子和萌发化合物紧接在干燥之前在溶液中组合。

虽然不希望受任何理论的限制，据信紧密混合物的形成将萌发化合物置于其可以在混合物到达适宜的萌发环境时更优先地与孢子的萌发起始位点结合的邻近位置中。这样的邻近位置允许萌发化合物在竞争中胜过可能存在的萌发干扰化合物(如D-氨基酸)，其结果是更高百分比的孢子会萌发。由于细菌一旦进入营养体期它们呈指数生长，这种提高的百分比可以快速地导致培养物形成中几个级数的增加。

这样的组合物可以进一步包含附加的组分，包括共萌发剂、营养物和配制助剂，只要这样的添加剂没有诱导孢子和萌发化合物过早地相互作用。

根据本发明的涂覆的植物或植物部分(例如，植物繁殖材料)可以是得益于接种物或者促进植物生长或杀虫微生物的存在的任何植物物种。

可以通过通常用于涂覆植物材料(例如，种子或其他萌发材料)的任何常规方式，用细菌和萌发化合物涂覆植物或植物部分(例如，植物繁殖材料)，只要这样的方式没有不利地影响孢子的存活力以及这样的方式没有导致萌发化合物过早地将细菌转变成其营养体状态。可以使用的常规方式包括喷雾处理、滴注处理、浸透处理、涂抹处理、膜涂层处理、微丸涂层(pellet coat)处理等。种子涂覆方法是本领域已知的并且描述于例如美国专利No.7,989,391和美国专利No.5,849,320中。

在某些实施方案中，在萌发前或在从种植于其中的生长介质(例如，土壤)出芽前，用组合物涂覆植物或植物部分(例如，种子)。在其他实施方案中，在萌发后或在从种植于其中的生长介质(例如，土壤)出芽后，用组合物涂覆植物或植物部分，例如，通过将组合物喷射到在田间或温室中生长的植物上。

当应用这样的涂覆时，重要的是没有在允许萌发化合物引起孢子萌发的条件下将孢子和萌发化合物混合在一起，因为这将导致过早萌发，其对混合物的存储期具有不利影响。可以避免这种情况的一种方式是通过在喷雾干燥器中使用分开的流(或者通过使用两个喷嘴或允许同时喷雾两个分开的流的单个喷嘴；或通过在不利于萌发的条件(例如，温度)下冷冻干燥)。

除了生物活性成分外，种子涂覆组合物可以包括许多材料和添加剂，其是活性成分制剂的部分或者有利于种子涂覆的操作性能或其在种子上的功能性和耐久性。涂覆添加剂的实例是将活性成分粘结于种子的涂层聚合物。种子涂层聚合物可以包括，例如，但不限于，蛋白质、多糖、聚酯、聚氨酯、从不饱和单体制备的聚合物及其组合。

有利于种子涂覆的操作性能或者其在种子上的功能性和耐久性的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂和染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。这些添加剂的性质和作用是制剂领域的技术人员公知的。添加剂不应当干扰细菌的作用。

本发明中有用的结合剂优选包含天然或合成的并且对待涂覆的种子没有植物毒性作用的粘性聚合物。粘合剂可以选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糊精、海藻酸盐和壳聚糖；脂肪；油类；蛋白质，包括明胶和玉米醇溶蛋白；***树胶；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木素磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚乙烯丙烯酸酯；聚环氧乙烷；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚羟基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酰胺单体；和聚氯丁烯。

涂层中的粘合剂含量可以改变，但将在约0.01至约25％种子重量的范围中，更优选约0.05至约15％，和甚至更优选约0.1％至约10％。

繁殖材料涂层可以任选包括填充剂。填充剂可以是吸收剂或惰性填充剂，如本领域已知的，并且可以包括木粉、粘土、活性炭、糖类、硅藻土、谷粉、细谷粒无机固体、碳酸钙等。可以使用的粘土和无机固体包括钙膨润土、高岭土、陶土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、硅石、石英粉、蒙脱土及其混合物。可能有用的糖类包括糊精和麦芽糊精。谷粉包括小麦粉、燕麦粉和大麦粉。

填充剂选择为使得其将为种子提供适当的小气候，例如，填充剂用于提高活性成分的负载率和调节活性成分的受控释放。填充剂可以帮助种子涂覆的产生或过程。填充剂的量可以改变，但通常填充剂组分的重量在约0.05至约75％种子重量的范围中，更优选约0.1至约50％，和甚至更优选约0.5％至15％。

任选地，塑化剂可以用于涂层制剂中。塑化剂通常用于使得通过涂层形成的膜更柔性、改善粘附和可铺展性及提高处理的速度。提高的膜柔性对于最小化储存、操作或播种过程中的破碎、破裂或剥离是重要的。许多塑化剂可以使用，然而，有用的塑化剂包括聚乙二醇、甘油、丁基苄基邻苯二甲酸酯、甘醇苯甲酸酯和相关化合物。涂层中塑化剂的范围在约0.1至约20％重量的范围内。

处理过的种子还可以用薄膜外覆层包被，以保护活性组分涂层。这样的外覆层是本领域已知的并且可以使用常规的流化床和鼓式膜涂层技术来施用。

本发明还涉及增强植物或植物部分(例如，植物繁殖材料)的产量相关性状的方法，包括用包含：a)细菌孢子；和b)萌发化合物的组合物涂覆植物，其中植物的产量相关性状相对于没有涂覆所述组合物的相应植物的产量相关性状得到了增强。

如本文中使用的，术语“产量相关性状”是指有助于提高植物产量的任何性状。通过本发明的方法可以增强的产量相关性状包括，但不限于，总种子发芽率、种子发芽速率(例如，种子发芽需要的天数)、植物生物量、抗病性、昆虫抗性、耐旱性、耐热性、耐旱性、耐寒性、耐盐性、重金属耐受性、总产量、种子产量、开花时间(例如，早花时间)、根生长、早期活力、植物生物质、植物大小、总植物干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座丛直径、叶长、根长、根质量、分蘖数和叶数。

在特定实施方案中，产量相关性状选自总产量、总种子发芽率、种子发芽速率、植物生物量、昆虫抗性、早花时间和耐旱性。

如本文中使用的，术语“总种子发芽率”是指种植后萌发的种子的百分比。

如本文中使用的，术语“生物量”是指植物的总重。在生物量的定义内，可以在植物的一个或多个部分的生物量之间形成区分，植物的部分可以包括以下的任何一种或多种：地上部分，包括但不限于，芽生物量、种子生物量、叶生物量；地上可采收部分，包括但不限于，芽生物量、种子生物量、叶生物量；地下部分，包括但不限于，根生物量、块茎、球茎；地下可采收部分，包括，但不限于，根生物量、块茎、球茎；部分地在地下的可采收部分，包括但不限于，甜菜根和植物的其他下胚轴部分、根茎、匍匐茎或爬行根茎；植物性生物量，包括，但不限于，根生物量、芽生物量；繁殖器官；和繁殖体，包括但不限于，种子。

如本文中使用的，术语“早花时间”是指早于对照植物开始开花的植物。因此，这个术语是指显示出较早的开花起始的植物。可以通过计算播种和第一个花簇出现之间的天数(“开花时间”)来评价植物的开花时间。植物的“开花时间”可以例如使用WO07/093444(将其完整内容按引用并入本文中)中所述的方法来测定。

如本文中使用的，术语“干旱条件”是指导致植物中含水量缺乏、植物可利用水的缺乏、植物中水吸收潜能的缺乏或植物的水供给减少的任何胁迫。特别地，“干旱”是指由短期或长期天气模式导致的降水量缺乏。本领域普通技术人员容易地确定干旱条件。例如，帕摩尔干旱严重性指数(PDSI)(其是土壤水分的量度)、作物水分指数(CMI)和Z指数可以用于确定干旱条件。

使用本发明的方法可以增强产量相关性状。例如，在一些实施方案中，相对于没有施用本发明组合物的对照植物繁殖材料，本文中所述的任一产量相关性状在已经施用本发明组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中可以提高至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000％。

例如，在一些实施方案中，相对于没有施用本发明组合物的对照植物繁殖材料(例如，种子)，在已经施用本发明组合物的植物繁殖材料(例如，种子)中总种子发芽率可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。这些值中的任何一个可以用于限定总种子发芽率提高的范围。例如，在一些实施方案中，种子发芽率可以提高5-10％、5-20％或5-50％。在另一个实施方案中，与没有施用本发明组合物的对照植物繁殖材料(例如，种子)相比，在已经施用本发明组合物的植物繁殖材料(例如，种子)中种子发芽需要的天数可以减少1天。在一个实施方案中，与没有施用本发明组合物的对照植物繁殖材料(例如，种子)相比，在已经施用本发明水组合物的植物繁殖材料(例如，种子)中种子发芽需要的天数可以减少0.5天、1天、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或14天。这些值中的任何一个可以用于限定种子发芽需要的天数的减少范围。例如，种子发芽需要的天数可以减少1-2天、1-5天或2-5天。

在另一个实施方案中，与没有施用本发明组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)相比，在已经施用本发明组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中植物生物量可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。这些值中的任何一个可以用于限定植物生物量增长的范围。例如，在一些实施方案中，植物生物量提高5-10％、5-20％或5-50％。

在一些实施方案中，与没有施用本发明组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)相比，在已经施用本发明组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中昆虫抗性可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。例如，在一些实施方案中，昆虫抗性提高5-10％、5-20％或5-30％。

可以通过在生物或非生物胁迫条件下测量本文中所述的任一产量相关性状来测量昆虫抗性、抗病性和环境胁迫耐受性(例如，耐旱性)。例如，可以通过在干旱条件下测量百分发芽率、发芽速率、植物生物量、产量或种子产量来测定耐旱性。可以通过在合适的条件下测量产量相关性状来定量昆虫抗性、抗病性或环境胁迫耐受性。例如，用本发明的组合物处理的植物(例如，植物繁殖材料)相对于未用组合物处理的植物繁殖材料呈现出10％的产量提高将被确定为呈现耐旱性的10％提高。作为另一个实例，用本发明的组合物处理的植物(例如，植物繁殖材料)与没有施用组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)相比呈现生叶速率10％的提高将被确定为呈现昆虫抗性的10％提高。具有提高生叶速率的植物更能够抵抗昆虫侵袭或攻击。

在一些实施方案中，相对于没有施用本发明的组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)，在已经施用了本发明的组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中抗病性或食草动物耐受性可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。在一些实施方案中，相对于没有施用本发明组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)，在已经施用了本发明的组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中耐旱性可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。这些值中的任何一个可以用于限定抗病性或食草动物耐受性提高的范围。例如，在一些实施方案中，抗病性或食草动物耐受性提高为5-10％、5-20％或5-30％。

在一些实施方案中，相对于没有施用本发明的组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)，在已经施用了本发明的组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中耐热性或耐寒性可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。这些值中的任何一个可以用于限定耐热性或耐寒性提高的范围。例如，在一些实施方案中，耐热性或耐寒性提高为5-10％、5-20％或5-30％。

在一些实施方案中，相对于没有施用本发明的组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)，在已经施用了本发明的组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中耐盐性或重金属耐受性可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。可以使用本领域的标准方法来测定耐盐性或重金属耐受性。例如，可以通过测量阳离子的交换，例如，钙至钠的交换，来测定盐度。这些值中的任何一个可以用于限定耐盐性或重金属耐受性提高的范围。例如，在一些实施方案中，耐盐性或重金属耐受性提高可以为5-10％、5-20％或5-30％。

在一些实施方案中，相对于没有施用本发明的组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)，在已经施用了本发明的组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中总产量可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。这些值中的任何一个可以用于限定总产量提高的范围。例如，在一些实施方案中，总产量提高1-5％、1-10％或1-15％。

在一些实施方案中，相对于没有施用本发明的组合物的对照植物(例如，植物繁殖材料)，在已经施用了本发明的组合物的植物(例如，植物繁殖材料)中根生长、早期活力、植物大小、总植物干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座丛直径、叶长、根长、根质量、分蘖数或叶数可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。这些值中的任何一个可以用于限定根生长、早期活力、植物大小、总植物干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座丛直径、叶长、根长、根质量、分蘖数或叶数提高的范围。例如，在一些实施方案中，根生长、早期活力、植物大小、总植物干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座丛直径、叶长、根长、根质量、分蘖数或叶数可以提高1-5％、5-10％或5-20％。

通常，“增强的产量相关性状”或“产量相关性状的提高”是指测试植物(例如，植物繁殖材料)中高于用于评价性状水平的测试的标准误差的性状水平，并且优选是对照样品(例如，没有接触本发明组合物的植物繁殖材料的样品)中的性状水平，并优选几个对照样品中的平均性状表达水平的至少两倍，和更优选三倍、四倍、五倍或十倍。

本文中所列范围内包括的值和范围和/或中间值也意图在本发明公开内容的范围内。具有本文中所述值作为上限或下限的范围也意图在本发明公开内容的范围内。

本发明还提供了用于处理废水的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物加入废水中。组合物可以用于处理任何废水，包括市政废水、工业废水或农业废水，抽水站、泵和造纸废水，食品加工废水，石化废水和动物废料废水。组合物还可以用于化粪池、集油器和废水存储槽中的现场废水处理。在某些实施方案中，组合物可以用于降解餐馆和商业厨房产生的废水中的脂肪、油类和油脂。组合物还可以加入小规模废水储存罐中用于分解船、便携式厕所和其他小型废物容纳***中的废物。

本发明的废水处理方法还可以在各种反应器***中进行。例如，尽管废水处理通常在罐中进行，该反应可以在用于废水储存的任何容器或储存器中进行，只要提供合适的条件来维持合适的环境以支持组合物中细菌的生长和生物活性。合适的废水处理反应器***包括但不限于悬浮生长生物反应器和附着生长生物反应器。在悬浮生长生物反应器中，可以通过搅动液体将组合物与废水混合。在粘附生长生物反应器中，提供各种固体支持介质以允许组合物中的细菌粘附于其表面。合适的介质包括，但不限于，滴滤器、旋转生物接触器、填充床反应器和本领域已知的其他介质。适用于本文中使用的再一种粘附生长生物反应器是流化床反应器或移动床反应器。在这个***中，含有细菌的生物载体保持悬浮于待处理的废水中，通过与水混合相关的曳力流化。细菌可以捕获在聚合物多孔材料中，如聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)或其他聚合物凝胶(如藻酸钙)的颗粒。细菌可以在悬浮载体中粘附而形成生物膜，所述载体如K1、K3、MiniChip和BiofilmChip塑料载体(AnoxKaldnes，瑞典)。流化床反应器允许微生物群体快速增长，因此减少废水处理需要的时间。使用细菌菌株处理废水的方法是本领域已知的并且描述于例如美国专利申请公开No.2012/0000849和2011/0180476中。

在某些实施方案中，用于废水处理的组合物包含选自巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的细菌孢子。

本发明还提供环境治理的方法，包括将上述任一种包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于土壤或水。芽孢杆菌属的种可以用于水和陆地的环境治理。用于土壤治理的作用方式与以上针对废水处理所述的几乎相同。细菌通过酶和产生酸来分解化学物质和污染物，所述酸产生进一步分解污染物或以更低反应性的形式与其结合。

本文中所述的组合物可以用于受广泛污染物污染的环境介质和废水的生物治理和生物介导的化学还原，所述污染物包括卤化有机化合物(例如，三氯乙烯、四氯乙烯、氟利昂)和无机污染物如基于砷的杀虫剂、氰化物、铬(VI)、铀(VI)和其他毒性金属的氧化形式。组合物还可以用于其他疏水性并且因此顽固性的有机污染物的处理，如有机氯杀虫剂、多氯联苯类(PCB)和聚环芳烃类(PAH)，这是通过促进提高这些污染物的生物利用率和生物地球化学反应性的过程。可以通过组合物增强的生物治理过程包括生物降解和生物介导的有机污染物的化学还原，所述污染物如卤化溶剂、有机氯杀虫剂和氯化烃类，其通过细菌转化成无害无机物形式和/或较低有害性的副产物。此外，组合物可以促进无机污染物的生物介导的化学还原，如基于砷的杀虫剂、氰化物、铬(VI)、铀(VI)和其他毒性金属的氧化形式。

在某些实施方案中，组合物可以制成颗粒、压块、丸状、药片或胶囊的形式。组合物可以施用于并任选地混入污染的废物(例如，淤泥、固体和/或液体废物等)或其他受污染的介质(如土壤、沉降物或水体等)中。对于涉及受污染地下水和含水层介质的处理，组合物(例如，颗粒)可以应用于安装在受污染区域中的井内的过滤垫(filter socks)、滤罐或筒中。

在另一个方面中，本发明涉及从废料产生甲烷的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于废料。在某些实施方案中，废料来自市政废物处理点。通过细菌分解废料可以促进产生甲烷的其他细菌的共同活性，所述甲烷作为能源捕获。

可以从包含有机物质的浆液或淤泥形式的废料产生甲烷，例如，来自废水处理、水纯化产生的淤泥处理或颗粒状生物可降解有机废物处理的淤泥。在某些实施方案中，废料是废水处理生物固体。产生甲烷的方法可以包括使用热水解处理复合有机材料(液体和残余固体部分两者)。然后通过细菌的厌氧消化可以用于甲烷的产生。本领域中描述了从废料产生甲烷，例如，在美国专利No.8,470,567、美国专利No.7,311,834、美国专利No.7,101,482、美国专利No.6,966,989和美国专利No.7,332,095中。

本发明还提供用于处理水产养殖***中的水的方法，包括将上述任一种包含细菌孢子和萌发化合物的组合物接触水产养殖***中的水。组合物可以直接加入水中，或可以按照例如美国专利No.7,082,893中所述的用于生物过滤器***中。组合物可以用于水产养殖***中来治理和分解由为食物而饲养的水生物种(如虾、鱼和软体动物(例如，蛤蜊))产生的废物。在特定实施方案中，水产养殖***是孵化场。组合物还可以用于水产养殖中以循环营养素、分解脂质、蛋白质、淀粉以及产生氨基酸&增强饲料转化的酶。组合物还可以用于产生天然抗生素并提供竞争性排除以提供针对环境以及动物的胃肠道中的病原体的保护。在特定实施方案中，水产养殖***中的病原体是弧菌属物种，例如，Vibrio chagasii或溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)。在某些实施方案中，水产养殖***中的病原体是以下表1A中所列的病原体之一。这种天然抗生素的产生和对抗病原体的竞争性排除也可以用于人益生菌中或用于生产动物和伴随动物的直接饲喂微生物中。

在某些实施方案中，通过将组合物悬浮于水中并随后在每日换水后立即将悬浮液加入罐中而将组合物加入水产养殖***中。在某些实施方案中，将组合物以1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸或1×10⁹cfu细菌/ml水产养殖***中的水的比率加入水产养殖***中。这些值中的任何一个可以用于限定水产养殖***中组合物的细菌浓度的范围。例如，细菌的浓度可以为1×10⁵-1×10⁶或1×10⁴-1×10⁶cfu/ml水。

相对于没有用组合物处理的受感染水产养殖***中的动物，用本文中所述的组合物处理病原体感染的水产养殖***中的水可以提高水产养殖***中的动物的存活百分比。在一些实施方案中，相对于没有用组合物处理的受感染的水产养殖***中的动物，水产养殖***中的水的处理将动物存活百分比提高了至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500％。在特定的实施方案中，存活百分比提高至少400％。

本发明还涉及用于饲喂水产养殖***中的动物的方法，包括将包含上述任一种组合物的动物饲料给予水产养殖***中的动物，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。在某些实施方案中，动物选自鱼、虾或软体动物。在某些实施方案中，相对于给予不包含组合物的动物饲料的对照动物，该水产养殖***中的动物的生长(例如，体重)得到了提高。在某些实施方案中，动物感染了以下表1A中提供的至少一种病原体。

例如，在一些实施方案中，相对于未给予包含本发明的组合物的动物饲料的对照动物，已经给予了包含本发明组合物的动物饲料的动物中体重可以提高至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。这些值中的任何一个可以用于限定体重增加的范围。例如，在一些实施方案中，体重可以提高5-10％、5-20％或5-50％。

在上述方法的某些实施方案中，细菌孢子选自地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。

本发明还提供用于食物的细菌孢子萌发化合物混合物，所述食品用于人食用或用于动物饲料。在某些实施方案中，用于人食用的食物是益生剂。在某些实施方案中，动物饲料是直接饲喂微生物。如本文中使用的，术语“益生剂”是指用于人食用的含有活微生物(即，能够繁殖的微生物，如细菌孢子)的食品。如本文中使用的，术语“直接饲喂微生物”是指用于动物食用的含有活的微生物(即，能够繁殖的微生物，如细菌孢子)的食料(即，动物饲料)。参见，例如，美国专利No.8,420,074。益生剂或直接饲喂微生物可以包含本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的任一种组合物。使用孢子形成细菌(包括某些芽孢杆菌菌株)作为用于人和动物的益生菌在近年来已经流行起来。如Knap等(WO 2010/0700005)中所述的，将如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的物种用作动物饲料中的补充剂以通过提高动物饲料的消化和营养利用率来促进生长。凝结芽孢杆菌是用于人食用的商业益生菌产品中的活性成分，帮助促进蛋白质、乳糖和果糖的消化。

在某些实施方案中，食物或动物饲料包含选自短小芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的细菌孢子。

包含细菌的直接饲喂微生物的有益效果包括病原体的竞争性排除、通过细菌酶和酸分解饲料而实现更有效的转化、刺激免疫***以及通过细菌产生抗生素和细菌素。细菌孢子以及(孢子萌发后)营养体状态的细菌还通过降低氨臭味和分解肥料而使得更易于处理而改善动物的环境。

可接受的载体可以加入直接饲喂微生物中。可接受的载体可以是液体载体、固体载体、水溶性载体或任何其他合适的载体。优选的液体载体是代乳品。代乳品通常是粉末形式的代乳品，其与水混合以形成类似奶的组合物。另一种优选的液体载体是水。干的载体包括，但不限于，动物饲料、乳清、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干淀粉和硅铝酸钠。在某些实施方案中，水溶性载体选自乳清、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉和硅铝酸钠。在其他实施方案中，用于直接饲喂微生物的可接受载体选自植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酸酯80、丙二醇、丁基羟基茴香醚、柠檬酸和乙氧喹。

在某些实施方案中，直接饲喂微生物包含选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的细菌孢子。在其他实施方案中，直接饲喂微生物包含选自巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的细菌孢子。

在某些实施方案中，直接饲喂微生物作为在断奶前7-19天的哺乳期中饲喂的奶补充剂(代乳品)、断奶前1-2天给予接着在保育期中在水***中给予7天的单剂量凝胶糊或灌服药(drench)，或在断奶前1-2天给予接着在保育过程中在浆状饲料中给予2-3天的单剂量凝胶糊或灌服药饲喂。直接饲喂微生物可以以其他形式，持续不同的时间段，以及在不同的动物生长阶段饲喂。

在某些实施方案中，给动物饲喂直接饲喂微生物，使得递送至动物的细菌菌株量为至少1×10⁷集落形成单位(CFU)、1×10⁸CFU、1×10⁹CFU或1×10¹⁰CFU/天。然而，应当注意到较高和较低剂量的细菌菌株也可以饲喂给动物。

在某些实施方案中，动物饲料(例如，益生剂或直接微生物)包含每克动物饲料至少约1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸或1×10⁹CFU的待递送至动物的细菌菌株。这些值中的任何一个可以用于限定动物饲料中细菌菌株的浓度范围。例如，在一些实施方案中，动物饲料包含至少约1×10⁵-1×10⁷CFU、5×10⁵-5×10⁶CFU或1×10⁶-5×10⁶CFU细菌菌株/克动物饲料。

在某些实施方案中，用于人食用的食物(例如，益生剂)包含至少约1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸或1×10⁹CFU的待递送至人的细菌菌株/克用于人食用的食物。这些值中的任何一个可以用于限定用于人食用的食物中细菌菌株的浓度范围。例如，在一些实施方案中，用于人食用的食物包含至少约1×10⁵-1×10⁷CFU、5×10⁵-5×10⁶CFU或1×10⁶-5×10⁶CFU细菌菌株/克动物饲料。

在另一个方面中，本发明还涉及制备直接饲喂微生物的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物与如上所述的用于直接饲喂微生物的可接受载体混合。

在另一个方面中，本发明涉及用于饲喂动物的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物给予动物。在某些实施方案中，可以将动物饲料结合其他动物饲料成分给予动物。动物可以是任何感兴趣的动物。在某些实施方案中，动物是选自家禽、反刍动物、牛、猪、兔、马、鱼和宠物的动物。组合物可以以至少10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹集落形成单位(CFU)细菌/克饲料的剂量来给予。还可以通过将组合物加入用于动物的饮水中、将组合物喷撒到动物上或经由糊状物、凝胶或大丸剂施用来给予组合物。

在某些实施方案中，益生剂包含本文中所述的组合物和可接受载体，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。在某些实施方案中，用于益生剂的可接受载体选自奶、酸奶、奶酪、发酵奶、谷物、发酵谷物、汁液、冰激凌或用于婴儿或儿童的配方食品。本发明还涉及制备益生剂的方法，包括将本文中所述的组合物与如上所述的用于益生剂的可接受载体混合，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。

在另一个方面中，本发明涉及处理土壤、生长介质或堆肥的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于土壤、生长介质或堆肥。细菌孢子可以与任何合适的载体混合并喷撒或散布在土壤、生长介质或堆肥上。在萌发和进入营养体状态时，细菌孢子开始利用周围介质并且随后经由营养物循环(将物质分解成可以被植物吸收的较简单形式)或释放结合的物质来产生对植物有益的物质。通过营养物循环使得可用的物质包括氮、磷、钾、锌、铁、镁和其他微量营养素。细菌还产生抗生素、抗真菌化合物、细菌素、有机酸、氨基酸、酶和铁载体，这些可以被植物利用或结合周围根围一起工作来给植物提供益处。

在另一个方面中，本发明涉及提高植物的病原体或昆虫抗性的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于植物，其中相对于没有用组合物处理的相应植物，病原体或昆虫抗性提高。细菌可以通过诱导抗性(例如，对病原体和昆虫的诱导***抗性(ISR))来提高植物的病原体或昆虫抗性。细菌还可以通过形成生物膜和经由营养素和空间的竞争性排除阻止其他细菌或真菌的生长来提高植物的病原体抗性。

在某些实施方案中，病原体是真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体。在某些实施方案中，用于提高真菌病原体抗性的组合物包含选自巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的细菌孢子。

在另一个方面中，本发明涉及包含本文中所述的组合物和可接受载体的清洁产品，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。在某些实施方案中，清洁产品包含选自巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的细菌孢子。在某些实施方案中，用于清洁产品的可接受载体选自去污剂、肥皂和香精。在某些实施方案中，清洁产品用于浴室和中转区域。细菌可以提高清洁产品的有效性的方式之一是通过使用尿素作为能量源，由此分解尿素并减少臭味，如氨。一旦细菌孢子萌发，细菌的营养体状态可以在瓷砖之间的水泥浆中和地毯的垫料中生长以提供不合需要的物质的分解。

在某些实施方案中，清洁产品包括至少约1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸或1×10⁹CFU细菌孢子/克清洁产品。这些值中的任一个可以用于限定清洁产品中细菌孢子的量的范围。例如，在一些实施方案中，清洁产品包含至少约1×10⁵-1×10⁷CFU、5×10⁵-5×10⁶CFU或1×10⁶-5×10⁶CFU细菌菌株/克清洁产品。

本发明还涉及制备清洁产品的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物与可接受载体混合。在某些实施方案中，方法中所用的可接受载体选自去污剂、肥皂和香精。

本发明还涉及处理动物废物、草垫或褥草的方法，包括将本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物应用于动物废物、草垫或褥草。

在另一个方面中，本发明涉及包含本文中所述的组合物的青贮饲料，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。本发明还涉及制备青贮饲料的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物应用于青贮饲料。青贮饲料是一种通过在筒仓或其他密闭容器中发酵植物生物质产生的动物饲料，所述植物生物质如草、干草、谷类作物或玉米。在处理用于生产青贮饲料的农业原料时，将植物生物质，如草或玉米，与乳酸细菌混合以形成青贮饲料。青贮饲料的生产是用于提高动物饲料的稳定性和提高原料的特性的公知方法。对于生产青贮饲料，玉米和草类、黍、具有或不具有谷粒的谷物和豆类植物适宜作为原料。为了生产青贮饲料，常常使用青贮助剂，称为青贮起发剂(silage starter)，其包含化学添加剂和微生物添加剂。微生物添加剂也可以加入青贮饲料中，例如，用于抑制污染生物体的生长、减少霉菌毒素或减少反刍动物的甲烷排放。用于制备含有微生物添加剂的青贮饲料的方法是本领域已知的并且描述于例如US 2011/0142991中。

在某些实施方案中，青贮饲料包含至少约1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸或1×10⁹CFU细菌孢子/克青贮饲料。这些值中的任一个可以用于限定青贮饲料中细菌菌株的浓度范围。例如，在一些实施方案中，青贮饲料包含至少约1×10⁵-1×10⁷CFU、5×10⁵-5×10⁶CFU或1×10⁶-5×10⁶CFU细菌菌株/克青贮饲料。

本发明还涉及用于微生物增强采油(MEOR)的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于油井。在某些实施方案中，将组合物施用于油井的钻孔或油井的储层。MEOR是三次采油过程，其中将微生物用于在成熟油层中受困的原油的活化(mobilization)。MEOR可以通过改变油、水或岩石界面特性或通过由于生物阻塞引起的流动行为的变化而提高油回收。用于MEOR的方法描述于例如美国专利No.8,746,334和8,826,975及Al-Sulaimani等，2011，Biotechnol.Bioinf.Bioeng.1(2):147-158中。MEOR可以通过将油井的排空部分重新加压至目标压力或通过产气细菌菌株产生目标量的气体来增强油回收。可以将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物通过油井注入至油井储层中。然后将井密封直至井中的压力达到目标压力或产生目标量的气体以提高油井的油产量。

在储层显著耗尽后，地下油储层常常灌注水以提供额外的压力而利于油回收。在一些实施方案中，将本文中所述的组合物与这种灌注水一起注入井中。这种情况中，灌注水作为水性液体载体发挥作用。或者，本发明的组合物可以与灌注水分开注入井中。在这后一种情况中，提供另一种水性液体，即，除了灌注水以外的液体，来作为载体。通过灌注水将微生物注入油井中的方法描述于例如美国专利No.5,044,435中。

在某些实施方案中，芽孢杆菌或梭菌属物种可以用于MEOR。在特定的实施方案中，用于MEOR的细菌物种选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌。

本发明还涉及治疗或预防受试者的疾病的方法，包括将有效量的本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物给药于受试者，由此治疗或预防受试者的疾病。“有效量”是足以治疗受试者的疾病的量。有效量可以在一次或多次给药中给予。在某些实施方案中，通过将组合物加入饲料(例如，动物饲料)中将组合物给予受试者。

在某些实施方案中，通过本发明的组合物治疗或预防的疾病选自细菌疾病、真菌疾病和病毒疾病。如本文中使用的，术语“细菌疾病”、“真菌疾病”和“病毒疾病”分别指由细菌病原体、真菌病原体或病毒病原体引起的疾病。在特定的实施方案中，疾病是细菌疾病。通过给予细菌组合物，例如，通过给予芽孢杆菌物种控制的几种病原体是本领域已知的。例如，Baron(2009，Postgraduate Medicine 121(2):1-5)教导了将包含凝结芽孢杆菌的益生剂给予甲型流感病毒或腺病毒感染的人类受试者显著提高了受试者的免疫应答。Bastos等(2013，Viruses 5:1219-1230)。

已知通过芽孢杆菌物种控制的病原体的实例以及由这些病原体引起的相应疾病显示于以下的表1A中。

表1A.通过芽孢杆菌物种控制的示例性病原体和相应疾病。

本发明还涉及预防或降低易受病原体感染的受试者中的病原体感染的方法，包括将有效量的本文中所述的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物给药于受试者，由此预防或降低受试者中的感染。在某些实施方案中，病原体是细菌、真菌或病毒。在某些实施方案中，病原体选自表1A中所列的病原体。

在特定实施方案中，通过本发明的组合物治疗或预防的疾病是坏死性肠炎。坏死性肠炎是鸡、火鸡和鸭中看到的急性或慢性肠毒血症，由产气荚膜梭菌引起，并且特征在于血纤蛋白-坏死性肠炎，通常是中肠-小肠的。死亡率可以为5-50％，通常大约为10％。感染通过粪便-口传播发生。致病生物体的孢子是高度抗性的。致病因素包括球虫病(coccidiosis)/球虫病(coccidiasis)、膳食(高蛋白)、高粘度膳食(常常与膳食中包含高燕麦和小麦相关)、受污染的饲料和/或水以及其他衰竭性疾病。坏死性肠炎的征兆包括抑郁、竖起的羽毛、缺乏食欲、闭眼、不动、深色腹泻和突然死亡。症状还包括损伤、增厚和膨胀的小肠(通常是中部至末端)、具有白喉膜的肠粘膜、具有坏死物质的深棕色的肠内容物、嗉囊中胆汁染色液体的回流(如果上端小肠受到影响)。受影响的鸟类易于脱水并发生快速腐败。

可以基于禽群的历史和肉眼损伤来进行推测性诊断。证实是基于来自受影响组织的涂片中大量杆状物的观察以及对特定药物的良好响应，通常在短于48小时内。标准处理包括饮用水中的青霉素类(例如，苯氧甲基青霉素、羟氨苄青霉素)或饲料中的杆菌肽(例如，100ppm)。

在上述任一方法的某些实施方案中，受试者是人。在上述任一方法的某些实施方案中，受试者是非人动物。在某些实施方案中，受试者选自鸡、火鸡和鸭。在某些实施方案中，受试者选自鱼、虾或软体动物。在某些实施方案中，鱼选自鲑鱼、鳟鱼、鲤鱼、梭子鱼、鲈鱼、鲶鱼、大菱鲆和鲽鱼。

实施例

提供以下实施例来说明根据本发明原理的本发明，但其不是解释为以任何方式限制本发明。

在以下实施例中，术语“GOSD”(萌发优化喷雾干燥)和“GO+”是指其中萌发优化剂(L-丙氨酸，除非另外指明)与所指示的特定芽胞杆菌物种一起喷雾干燥的组合物。芽胞杆菌物种的孢子与紧接在喷雾干燥之前作为包含0.044克丙氨酸/毫升蒸馏水的溶液引入孢子块中的L-丙氨酸一起喷雾干燥。

术语“GO-”是指其中芽胞杆菌物种在不存在萌发化合物的情况下类似地喷雾干燥的组合物。

此外，以下方法用于在实施例中测定孢子萌发，除非另外指明。当孢子置于营养溶液中并开始萌发时，它们释放导致发黑的吡啶二羧酸和离子。萌发的这一指示剂导致孢子悬浮液的可见光消光的降低。因此，萌发率通过计数暗/亮孢子相的比例并在u.v.-可见光分光光度计下监测萌发孢子悬浮液在600nm处的光密度(O.D.600)的降低来测定。这个比率随后转换为百分萌发率。

实施例1：在与L-丙氨酸的紧密混合物中枯草芽孢杆菌ENV 923的萌发增加

为了比较本发明紧密混合物的孢子的萌发率与不存在萌发剂的常用孢子的萌发率，进行以下处理：

A.紧密混合物的形成：枯草芽孢杆菌ENV 923的孢子与紧接在干燥之前作为包含0.044克丙氨酸/毫升蒸馏水的溶液引入孢子块中的L-丙氨酸一起喷雾干燥。产生的紧密混合物通过随后引入由蒸馏水中的0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH 7的溶液中萌发。

B.孢子与萌发剂的常规混合：枯草芽孢杆菌ENV 923的孢子喷雾干燥并随后引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH 7的溶液中。这些孢子通过引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH 7的溶液(每毫升溶液加0.0001克丙氨酸)中来萌发。

C.单独孢子的萌发：枯草芽孢杆菌ENV 923的孢子喷雾干燥并随后引入由蒸馏水中的0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH 7的溶液中。

这样的处理各自进行两次重复。以下表1B显示这种处理影响枯草芽孢杆菌ENV923萌发的平均结果，如通过光密度的百分下降测量的。光密度的下降指示萌发的进展。光密度(OD)在600nm波长下用Jenway 6320D型可见光范围分光光度计测量。使用的L-丙氨酸纯度为99％并来源于Alfa Aeser；Heysham,Lancashire,United Kingdom。

表1B.随时间从OD(600nm)基线的百分降低

样品时间(分钟)	0	5	10	15	20
						紧密混合物	0％	2.7％	17.7％	34.3％	41.2％
常规混合	0％	0.5％	18.8％	31.9％	33.7％
						单独孢子	0％	1.3％	3.2％	4.1％	7.5％

以上结果表明，通过如喷雾干燥的方法配制成与萌发化合物的紧密混合物的孢子比与相同萌发剂常规混合的孢子更快地萌发。因此，用本发明的组合物涂覆的植物繁殖材料将更快速和有效地接收与其所涂覆的特定细菌相关的益处，因为这样的细菌将以大幅提高的量存在。

实施例2：用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV923的萌发增加

枯草芽孢杆菌孢子在L-丙氨酸溶液存在下通过对孢子喷雾干燥而用GOSD(萌发优化喷雾干燥)进行处理，且萌发水平通过光密度(OD)读数测定。

0.01M磷酸钾缓冲液，pH 7

0.01M磷酸钾缓冲液使用1M K₂HPO₄(87.09g，溶解于0.5L蒸馏水中)和1M KH₂PO₄(68.045g，溶解于0.5L蒸馏水中)溶液制备。将61.5ml的1M K₂HPO₄与38.5ml的1M KH₂PO₄合并和用蒸馏水稀释到1000ml而制备pH 7.0的0.1M磷酸钾缓冲液。用蒸馏水以1:10的比率进一步稀释0.1M磷酸钾缓冲液，获得0.01M磷酸钾缓冲液，pH7.0。缓冲液通过在121℃下高压处理进行灭菌六十(60)分钟。

枯草芽孢杆菌孢子悬浮液在0.01M磷酸钾缓冲液，pH 7.0中以1.7x10⁸cfu/ml的浓度制备，在预热的37℃水浴中孵育并在45分钟时间内以5分钟间隔评估百分萌发率。

表2

结论：GOSD处理显著地提高枯草芽孢杆菌孢子的百分萌发率和萌发速度。

实施例3：用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的萌发增加

如实施例1中所述，地衣芽孢杆菌孢子在0.044克L-丙氨酸/mL蒸馏水存在下通过对孢子喷雾干燥而用GOSD进行处理。萌发水平使用用于孢子悬浮液制备的0.01M磷酸钾缓冲液，pH 7.0如上所述通过光密度(OD)读数测定。

地衣芽孢杆菌孢子悬浮液在0.01M磷酸钾缓冲液，pH 7.0中以1.29x10⁸cfu/ml的浓度制备，在预热的37℃水浴中孵育并在四十五(45)分钟时间内以五(5)分钟的间隔评估百分萌发率。

表3

结论：GOSD处理显著提高地衣芽孢杆菌孢子的百分萌发率和萌发速度。

实施例4：用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV923在各种pH水平下的萌发增加

枯草芽孢杆菌菌株ENV923 GO+和GO-孢子如上所述制备并重悬浮在各种pH水平的0.01M磷酸钾缓冲液中。如上所述进行OD₆₀₀测量。

pH 3.0-7.0下的0.01M磷酸钾缓冲液

0.01M磷酸钾缓冲液，pH 7.0缓冲液如实施例1中所述制备。

·为制备pH范围3.0-6.0的0.01M磷酸钾缓冲液，基础缓冲液使用通过混合13.2ml的1M K₂HPO₄和86.8ml的1M KH₂PO₄溶液(实施例1中所述)和用蒸馏水使体积达到1L制备的0.1M磷酸钾缓冲液，pH 6.0。

·为获得pH 5.0-pH 3.0的0.01M磷酸钾缓冲液，0.1M磷酸钾缓冲液，pH 6.0用蒸馏水稀释，缓冲液的pH使用1M H₂PO₄降低到pH 5.0、pH 4.0和pH 3.0并且最终体积用蒸馏水达到，保持0.1M缓冲液与蒸馏水的比率1:10。

制备的缓冲液储存在4℃下，且在各实验前，缓冲液的pH使用1M NaOH或1M H₂PO₄重新调节。

表4各种pH水平下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的萌发结果，表格中显示了以5分钟间隔测量的百分萌发率

/>

结论：GOSD的处理使得枯草芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服较低pH水平的影响。

实施例5：用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV923的萌发增加。各种温度水平影响的孢子萌发反应，表格中显示以10分钟间隔测量的百分萌发率。

枯草芽孢杆菌菌株ENV 923GOSD和对照孢子如上所述制备。孢子的萌发如上所述通过光密度(OD)测量进行测试。制备用于OD₆₀₀测量的孢子悬浮液并在0.01M磷酸钾缓冲液，pH 7.0(磷酸盐缓冲液，pH 7.0制剂)中以1.7x10⁸cfu/ml的浓度冷却到4℃。对于各孢子缓冲液，制备填充到3ml体积的3个培养管。在搅拌和初始OD₆₀₀测量后，管在预热到25℃、30℃和37℃的水浴中孵育120min。以10min的间隔搅拌管并进行OD₆₀₀测量。

表5.GO-和GO+的枯草芽孢杆菌在37℃、30℃和25℃下的百分萌发率

结论：用GOSD处理(GO+)使得枯草芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服低温方案的影响。

实施例6：在不同摩尔的NaCl溶液存在下具有或不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率

培养基：

培养基是稀胰蛋白酶大豆液体培养基(mTSB)(BD,211822)。培养基通过在加热和搅拌条件下在1L水中悬浮50mg的胰蛋白酶大豆液体培养基粉末直到完全溶解而制备。然后等分到瓶中并在121℃下高压处理30分钟。基于制造商报告的粉末含量，mTSB培养基每升包含：

酪蛋白的胰消化物：28.3mg

大豆的木瓜蛋白酶(Papic)消化物：5.0mg

右旋糖：4.2mg

氯化钠：8.3mg

磷酸氢二钾：4.2mg

在培养基加热和高压处理之前，在适宜情况下添加氯化钠(Amresco X190)以诱导渗透压力，以使得最终浓度为0.5M或1.5M(分别为29.22g/L和87.66g/L)。

孢子悬浮液：

用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％ Octosol SLS(FT-SLS-246DRUM,Tiarco Chemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒的时间或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是1x10¹⁰ cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75ml mTSB的管中以给出5x10⁸ cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。

OD萌发分析：

含有悬浮的孢子的管立即涡旋，对于零时间点在OD600下测量并在37℃水浴中孵育。以相应的时间间隔，记录时间、移除管、涡旋、以OD600测量并返回到水浴中。OD600的降低百分比通过从零时间点值减去测量的值，除以零时间点值并乘以100％确定。完全萌发先前证明为对应于60％的OD600降低百分比。因此，萌发百分率通过将OD600降低百分比乘以1.67测定。

表6.在0、0.5摩尔和1.5摩尔的NaCl溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的％萌发

结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服不同盐(NaCl)水平的渗透压力影响。

实施例7：在不同ppm的铜溶液存在下具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率。

培养基：

mTSB培养基如上制备，但补充NaCl到50mM的最终浓度以产生渗透压平衡的培养基。1x10⁵ ppm硝酸铜(II)半(五水合物)(Alfa Aesar12523)原液通过将2g量悬浮到20ml水中并进行0.22μm过滤来制备。将其添加到mTSB等份中以获得0、50、100和200ppm最终浓度。

孢子悬浮液：

用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％ Octosol SLS(FT-SLS-246DRUM,Tiarco Chemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是2x10⁹ cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75ml mTSB的管中以给出1x10⁸ cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。

OD萌发分析：

如实施例6中所示进行和计算。

表7.在0、50ppm、100ppm和200ppm的铜离子溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的百分萌发率

结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服各种水平的铜离子的胁迫效应。

实施例8：在不同ppm的铝溶液存在下具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率。

培养基：

mTSB培养基如上制备，但补充NaCl到50mM的最终浓度以产生渗透压平衡的培养基。1000ppm Al³⁺原液通过将0.62g的Al₂(SO₄)₃*14H₂O(Alfa Aesar 12362)悬浮到50ml水中并进行0.22μm过滤来制备。将其添加到mTSB等份中以获得0、0.25、0.50和1.0ppm最终浓度。然后培养基的pH通过添加HCl使其下降到pH 4.5以允许Al³⁺离子完全分离。

孢子悬浮液：

用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％ Octosol SLS(FT-SLS-246DRUM,Tiarco Chemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是1x10¹⁰ cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75ml mTSB的管中以给出5x10⁸ cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。

OD萌发分析：

如实施例6中进行和计算。

表8.在0、0.25ppm、0.50ppm和1.0ppm的铝离子溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的百分萌发率

结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服各种铝离子水平的胁迫效应。

实施例9：在不同毫摩尔的胆汁盐溶液存在下具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的百分萌发率

培养基：

mTSB培养基如上制备，但补充NaCl到50mM的最终浓度以产生渗透压平衡的培养基。80mM胆汁盐原液通过将2.5g牛磺脱氧胆酸钠(Sigma T0875)、1.1g甘氨脱氧胆酸钠(Sigma G9910)和0.346g脱氧胆酸钠(Sigma D5670)悬浮到100ml水中并进行0.22μm过滤来制备。将其添加到mTSB等份中以获得0、4、6和8mM最终浓度。

孢子悬浮液：

用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％ Octosol SLS(FT-SLS-246DRUM,Tiarco Chemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮而进行悬浮。进行这一操作以使得共混罐中的最终浓度是1x10¹⁰ cfu/ml。从这一孢子悬浮液，250μl转移到含有4.75ml mTSB的管中以给出5x10⁸ cfu/ml的最终浓度。这些浓度通过对各批孢子进行优化以获得大约0.6的起始OD600而测定。

OD萌发分析：

如上进行和计算。

表9.在0、4mM、6mM和8mM ppm的胆汁盐溶液存在下具有GOSD(GO+)和不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌孢子在一个小时内的百分萌发率

结论：GOSD的处理使得地衣芽孢杆菌孢子能够更快地萌发并克服可能在胃肠道中遇到的各种胆汁盐水平的胁迫效应。

实施例10：在限定磷酸钾培养基和2％葡萄糖中具有和不具有GOSD的地衣芽孢杆菌的三次重复的平均生长

地衣芽孢杆菌菌株ENV 431GO+孢子用GOSD处理(过程如之前描述)。作为对照使用在未用GOSD的情况下喷雾干燥的来自相同培养物的GO-孢子。在补充有2％葡萄糖的最低盐培养基中进行生长测试。

培养基

培养基通过在蒸馏水中溶解(NH₄)₂SO₄(1.26g/L)、MgCl₂(0.81g/L)、CaCl₂(0.15g/L)、NaCl(0.05g/L)并添加1ml/L 1000×微量矿物质混合物(MnSO₄(0.85g/50ml)、ZnSO₄(0.15g/50ml)、FeSO₄×7H₂O(0.15g/50ml)、硫胺素盐酸盐(0.05g/50ml))制备。制备的溶液倾倒到烧瓶中(90ml/烧瓶)并在121℃下高压处理40min。在接种前，培养基补充4ml过滤除菌的25×磷酸钾(K₂HPO₄(3.44g/50ml)、KH₂PO₄(2.81g/50ml))溶液和2ml 50×(100g/200ml)葡萄糖溶液达到2％最终浓度。

地衣芽孢杆菌细胞的生长

用于接种的孢子量使用GO-和GO+孢子粉末计数测定。浓缩的(1000×)地衣芽孢杆菌菌株ENV 431孢子悬浮液通过用无菌水在无菌共混罐中共混孢子制备，并添加到具有培养基的烧瓶中达到下表中作为0h指示的浓度。初始培养物的计数通过进行共混孢子悬浮液的稀释和平板计数获得。对于各孢子样品准备3个烧瓶。

烧瓶在30℃、150rpm下接种，并生长48h。在24h和48h时获取样品并进行平板计数。

表10.最低磷酸钾培养基和2％葡萄糖中具有GOSD(GO+)或不具有GOSD(GO-)的地衣芽孢杆菌的三次重复的平均生长。显示的数据是以cfu/ml计。

	0小时	24小时	48小时
				地衣芽孢杆菌GO-	1.88x103	2.20x104	9.4x104
地衣芽孢杆菌GO+	1.46x103	7.95x104	3.65x105

结论：GOSD处理显著地提高地衣芽孢杆菌萌发率和生长率。

实施例11：地衣芽孢杆菌在两天时间内的生长；比较在不同浓度NaCl存在下具有或不具有GOSD的处理

培养基：

mTSB如上制备，但在适宜情况下添加氯化钠(Amresco X190)以使得最终浓度为0、0.5、1.0或1.5M(分别0、29.22、58.44或87.66g/L)而诱导渗透压力。培养基加热，等分到烧瓶中并高压处理。

平板计数琼脂(PCA)(BD 247910)按照制造商的指示制备：23.5g粉末悬浮在1L水中，伴随频繁搅拌使其沸腾，等分到玻璃缸中并高压处理。培养基缸在45℃水浴中冷却直到需要使用。粉末的制造商对于每升PCA报告以下含量：

酪蛋白的胰消化物：5.0g

酵母提取物：2.5g

右旋糖：1.0g

琼脂：15.0g

孢子悬浮液：

用或未用GOSD处理的地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉末悬浮在无菌共混罐内的具有0.1％ Octosol SLS(FT-SLS-246DRUM,Tiarco Chemical,Dalton,GA)的无菌水中。孢子通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直到孢子视觉上完全悬浮，随后在无菌水中系列稀释而进行悬浮。进行这一操作以使得培养瓶中的最终浓度是1x10²cfu/ml。

定量：

烧瓶在37℃下以150rpm振荡孵育28小时(“1天”)或50小时(“2天”)。来自各***等份试样系列地稀释到具有倾倒于其上冷却到<45℃的PCA的皮氏皿中，打旋并使其固化。平板倒置并在37℃下孵育大约24小时。计数集落并基于稀释计算浓度。来自各***大约10μl样品也在PCA平板上划线以测试纯度。

表11.在通过盐溶液的渗透压力激发时用GOSD处理的地衣芽孢杆菌(GO+)的生长

结论：GOSD处理显著增加渗透盐压力下地衣芽孢杆菌的萌发和生长。

实施例12：枯草芽孢杆菌菌株ENV 923的蛋白酶活性

如之前所述用GOSD处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV 923孢子(GO+)及未处理的枯草芽孢杆菌菌株ENV 923孢子(GO-)用于蛋白酶活性测试。

培养基

化学限定盐培养基(CDSM)用于在蛋白酶测试中进行细胞增殖。培养基通过在蒸馏水中溶解基础溶液组分(g/L)：(NH₄)SO₄，1.26g；L-谷氨酸，1.18g；MgCl₂，0.81；CaCl₂，0.155和85％ L-乳酸(0.530ml/L)，并添加1ml/L的1000×微量矿物质混合物(g/50ml)制备。具有基础溶液的烧瓶(48ml/烧瓶)高压处理40min。在接种前，添加2ml单独制备的具有葡萄糖(g/50ml)的过滤除菌的25×缓冲溶液：MOPS,11.6；KH₂PO₄,0.6；葡萄糖,4.5。

枯草芽孢杆菌ENV923细胞的生长

用于接种的孢子量使用GO-和GO+孢子粉末计数确定。浓缩的(1000×)枯草芽孢杆菌菌株ENV923孢子悬浮液通过在无菌混合罐中使用无菌的0.01M磷酸钾缓冲液，pH 7.0共混孢子制备，并以约1x10⁴cfu/ml的浓度添加到烧瓶中。初始培养物的计数通过进行共混孢子悬浮液的稀释和平板计数确认。对于各孢子样品制备3个烧瓶。

烧瓶在30℃下以150rpm孵育，且样品在48h时获取。

蛋白酶活性分析

蛋白酶活性分析使用酪蛋白作为底物和与酪氨酸反应并帮助蓝色显色的Folin&Ciocalateu’s酚试剂对细胞上清液进行。蛋白酶活性单位定义为在一分钟内释放1μg的酪氨酸的酶量。试管中酪氨酸的量通过在Jenway 7305分光光度计中测量OD₆₅₀并使用标准曲线计算释放的酪氨酸来测定。

试剂

试剂1：0.05M磷酸钾缓冲液，pH 7.0

0.1M磷酸钾缓冲液，pH 7.0(如实施例1中所述制备)用蒸馏水以1:1的比率稀释以获得0.05M磷酸钾缓冲液，pH 7.0

试剂2：0.65％酪蛋白溶液

0.65g酪蛋白溶解在80ml的0.05M磷酸钾缓冲液，pH 7.0中，加热以使得酪蛋白溶解到溶液中，并用0.05M磷酸钾缓冲液，pH 7.0使终体积达到100ml。

试剂3：15％三氯乙酸(TCA)

15g的TCA溶解在蒸馏水中并使终体积达到100ml。

试剂4：20％ Na₂CO₃

20g的Na₂CO₃溶解在蒸馏水中并使终体积达到100ml。

蛋白酶分析

·10ml培养物离心且上清液通过0.2μm过滤器过滤到无菌管中。

·3ml过滤的上清液与3ml的0.65％酪蛋白溶液混合并置于37℃水浴中1h。

·反应通过添加6ml的15％ TCA停止且样品离心5min。

·0.5ml各样品与1ml的20％ Na₂CO₃混合，接着添加0.5ml的Folin&Ciolcallieu’s酚试剂并在室温下孵育20min以允许蓝色显色。

·3ml蒸馏水添加到各样品中并在混合后测量OD₆₅₀。

·为计算蛋白酶活性，酪氨酸的标准曲线通过获得酪氨酸溶解在蒸馏水中的系列稀释、用与培养物样品相同的条件进行处理和测量OD₆₅₀来制备。

表12.用GOSD处理的枯草芽孢杆菌(GO+)相对于对照(GO-)的蛋白酶产生

结论：枯草芽孢杆菌孢子用GOSD处理使得能够产生更多的酶如蛋白酶。

实施例13：绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)在萌发化合物存在下的萌发

绿色产色链霉菌孢子通过倾倒10ml的TX缓冲液(0.05MTris-HCl缓冲液，pH 7.3，具有0.001％ Tween 80)和用无菌棉花拭子除去孢子而从平板收获。来自平板的孢子悬浮液倾倒到无菌的50ml管中。当获得所有样品的孢子悬浮液时，通过将具有孢子悬浮液的管放置在加热模块中而使得温度达到55℃进行热休克，且将温度保持在55℃ 10min。在热休克后，孢子悬浮液在冰水中冷却5min并旋转30min。倒掉上清液，孢子在4℃下重悬在25ml0.02M磷酸钾缓冲液，pH 7.0中并旋转15min。在倒掉上清液后，孢子重悬在20ml的0.02M磷酸钾缓冲液，pH 7.0中并剧烈混合以获得实验中使用的孢子悬浮液。

样品通过混合1.5ml的2×萌发剂共混物与1.5ml孢子悬浮液制备。所有萌发剂共混物在蒸馏水中制备为2×50ml溶液。氯化钙制备为100X溶液(0.4g/10ml)且20μl添加到10ml的2X萌发剂共混物中。萌发化合物的最终浓度如下：0.89mg/ml的L-丙氨酸；1.17mg/ml的L-缬氨酸，13.2mg/ml的L-天冬酰胺；2.25mg/ml的葡萄糖；和2.25mg/ml的果糖。在测量初始OD600后，样品转移到30℃水浴中且OD600在90min内以15min间隔测量以测定萌发率。

表13.ENV 151(绿色产色链霉菌)光密度的％降低

结论：绿色产色链霉菌孢子用萌发化合物增强萌发。

实施例14：细菌孢子和萌发化合物的紧密混合物与常规混合之间萌发率的比较

为了比较紧密混合物的孢子的萌发率和与萌发剂常规混合的孢子的萌发率，进行以下处理：

A.紧密混合物的形成：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、穿刺巴斯德芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae、绿色产色链霉菌、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)、仙台链霉菌(Streptomyces sindeneusis)、娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)、Streptomyces alni、绿色链霉菌(Streptomyces viridis)、热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、酸性疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)、金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)和金色链霉菌的孢子紧接在干燥之前与作为包含0.044克氨基酸/毫升蒸馏水的溶液引入孢子块中的L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺或L-苯丙氨酸一起干燥。产生的紧密混合物随后通过引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH 7的溶液中而萌发。

B.孢子与萌发剂的常规混合：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、穿刺巴斯德芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae、绿色产色链霉菌、灰绿链霉菌、利迪链霉菌、褶皱链霉菌、仙台链霉菌、娄彻氏链霉菌、Streptomyces alni、绿色链霉菌、热普通链霉菌、灰色链霉菌、酸性疮痂链霉菌、金色链霉菌、鲜黄链霉菌、细黄链霉菌和金色链霉菌的孢子水化和干燥。这类孢子通过引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液而得到pH 7及0.0001克L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺或L-苯丙氨酸/毫升溶液组成的溶液中而萌发。

C.单独孢子的萌发：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、多粘芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、穿刺巴斯德芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae、绿色产色链霉菌、灰绿链霉菌、利迪链霉菌、褶皱链霉菌、仙台链霉菌、娄彻氏链霉菌、Streptomyces alni、绿色链霉菌、热普通链霉菌、灰色链霉菌、酸性疮痂链霉菌、金色链霉菌、鲜黄链霉菌、细黄链霉菌和金色链霉菌的孢子被水化和干燥。孢子随后通过引入由蒸馏水中0.01M磷酸盐缓冲液组成而得到pH 7的溶液中而萌发。

由这样的处理各自得到的孢子的萌发通过光密度的百分下降或通过在显微镜下计数萌发孢子的数目测量。发现紧密混合的组合物比其相应的常规混合的等同物更快地萌发。

实施例15：用地衣芽孢杆菌孢子萌发化合物混合物处理玉米叶、胡萝卜根和马铃薯块茎

为了制备地衣芽孢杆菌孢子萌发化合物混合物，将0.044g L-丙氨酸/ml蒸馏水的溶液引入地衣芽孢杆菌孢子块中，并且将混合物立即喷雾干燥。所得到的含有芽孢杆菌孢子和L-丙氨酸的紧密混合物的喷雾干燥粉末在以下处理中称为“GO+”。还将没有添加L-丙氨酸的芽孢杆菌孢子喷雾干燥用作对照。将没有添加L-丙氨酸的喷雾干燥的芽孢杆菌孢子在以下处理中描述为“GO-”。

在悬浮喷雾干燥的地衣芽孢杆菌孢子前，测定GO+和GO-制剂的细菌计数以如以下表14中针对所示的孢子浓度的差异进行调整。

表14.地衣芽孢杆菌孢子的喷雾干燥GO+和GO-制剂中的细菌计数

将喷雾干燥的孢子悬浮于pH7.0的0.01M磷酸钾缓冲液中，其在加入孢子前已经冷却至4℃。如表14中所示，将GO+和GO-喷雾干燥制剂分别以0.018g/ml和0.009g/ml的浓度加入缓冲液中以针对每个制剂中的孢子浓度的差异进行调整。

玉米(Zea mays)叶获自在田间生长的植物。将每片叶子切成大约2.5cm片段。将胡萝卜(Daucus carota)根和马铃薯(Solanum tuberosum)块茎切成节段，保留外皮。将植物样品放置在皮氏培养皿中的湿滤纸上，每个皮氏培养皿一个植物样品。将大约150μl孢子悬浮液添加到每个植物样品。对于胡萝卜和马铃薯样品，将孢子悬浮液施用于皮表面，即，根或块茎的外表面。覆盖包含植物样品的皮氏培养皿并在37℃下孵育。对于0min的样品，细胞计数获自孢子悬浮液的管。随后，在每个时间点(15min、30min和60min)从处理的叶片段获取样品并在相衬显微镜下观察。通过拍取一些观察视野的照片并计数暗和亮的细胞来获得相亮和相暗孢子数。基于相衬显微镜下的相亮(未萌发)和相暗(萌发)孢子的数量来确定孢子萌发水平。

如以下表15中所示，用含有L-丙氨酸的制剂(GO+)处理的玉米叶上的萌发孢子百分比比不含L-丙氨酸的制剂(GO-)高得多。例如，在30min内94％的GO+孢子萌发，而低于20％的GO-孢子甚至在60min后才萌发。对于胡萝卜根(表16)和马铃薯块茎(表17)观察到了相似结果。这些结果表明将L-丙氨酸加入喷雾干燥的制剂中导致植物表面上孢子的更快萌发。

表15.玉米叶上具有L-丙氨酸(GO+)或不具有L-丙氨酸(GO-)的地衣芽孢杆菌的萌发。“Rep”是重复，“Avg”是平均。

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表16.胡萝卜根上具有L-丙氨酸(GO+)或不具有L-丙氨酸(GO-)的地衣芽孢杆菌的萌发。“Rep”是重复，“Avg”是平均。

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表17.马铃薯块茎上具有L-丙氨酸(GO+)或不具有L-丙氨酸(GO-)的地衣芽孢杆菌的萌发。“Rep”是重复，“Avg”是平均。

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实施例16：用包含细菌孢子和萌发化合物的组合物涂覆的玉米种子的萌发、植物生长和产量的评价

用实施例14中所列的包含细菌孢子和萌发化合物的各种组合的组合物涂覆玉米种子。通过常规方式，如美国专利No.7,989,391和美国专利No.5,849,320中所述的那些，来进行种子涂覆。评价了以下处理：

A.用细菌孢子和萌发化合物的紧密组合物涂覆的种子

B.用细菌孢子和萌发化合物的常规混合物涂覆的种子

C.用单独的细菌孢子涂覆的种子

D.未涂覆的种子

在植物出芽的第一天开始并在出芽第一天后持续三周，通过每天测量出苗率来测量温室和田间试验中的种子萌发率。通过采收成熟穗并将其在37℃烤箱中干燥三天来测量产量。然后将穗脱粒并且收集种子和计数。还通过将从每株植物采收的种子称重来测量总的种子重量。

实施例17：芽孢杆菌益生剂在巨型艾美球虫(Eimeria maxima)和产气荚膜梭菌感染的鸡中的作用

在Cobb 500小鸡(家鸡(Gallus gallus domesticus))上进行28-天笼养测试(battery test)来测定含有芽孢杆菌益生菌剂的补充饲料或标准抗生素处理(杆菌肽)对感染了巨型艾美球虫(家禽中球虫病的致病剂)和产气荚膜梭菌(坏死性肠炎的致病剂)的鸡的作用。芽孢杆菌益生剂含有等比例的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。通过将芽孢杆菌物种的孢子和L-丙氨酸喷雾干燥来制备GO+芽孢杆菌益生剂。如上所述紧接在喷雾干燥前作为含有0.044克丙氨酸/毫升蒸馏水的溶液将L-丙氨酸引入孢子块中。如上所述，通过将没有添加L-丙氨酸的芽孢杆菌物种的孢子喷雾干燥来形成GO-芽孢杆菌益生剂。研究对每个处理组包括八个重复的笼子，每个笼子八只小鸡(每个处理组64只)。评价了以下处理组。处理组2-5感染了巨型艾美球虫和产气荚膜梭菌(感染的)。处理组1没有感染巨型艾美球虫或产气荚膜梭菌来用作未受感染的阴性对照。

1)无饲料添加剂，无感染(未受感染的阴性对照)

2)无饲料添加剂，感染的(感染的阴性对照)

3)GO-芽孢杆菌益生剂，2×10⁶cfu/g饲料，感染的

4)GO+芽孢杆菌益生剂，2×10⁶cfu/g饲料，感染的

5)抗生素杆菌肽，50g/吨饲料，感染的(阳性对照)

在第0天开始给鸡饲喂处理或未处理的饲料。在第14天时，用巨型艾美球虫感染接着用产气荚膜梭菌(坏死性肠炎的致病剂)施加于处理组2-5中的鸡。在第28天评价鸡的饲料转化率、体重增长、病变评分和死亡百分比。饲料转化计算为从第0天至第28天产生1kg体重需要的食物kg数的比率。例如，1.6的饲料转化率表示需要1.6kg食物来产生1kg体重。体重增加计算为从第0天至第28天的体重增加。病变评分是基于病变的视觉观察，0为正常，且3为最严重。GO-和GO+芽孢杆菌益生剂都比受感染的阴性对照(处理组2)降低了死亡百分比。参见表18。与用杆菌肽处理的那些相比，用GO+益生剂处理的小鸡中的死亡百分比更低，但差异不是统计学显著的。GO+益生剂和抗生素处理组的体重增加呈现出高于感染的阴性对照的显著增加。这些结果表明具有GO+益生剂的鸡饲料的处理在病原体挑战过程中与标准抗生素处理相比获得了相同或更好的结果。

表18.感染巨型艾美球虫和产气荚膜梭菌(处理组2-5)的鸡中或未感染的阴性对照(处理组1)中的饲料转化率、体重增加、病变评分和死亡百分比。处理组如上所述。数值后的字母表示处理组间的统计学显著差异。

	饲料转化率	体重增加(kg)	病变评分(0-3)	死亡率(％)
					处理组	第0-28天	第0-28天
1	1.600bc	0.805a	0.0c	0.0b
					2	1.913a	0.696c	0.8a	14.1a
3	1.707b	0.726bc	0.2c	3.1b
					4	1.691bc	0.755ab	0.5b	1.6b
5	1.585c	0.811a	0.5b	3.1b

实施例18：益生剂对感染弧菌属的种的蛤蜊的作用

通过分离和定量孵化所的细菌载量，评价了正经历幼虫死亡事件的佛罗里达双壳类孵化所的死亡的诱因。确定弧菌物种占到水源中100％的好氧菌计数(4×10⁴cfu/ml)，和孵化所中大约50％的好氧菌计数(2×10⁴cfu/ml)。在这个大的弧菌群中，发现了在不同培养基上两种主要的菌落形态并送去鉴定。观察到的两种主要的弧菌菌株为Vibriochagasii和溶珊瑚弧菌，其中后者显示为对双壳类是剧毒的。

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的单个菌株对弧菌生长的排除区的测量和生物膜形成的限制表明，这些芽孢杆菌菌株发现具有中等至良好的对抗大部分测试的弧菌菌株的活性。这些结果表明芽孢杆菌菌株在生物膜形成中胜过从孵化所分离的弧菌物种的菌株，并且具有对弧菌生物膜的直接作用。

用含有等比例的两个地衣芽孢杆菌菌株、一个枯草芽孢杆菌菌株和一个短小芽孢杆菌菌株的4菌株益生菌共混物处理感染弧菌菌株的蛤蜊幼虫槽。如上所述，作为GO+(具有L-丙氨酸)或GO-(不具有L-丙氨酸)，通过喷雾干燥来配制芽孢杆菌菌株。通过将喷雾干燥的制剂悬浮于1升水中且然后在每日换水后以5×10⁵cfu/ml的剂量将悬浮液立即加入槽中将益生剂加入槽中。在处理阶段开始时和每日处理开始后12天，将蛤蜊幼虫在不同尺寸的筛网过滤器(150、200、250或300μm)上过筛。在第12天，相对于起始的幼虫数，记录每个筛网尺寸上发现的活蛤蜊幼虫的数量。参见表19。在蛤蜊死亡事件的过程中，未处理的槽只具有～10％存活率，而GO-处理的槽具有～20％存活率，和GO+处理的槽具有～40％存活率。另外，益生剂处理提高了生长速率(在较大的筛网上收集到更多幼虫)，GO+处理的槽生长最快。

表19.用益生剂处理12天后各种不同大小的蛤蜊幼虫的百分存活率。蛤蜊幼虫槽感染了弧菌菌株。

实施例19：在含有胆汁盐的鸡饲料提取物中在评价地衣芽孢杆菌制剂的密闭***中测定生物需氧量(BOD)

在补充了胆汁盐的鸡饲料提取物中测量地衣芽孢杆菌的细菌需氧量(BOD)，从而测定细菌在胆汁盐胁迫下生长的能力。将鸡饲料作为能源结合4mM胆汁盐(60％牛黄脱氧胆酸盐、30％甘氨脱氧胆酸盐，10％脱氧胆酸盐)使用。

培养基：补充了胆汁盐的鸡饲料提取物的制备

将42.44g鸡饲料(Chick Starter Grower)称重至烧杯中并且随后使用咖啡研磨机磨成粉。用温的自来水使体积达到总共1升，并且将混合物在搅拌板上混合60分钟。将100ml溶液分配至250mL有挡板的摇瓶中，包括2个“预备测试烧瓶”，并高压灭菌。

胆汁盐原液(BSSS)：

1.1.8g牛黄脱氧胆酸盐

2.0.9g甘氨脱氧胆酸盐

3.0.3g脱氧胆酸盐。

将每种组分单独地与少量自来水混合直至刚好溶解，并且随后将溶液混合在一起，使体积为30mL，并且无菌过滤。

制备0.1N的HCl溶液并加入上述预备测试烧瓶中以将pH降至2.25。记录用于降低pH的HCl的体积。恰好90分钟后，记录pH(在这个时间过程中pH升高)。将1.6ml BSSS加入每个烧瓶中。15分钟后，使用1.0M NaOH将pH提高至7.5。记录所用的NaOH的体积。15分钟后，记录pH(在这个时间跨度中，pH下降)。将结果平均，并且将该量用于处理剩余的含有鸡饲料提取物的烧瓶。

孢子悬浮液：

将地衣芽孢杆菌菌株ENV100的孢子粉制成GO+(如上所述，与L-丙氨酸一起喷雾干燥)或GO-(如上所述，在没有L-丙氨酸的情况下喷雾干燥)制剂。在无菌混合器罐内于具有0.1％ Octosol SLS(FT-SLS-246DRUM，Tiarco Chemical，Dalton，GA)的无菌水中将制剂悬浮。通过以5秒间隔共混总共至少15秒或直至看到孢子完全悬浮来悬浮孢子，接着在无菌水中连续稀释。进行这一操作使得BOD瓶中的终浓度为5×10⁷cfu/ml或5×10³cfu/ml。

BOD试验：

根据制造商的说明，在BODTRAKII仪器(Hach 2952450)上测量生物需氧量(BOD)。将2ml上述制备的含有胆汁盐的鸡饲料提取物加入BOD瓶中的98ml水中，高压灭菌，并使其冷却至室温。接种前，将BODTRAKII仪器和瓶子在37℃下预温育。如上所述对瓶子接种，并且根据制造商的说明立即封闭，并且在37℃下孵育。完成分析后，从仪器下载数据，并且将大约10μl培养物划线至PCA平板以测试纯度。

如表20中所示，地衣芽孢杆菌孢子的GO+制剂使得能够在胆汁盐胁迫条件下生长并且与对照处理相比导致提高的代谢(如通过生物需氧量测量的)。这些数据证明了GO+制剂提高了胆汁胁迫条件下的地衣芽孢杆菌生长。

表20.含有鸡饲料提取物和胆汁盐的地衣芽孢杆菌培养物中表示为氧利用量(mg/L)的生物需氧量(BOD)测量

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Claims (73)

1.一种涂覆有组合物的植物或植物部分，所述组合物包含：

a)细菌孢子；和

b)萌发化合物。

2.权利要求1的植物或植物部分，其中所述孢子和所述萌发化合物保持在无活性形式，使得所述萌发化合物不会诱导所述孢子的萌发直至所述组合物经历活化环境。

3.权利要求1的植物或植物部分，其中所述组合物进一步包含阻止所述细菌孢子和所述萌发化合物相互作用直至所述组合物经历活化环境的物质。

4.权利要求3的植物或植物部分，其中所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。

5.权利要求1的植物或植物部分，其中所述组合物包含所述细菌孢子和所述萌发化合物的紧密混合物，其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。

6.权利要求1的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分选自花、种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、芽、苗、种子、叶、秧苗和移植物。

7.权利要求1的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是种子。

8.权利要求1的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分在萌发后或从土壤出芽后用所述组合物涂覆。

9.权利要求1的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分在萌发前或从土壤出芽前用所述组合物涂覆。

10.权利要求1的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是植物繁殖材料。

11.权利要求1的植物或植物部分，其中所述细菌孢子选自土壤芽孢杆菌(Bacillusagri)、Bacillus aizawai、白色芽孢杆菌(Bacillus albolactis)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、食丁酸芽孢杆菌(Bacillus butanolivorans)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、Bacillus kurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌(Bacillus lactimorbus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、水母芽孢杆菌(Bacillusmedusa)、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popillae)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、丙酮丁酸梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)、多刺巴斯德氏芽菌(Pasteuriathornei)、Pasteuria nishizawae和链霉菌属(Streptomyces)的种。

12.权利要求1的植物或植物部分，其中所述萌发化合物选自果糖、葡萄糖、钾、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。

13.权利要求1的植物或植物部分，其中所述细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；以及所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。

14.权利要求7的植物或植物部分，其中所述组合物进一步包含种子涂层聚合物。

15.权利要求1的植物或植物部分，其中所述组合物进一步包含选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂的物质。

16.一种增强植物或植物部分中的产量相关性状的方法，包括用组合物处理所述植物或植物部分，所述组合物包含：

a)细菌孢子；和

b)萌发化合物，

其中所述植物或植物部分的产量相关性状相对于没有涂覆所述组合物的相应植物或植物部分的该产量相关性状得到增强。

17.权利要求16的方法，其中所述孢子和所述萌发化合物保持在无活性形式，使得所述萌发化合物不会诱导所述孢子的萌发直至所述组合物经历活化环境。

18.权利要求16的方法，其中所述组合物进一步包含阻止所述细菌孢子和所述萌发化合物相互作用直至所述组合物经历活化环境的物质。

19.权利要求18的方法，其中所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。

20.权利要求16的方法，其中所述组合物包含所述细菌孢子和所述萌发化合物的紧密混合物，其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。

21.权利要求16的方法，其中所述植物或植物部分是植物繁殖材料。

22.权利要求16的方法，其中所述植物或植物部分是种子。

23.权利要求16的方法，其中所述植物或植物部分选自花、种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、芽、苗、种子、叶、秧苗和移植物。

24.权利要求16的方法，包括在萌发后或从土壤出芽后用所述组合物处理所述植物或植物部分。

25.权利要求16的方法，包括在萌发前或从土壤出芽前用所述组合物处理所述植物或植物部分。

26.权利要求16的方法，其中所述细菌孢子选自土壤芽孢杆菌、Bacillus aizawai、白色芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、Bacillus endoparasiticus、Bacillus endorhythmos、坚强芽孢杆菌、Bacilluskurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillus nigrificans、日本甲虫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌、扬氏梭菌、丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae和链霉菌属的种。

27.权利要求16的方法，其中所述萌发化合物选自果糖、葡萄糖、钾、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。

28.权利要求16的方法，其中所述细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；以及所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。

29.权利要求22的方法，其中所述组合物进一步包含种子涂层聚合物。

30.权利要求16的方法，其中所述组合物进一步包含选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂中的一种或多种。

31.一种用于处理废水的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物加入废水中。

32.一种用于环境治理的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于土壤或水中。

33.一种用于处理水产养殖***中的水的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物接触水产养殖***中的水。

34.权利要求33的方法，其中所述水产养殖***包括动物。

35.一种用于饲喂水产养殖***中的动物的方法，包括将包含组合物的动物饲料给予所述水产养殖***中的动物，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。

36.权利要求34或35的方法，其中所述动物选自鱼、虾或软体动物。

37.权利要求33-36任一项的方法，其中所述水产养殖***包括选自弧菌属(Vibrio)的种、气单胞菌属(Aerononas)的种和黄杆菌属(Flavobacterium)的种的病原体。

38.权利要求33-37任一项的方法，其中相对于没有用所述组合物处理的水产养殖***中的动物，所述动物的生长得到了提高。

39.权利要求33-38任一项的方法，其中所述组合物是颗粒、压块、丸状、药片或胶囊的形式。

40.一种包含组合物和可接受载体的益生剂，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。

41.权利要求40的益生剂，其中所述可接受载体选自动物饲料、奶、酸奶、奶酪、发酵奶、谷物、发酵谷物、汁液、冰激凌或用于婴儿或儿童的配方食品。

42.一种制备益生剂的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物与可接受载体混合。

43.权利要求42的方法，其中所述可接受载体选自动物饲料、奶、酸奶、奶酪、发酵奶、谷物、发酵谷物、汁液、冰激凌或用于婴儿或儿童的配方食品。

44.一种用于饲喂动物的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物给予动物。

45.权利要求44的方法，其中所述动物选自家禽、反刍动物、牛、猪、兔子、马、甲壳类、软体动物、鱼和宠物。

46.一种包含组合物和可接受载体的直接饲喂微生物，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。

47.权利要求46的直接饲喂微生物，其中所述载体选自动物饲料、代乳品、乳清、植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酸酯80、丙二醇、丁羟基茴香醚、柠檬酸、乙氧喹、石灰石、稻壳、酵母培养物、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉和铝硅酸钠。

48.一种制备直接饲喂微生物的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物与可接受载体混合。

49.权利要求48的方法，其中所述载体选自动物饲料、代乳品、乳清、植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酸酯80、丙二醇、丁羟基茴香醚、柠檬酸、乙氧喹、石灰石、稻壳、酵母培养物、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉和铝硅酸钠。

50.一种包含组合物和可接受载体的清洁产品，所述组合物包含细菌孢子和萌发化合物。

51.权利要求50的清洁产品，其中所述可接受载体选自去污剂、肥皂和香精。

52.一种制备清洁产品的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物与可接受载体混合。

53.权利要求52的方法，其中所述可接受载体选自去污剂、肥皂和香精。

54.一种从废料生产甲烷的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于废料。

55.一种处理动物废物、草垫或褥草的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于动物废物、草垫或褥草。

56.一种制备青贮饲料的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于青贮饲料。

57.一种用于微生物增强的采油(MEOR)的方法，包括将包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于油井。

58.权利要求57的方法，其中所述细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌。

59.一种治疗或预防易感疾病或患有疾病的受试者的疾病的方法，包括将有效量的包含细菌孢子和萌发化合物的组合物施用于所述受试者，由此治疗或预防所述受试者的所述疾病。

60.权利要求59的方法，其中所述疾病是细菌疾病、真菌疾病或病毒疾病。

61.权利要求59的方法，其中所述疾病是坏死性肠炎。

62.权利要求61的方法，其中所述受试者是鸡、火鸡或鸭。

63.权利要求61或62的方法，其中所述受试者感染了产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)。

64.权利要求59-63任一项的方法，其中与没有施用所述组合物的受试者相比，治疗或预防所述疾病导致降低死亡率、减少病变数量和提高增重中的一种或多种。

65.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述孢子和所述萌发化合物保持在无活性形式，使得所述萌发化合物不会诱导所述孢子的萌发直至所述组合物经历活化环境。

66.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述组合物进一步包含阻止所述细菌孢子和所述萌发化合物相互作用直至所述组合物经历活化环境的物质。

67.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述物质选自表面活性剂、遮蔽剂、塑化剂、着色剂、染料、增亮剂、乳化剂、助流剂、凝结剂、消泡剂、增稠剂、蜡、杀菌剂、填充剂、聚合物、润湿剂和防冻剂。

68.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述组合物包含所述细菌孢子和所述萌发化合物的紧密混合物，其中所述细菌孢子和所述萌发化合物保持在邻近的位置直至它们到达有利于萌发的环境。

69.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述细菌孢子选自土壤芽孢杆菌、Bacillus aizawai、白色芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、食丁酸芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、Bacillus endoparasiticus、Bacillusendorhythmos、坚强芽孢杆菌、Bacillus kurstaki、Bacillus lacticola、乳病芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、水母芽孢杆菌、Bacillus metiens、莫海威芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、Bacillusnigrificans、日本甲虫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagellatus、热纤梭菌、扬氏梭菌、丙酮丁酸梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、穿刺巴斯德氏芽菌、多刺巴斯德氏芽菌、Pasteuria nishizawae和链霉菌属的种。

70.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述萌发化合物选自果糖、葡萄糖、钾、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸及其类似物。

71.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述细菌孢子选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；以及所述萌发化合物选自L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-天冬酰胺。

72.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中所述组合物是干粉的形式。

73.权利要求31-39、42-45、48-49或52-64任一项的方法，其中组合物是乳液的形式。