CN117625531A - 树突细胞祖细胞的制备方法及其培养基 - Google Patents

树突细胞祖细胞的制备方法及其培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及树突细胞祖细胞的制备方法及其培养基，具体提供制备树突细胞祖细胞的方法，包括步骤：将来自外周血的细胞在培养基中培养，获得树突细胞祖细胞。本发明方法可以快速准确地从外周血中获取树突细胞祖细胞。

Description

树突细胞祖细胞的制备方法及其培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域。更具体地，涉及从外周血中获得大量iGDP(individual general dendritic cell progenitor，树突细胞组细胞)的方法及其应用。
背景技术
免疫***，包括固有免疫和适应性免疫，是人体重要的保护屏障。树突细胞(dendritic cell，DC)是功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，是固有免疫和适应性免疫之间的桥梁。树突细胞能激活初始型T细胞、控制着体内免疫应答反应过程，是抗肿瘤免疫反应的中心环节。利用树突细胞进行免疫治疗能诱导患者机体产生肿瘤特异性、持久的免疫应答。
树突细胞疫苗的临床应用取得了巨大进展。截至2022年7月25日，美国国立卫生研究院管理的“Clinical trail”临床数据登记平台显示，以“Dendritic Cells”为关键词共有1183项树突细胞治疗临床试验登记，处于临床Ⅲ/IV期的树突细胞治疗临床试验有27项，主要适应症为黑色素瘤、肾癌、***癌等，白血病和HIV感染等。2010年基于树突细胞疫苗的自体***癌疫苗Sipuleucel-T(Provenge)获FDA批准上市，是全球首款树突细胞治疗性肿瘤疫苗。
树突细胞疫苗的临床应用同样面临巨大挑战。树突细胞疫苗产品的临床疗效与树突细胞剂量息息相关。在体内，树突细胞由骨髓内CD34+造血干细胞(hematopoietic stemcell，HSC)发育而来。在体外，90％树突细胞疫苗产品来源于外周血单核细胞(monocyte)，10％来源于脐血/动员外周血中CD34+造血干细胞，但均无法获得数量充足的树突细胞。如使用外周血单个核细胞(PBMC)分离单核细胞分化获得树突细胞技术路线，树突细胞得率仅约10％：每1E9个外周血单个核细胞可分离出1.3E8个单核细胞(13％)，1.3E8个单核细胞可分化获得1E8个树突细胞(80％)。如使用脐血/动员外周血中CD34+造血干细胞扩增分化获得树突细胞技术路线，树突细胞得率仅约15％：每1E9个脐血/动员外周血单个核细胞可分离出1E7个CD34+造血干细胞(1％)，1E7个CD34+造血干细胞可在体外扩增约20倍至2E8个细胞，2E8个细胞可分化获得1.5E8个树突细胞(75％)。
由于树突细胞无扩增能力，因此，如何高效获得数量充足的树突细胞祖细胞对于未来的免疫治疗具有实质性意义。
发明内容
本发明第一方面提供制备树突细胞祖细胞的方法，包括步骤：将来自外周血的细胞在培养基中培养，获得树突细胞祖细胞。
在一个或多个实施方案中，所述培养基含有生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂、异恶唑衍生物中的至少两种。优选地，所述培养基含有生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂和异恶唑衍生物。
在一个或多个实施方案中，所述生长因子选自SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种；优选地，所述生长因子含有SCF以及选自GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种。
在一个或多个实施方案中，含有时，SCF的浓度为10-150ug/L，优选为30-120ug/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，GM-CSF的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，G-CSF的浓度为0-200ug/L，优选为0-150ug/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，IL-3的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，FLT-3L的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
在一个或多个实施方案中，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂为MEK激活剂和/或ERK激活剂。优选地，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂选自GDC-0879、PLX4720、Vemurafenib(PLX4032)、Sorafenib(BAY 43-9006)、Dabrafenib(GSK2118436)中的一种或几种，更优选为GDC-0879。在一个或多个实施方案中，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂的浓度为0.1-5μM，优选为0.5-1.5μM。
在一个或多个实施方案中，所述异恶唑衍生物为式(I)所示的化合物。
其中，R1为未取代或取代的杂芳基，
m为0-4的整数，优选为1-3的整数，
X为CH2、NH或O，
R2为未取代或取代的杂芳基。
在一个或多个实施方案中，所述异恶唑衍生物为式1-21中任一所示的化合物。优选地，所述异恶唑衍生物为5-呋喃-2-基-异恶唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺。在一个或多个实施方案中，所述异恶唑衍生物的浓度为0-15μM，优选为0-10μM，更优选为1-10μM。
在一个或多个实施方案中，所述培养基还含有嘧啶并吲哚衍生物，优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物选自UM171和UM729中的一种或两种，更优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物为UM171。在一个或多个实施方案中，所述嘧啶并吲哚衍生物的浓度为0-80nM，优选为0-50nM。
在一个或多个实施方案中，所述培养基还含有基础培养基，例如基础无血清培养基，包括商业无血清培养基和补充有添加物的基本培养基。
在一个或多个实施方案中，所述商业无血清培养基选自StemSpanTM SFEM培养基、StemSpanTM SFEM II培养基、StemSpanTM-XF培养基、StemSpanTM-AOF培养基、StemProTM-34SFM中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述基本培养基选自IMDM培养基、DMEM/F-12培养基、Neurobasal培养基、AIM-V中的一种或多种；优选地，所述补充添加物选自人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、***钠、DL-α-生育酚、亚油酸中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，含有时，人血白蛋白的浓度为1-10g/L，优选为1g/L-5g/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，胰岛素浓度为1-20mg/L，优选为3-15mg/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，转铁蛋白的浓度为1-30mg/L，优选为3-25mg/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，***钠的浓度为1-20ug/L，优选为5-15ug/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，DL-α-生育酚的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-8mg/L。
在一个或多个实施方案中，含有时，亚油酸的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-5mg/L。
在一个或多个实施方案中，所述外周血为未经造血干细胞动员的外周血。
在一个或多个实施方案中，所述来自外周血的细胞包含选自CD45+白细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD123+细胞、CD123-细胞、CD34-细胞中的一种或多种。
本发明还提供培养组合物或包含所述培养基组合物的培养基，用于从外周血制备树突细胞祖细胞，所述培养组合物含有生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂、异恶唑衍生物中的至少两种。
在一个或多个实施方案中，所述培养基含有生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂和异恶唑衍生物。
在一个或多个实施方案中，所述生长因子选自SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种；优选地，所述生长因子含有SCF以及选自GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种。
在一个或多个实施方案中，所述培养基中，SCF的浓度为10-150ug/L，优选为30-120ug/L。
在一个或多个实施方案中，所述培养基中，GM-CSF的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
在一个或多个实施方案中，所述培养基中，G-CSF的浓度为0-200ug/L，优选为0-150ug/L。
在一个或多个实施方案中，所述培养基中，IL-3的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
在一个或多个实施方案中，所述培养基中，FLT-3L的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
在一个或多个实施方案中，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂为MEK激活剂和/或ERK激活剂。优选地，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂选自GDC-0879、PLX4720、Vemurafenib(PLX4032)、Sorafenib(BAY 43-9006)、Dabrafenib(GSK2118436)中的一种或几种，更优选为GDC-0879。在一个或多个实施方案中，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂的浓度为0.1-5μM，优选为0.5-1.5μM。
在一个或多个实施方案中，所述异恶唑衍生物为式(I)所示的化合物。
其中，R1为未取代或取代的杂芳基，
m为0-4的整数，优选为1-3的整数，
X为CH2、NH或O，
R2为未取代或取代的杂芳基。
在一个或多个实施方案中，所述异恶唑衍生物为式1-21中任一所示的化合物。优选地，所述异恶唑衍生物为5-呋喃-2-基-异恶唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺。在一个或多个实施方案中，所述异恶唑衍生物的浓度为0-15μM，优选为0-10μM，更优选为1-10μM。
在一个或多个实施方案中，所述培养基还含有嘧啶并吲哚衍生物，优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物选自UM171和UM729中的一种或两种，更优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物为UM171。在一个或多个实施方案中，所述嘧啶并吲哚衍生物的浓度为0-80nM，优选为0-50nM。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物中各生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂、异恶唑衍生物的浓度比与培养基中相应组分的浓度比相同。
在一个或多个实施方案中，所述培养基还含有基础培养基，例如基础无血清培养基，包括商业无血清培养基和补充有添加物的基本培养基。
在一个或多个实施方案中，所述商业无血清培养基选自StemSpanTM SFEM培养基、StemSpanTM SFEM II培养基、StemSpanTM-XF培养基、StemSpanTM-AOF培养基、StemProTM-34SFM中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述基本培养基选自IMDM培养基、DMEM/F-12培养基、Neurobasal培养基、AIM-V中的一种或多种；优选地，所述补充添加物选自人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、***钠、DL-α-生育酚、亚油酸中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，人血白蛋白的浓度为1-10g/L，优选为1g/L-5g/L。
在一个或多个实施方案中，胰岛素浓度为1-20mg/L，优选为3-15mg/L。
在一个或多个实施方案中，转铁蛋白的浓度为1-30mg/L，优选为3-25mg/L。
在一个或多个实施方案中，***钠的浓度为1-20ug/L，优选为5-15ug/L。
在一个或多个实施方案中，DL-α-生育酚的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-8mg/L。
在一个或多个实施方案中，亚油酸的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-5mg/L。
在一个或多个实施方案中，所述外周血为未经造血干细胞动员的外周血。
在一个或多个实施方案中，所述来自外周血的细胞包含选自CD45+白细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD123+细胞、CD123-细胞、CD34-细胞中的一种或多种。
本发明还提供本发明任一实施方案所述的培养组合物或培养基在制备含有树突细胞祖细胞的试剂中的应用。
本发明还提供一种树突细胞祖细胞，其由本文任一实施方案所述的方法制备。
本发明还提供一种树突细胞的制备方法，包括：将本文任一实施方案所述的树突细胞祖细胞在树突细胞分化培养基中培养，获得树突细胞。
本发明还提供一种由本文所述树突细胞的制备方法制备的树突细胞。
本发明还提供由本文任一实施方案所述的方法制备的树突细胞祖细胞在制备药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述药物用于治疗癌症、感染疾病和/或衰老相关疾病。
本发明还提供一种药物组合物，包含有效量的本文任一实施方案所述的方法制备的树突细胞祖细胞和药学上可接受的辅料。
本发明还提供一种细胞冻存制剂，包括前述由本文任一实施方案所述的方法获得的树突细胞祖细胞和冻存液。
本发明还提供一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，包含向所述受试者施用有效量的本文任一实施方案所述的药物组合物。
一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、感染疾病和/或衰老相关疾病。
本发明的有益效果：从外周血中扩增树突细胞祖细胞(iGDP细胞)，简便易得，可及性高，而且iGDP扩增倍数高，例如iGDP细胞数量是初始外周血单个核细胞数量的83-197倍。
附图说明
图1示出使用不同iGDP扩增培养基(培养基11-27)培养样品2-5第14天的细胞扩增倍数。
图2示出使用不同iGDP扩增培养基(培养基15、23、24、28-32)培养样品6和样品7第14天的细胞扩增倍数。
图3示出不同细胞来源扩增出的iGDP细胞形态图，Scale bar＝50μm或100μm。
图4示出诱导iGDP向DC高效分化14天的流式表征，分化起始细胞为培养基15培养样品4第14天的iGDP细胞，对照组为样本未进行抗体孵育的空白对照。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
发明人发现，通过培养来自外周血的细胞，可以获得树突细胞祖细胞。本文中，树突细胞祖细胞(iGDP，individual general dendritic cell progenitor)是指可分化形成树突细胞的前体细胞。
因此，本发明提供制备树突细胞祖细胞的方法，包括步骤：将来自外周血的细胞在培养基中培养，获得树突细胞祖细胞。本发明还提供用于上述从外周血制备树突细胞祖细胞的培养组合物或包含所述培养基组合物的培养基。所述培养组合物或培养基含有生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂、异恶唑衍生物中的至少两种。本发明还提供由所述的方法制备的树突细胞祖细胞。
本文所述的外周血的采集方式不限，可以是单采外周血或机采外周血等。
在一些实施方案中，所述外周血为未经造血干细胞动员的外周血。在一些实施方案中，来自外周血的细胞为外周血CD45+白细胞。在示例性实施方案中，所述来自外周血的细胞包含选自CD45+白细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD123+细胞、CD123-细胞、CD34-细胞中的一种或多种。
因此，本发明方法的一些实施方案还包括由外周血获取CD45+白细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD123+细胞、CD123-细胞、CD34-细胞中的一种或多种的步骤。
从外周血分离细胞的方法可采用本领域常规方法，例如羟乙基淀粉离心沉淀法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、流式细胞仪分选法等。密度梯度离心介质包括Ficoll-Hypaque、Percoll等。
来自外周血的细胞可以是新鲜细胞，也可以是冻存后复苏的细胞。
将来自外周血的细胞在所述培养基中培养的条件和时间可由本领域技术人员根据需要确定，例如37℃、5％CO2培养至少1天、至少3天、至少7天、至少14天、至少28天。
“生长因子”是指有效促进细胞生长且除非作为补充剂添加到培养基中否则它不是基础培养基的组分的物质。在一些实施方案中，培养基中所含的生长因子选自干细胞生长因子(stem cell factor，SCF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony stimulating factor，G-CSF)、白细胞介素3(Interleukin-3，IL-3)、FMS相关酪氨酸激酶3配体(Fms-related tyrosine kinase 3ligand，FLT-3L)中的至少一种。优选地，所述生长因子包含SCF。生长因子的浓度不受限制，示例性地：SCF的浓度为10-150ug/L，优选为30-120ug/L，例如30ug/L、40ug/L、50ug/L、60ug/L、80ug/L、100ug/L、120ug/L；GM-CSF的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L，例如，0、5ug/L、8ug/L、10ug/L、15ug/L、20ug/L、30ug/L、40ug/L、50ug/L；G-CSF的浓度为0-200ug/L，优选为0-150ug/L，例如0、10ug/L、20ug/L、25ug/L、40ug/L、50ug/L、60ug/L、80ug/L、100ug/L、150ug/L；IL-3的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L，例如0、10ug/L、20ug/L、25ug/L、30ug/L、40ug/L、50ug/L；FLT-3L的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L，例如0、10ug/L、20ug/L、25ug/L、30ug/L、40ug/L、50ug/L。
Raf/MEK/ERK通路调节剂是指能够阻断或激活Raf/MEK/ERK通路的物质。MAPK，即丝裂原活化蛋白激酶，其信号通路可以将细胞外信号转导至细胞内，通过三级激酶级联的形式(MAPK，MAPK激酶(MEK或MKK)以及MAPK激酶的激酶(MEKK或MKKK))传导细胞信号，从而调控细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应以及血管发育等生物学功能。Raf/MEK/ERK通路是MAPK信号通路网络4条信号通路中的1条。在一些实施方案中，培养基中所含的Raf/MEK/ERK通路调节剂为MEK激活剂和/或ERK激活剂。在一些实施方案中，培养基中所含的Raf/MEK/ERK通路调节剂为B-Raf激酶抑制剂。优选地，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂选自GDC-0879、PLX4720、Vemurafenib(PLX4032)、Sorafenib(BAY 43-9006)、Dabrafenib(GSK2118436)中的一种或几种。Raf/MEK/ERK通路调节剂的浓度不受限制，示例性的浓度为0.1-5μM，优选为0.5-1.5μM，例如0.5μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.5μM。
在一些实施方案中，异恶唑衍生物为式(I)所示化合物。
其中，R1为未取代或取代的杂芳基，
m为0-4的整数，优选为1-3的整数，
X为CH2、NH或O，
R2为未取代或取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R1为未取代或取代的含有1至2个选自N、O、S的杂原子的五元杂环，例如吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、恶唑基、恶二唑基、异恶唑基、***基等，优选噻吩基、呋喃基。其可通过五元杂环上的杂原子或碳原子与母体结构相连。当被取代时，取代基的数量可为1个或2个(单取代或双取代)，所述取代基选自烷基、卤代烷基、羟基烷基、氰基、卤素、酯基、氨基，优选地，所述取代基选自C1-C4烷基、三氟甲基、被1-2个羟基取代的C1-C4烷基、R3OC(＝O)-，其中R3为C1-C4烷基。
在一些实施方案中，R2为未取代或取代的含有1至2个选自N、O、S的杂原子的五元杂环，例如吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、恶唑基、恶二唑基、异恶唑基、***基等，优选为吡唑基、恶唑基、噻唑基。该杂芳基可通过五元杂环上的杂原子或碳原子与母体结构相连。当被取代时，取代基的数量可为1个或2个(单取代或双取代)，所述取代基选自烷基、卤代烷基、羟基烷基、氰基、卤素、酯基、氨基，优选地，所述取代基选自C1-C4烷基、三氟甲基、被1-2个羟基取代的C1-C4烷基、R3OC(＝O)-，其中R3为C1-C4烷基。优选实施方案中，所述取代基选自甲基、三氟甲基、羟丙基、氰基、卤素、CH3OC(＝O)-。
在一些实施方案中，式(I)化合物具有式(Ia)所示的结构：
其中，A为O或S，m、X和R2的定义如上所述。
在一些实施方案中，式(I)选自如下化合物：
在一些实施方案中，所述异恶唑衍生物为5-呋喃-2-基-异恶唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺(5-furan-2-yl-isoxazole-3-carboxylic acid(2-pyrazol-1-yl-ethyl)-amide，即上述化合物21，CAS:943820-93-7)。
所述异恶唑衍生物的浓度不受限制，示例性的浓度为0-15μM，优选为0-10μM，更优选为1-10μM，例如0、1μM、2μM、4μM、5μM、6μM、10μM。
所述培养基还可含有嘧啶并吲哚衍生物。一些实施方案中，嘧啶并吲哚衍生物为式(II)所示化合物：
其中，Ra选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的杂芳基、RdOC(＝O)-、ReNHC(＝O)-，其中Rd为未取代或取代的C1-C4烷基，Re为未取代或取代的C1-C4烷基；
Rb选自-NRfRg、-ORh，其中，Rf、Rg、Rh各自独立选自H、C1-C4烷基、-(CH2)nRi，其中，n为0-4的整数，Ri选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、-NRjRk、-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基；
Rc选自H、-(CH2)iRp，其中，i为0-4的整数，Rp选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、-NRjRk、-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基。
一些实施方案中，Ra为未取代或取代的杂芳基，所述杂芳基为含有1至2个选自N、O、S的杂原子的五元杂环或六元杂环，例如吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、恶唑基、恶二唑基、异恶唑基、***基、四唑基、吡啶基、嘧啶基等。其可通过五元环或六元环上的杂原子或碳原子与母体结构相连。当被取代时，取代基的数量可为1个或2个(单取代或双取代)，所述取代基选自烷基、卤代烷基、羟基烷基、氰基、卤素、酯基，优选地，所述取代基选自C1-C4烷基、三氟甲基、被1-2个羟基取代的C1-C4烷基、R3OC(＝O)-，其中R3为C1-C4烷基。优选实施方案中，所述取代基选自甲基、三氟甲基、羟丙基、氰基、卤素、CH3OC(＝O)-。
一些实施方案中，Rf、Rg中一者为H或C1-C4烷基、另一者为-(CH2)nRi，其中，n为0-4的整数，Ri选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的的C3-C6环烷基、未取代或取代的五元或六元杂环基(其含有1至2个选自N、O、S的杂原子，可通过五元或六元环上的杂原子或碳原子与母体结构相连)、未取代或取代的芳基、未取代或取代的五元或六元杂芳基(其含有1至2个选自N、O、S的杂原子，可通过杂原子或碳原子与母体结构相连)、-NRjRk、-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基。
一些实施方案中，Rf、Rg中一者选自H、C1-C4烷基，另一者为-(CH2)nRi，其中，n为0-4的整数，并且，
Ri选自：C1-C4烷基，其中一个氢原子被C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的C3-C6环烷基，未取代或取代(例如甲基)的含有1至2个选自N、O、S的杂原子的五元或六元杂环基(例如吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基)，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的芳基，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的含有1至2个选自N、O、S的杂原子五元或六元杂芳基(例如吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、恶唑基、恶二唑基、异恶唑基、***基、四唑基、吡啶基、嘧啶基)，-NRjRk，-CN，其中Rj、Rk各自独立选自C1-C4烷基。
一些实施方案中，Rh选自H、-(CH2)nRi，其中，n为0-4的整数，并且，
Ri选自：C1-C4烷基，其中一个氢原子被C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的C3-C6环烷基，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的含有1至2个选自N、O、S的杂原子的五元或六元杂环基(例如吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基)，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的芳基，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的含有1至2个选自N、O、S的杂原子五元或六元杂芳基(例如吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、恶唑基、恶二唑基、异恶唑基、***基、四唑基、吡啶基、嘧啶基)，-NRjRk，-CN，其中Rj、Rk各自独立选自C1-C4烷基。
一些实施方案中，Rc选自H、-(CH2)iRp，其中，i为0-4的整数，并且，
Rp选自：C1-C4烷基，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的芳基，未取代或被C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、氰基、硝基、氨基、C1-C4烷氧基取代的含有1至2个选自N、O、S的杂原子五元或六元杂芳基(例如吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、恶唑基、恶二唑基、异恶唑基、***基、四唑基、吡啶基、嘧啶基)，-NRjRk，-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基。
一些实施方案中，嘧啶并吲哚衍生物选自：
优选实施方案中，嘧啶并吲哚衍生物选自UM171和UM729。
嘧啶并吲哚衍生物的浓度不受限制，示例性的浓度为0-80nM，优选为0-50nM，例如0、5nM、10nM、20nM、25nM、40nM、50nM。
所述培养基的基础培养基不受限制，只要其适合树突细胞祖细胞生长即可。优选实施方案中，基础培养基是适合树突细胞祖细胞生长的无血清培养体系。无血清培养体系可采用商业无血清培养基，如StemSpanTM SFEM培养基、StemSpanTM SFEM II培养基、StemSpanTM-XF培养基、StemSpanTM-AOF培养基、StemProTM-34SFM；也可以采用包含基本培养基和补充添加物的基础无血清培养基。示例性实施方案中，所述基本培养基选自IMDM培养基、DMEM/F-12培养基、Neurobasal培养基、AIM-V中的一种或多种。示例性实施方案中，所述补充添加物选自人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、***钠、DL-α-生育酚、亚油酸中的一种或多种。补充添加物的含量不受限制，示例性地：人血白蛋白的浓度为1-10g/L，优选为1g/L-5g/L，例如1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L；胰岛素浓度为1-20mg/L，优选为3-15mg/L，例如3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L；转铁蛋白的浓度为1-30mg/L，优选为3-25mg/L，例如3mg/L、5mg/L、8mg/L、12mg/L、15mg/L、20mg/L、21mg/L、25mg/L；***钠的浓度为1-20ug/L，优选为5-15ug/L，例如5ug/L、8ug/L、10ug/L、12.5ug/L、15ug/L；DL-α-生育酚的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-8mg/L，例如0.5mg/L、0.8mg/mL、1mg/L、1.2mg/mL、2.5mg/mL、4mg/mL、5mg/L；亚油酸的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-5mg/L，例如0.5mg/L、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、2.5mg/mL、4mg/mL、5mg/L。
一些实施方案中，所述培养组合物或培养基含有Raf/MEK/ERK通路调节剂和生长因子，所述生长因子包括SCF、以及任选的G-CSF和/或IL-3。
本发明还提供树突细胞的制备方法，包括步骤：将前述由本文任一实施方案所述的方法获得的细胞在树突细胞分化培养基中培养，获得树突细胞。具体地，制备树突细胞的方法包括：(1)将来自外周血的细胞在本文所述的培养基中培养(例如至少1天、至少3天、至少7天、至少14天、至少28天)，获得第一细胞群，和(2)将第一细胞群在树突细胞分化培养基中培养(例如至少3天、至少6天、至少9天、至少12天)，获得树突细胞。所述来自外周血的细胞包含选自CD45+白细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD123+细胞、CD123-细胞、CD34-细胞中的一种或多种。
本发明中，树突细胞分化培养基不受限制，可以使用本领域常用的树突细胞分化培养基。一些实施方案中，树突细胞分化培养基含有细胞因子。所述细胞因子可选自SCF、GM-CSF、IL-4、FLT-3L、IFNγ、IL-15等中的一种或多种。树突细胞分化培养基的基础培养基不受限制，只要适于树突细胞分化即可。一些实施方案中，基础培养基选自IMDM、RPMI-1640，AIM-V等。另外还可含有血清或血清替代物作为补充添加物，例如FBS等。一些实施方案中，基础培养基为商用培养基，例如ImmunocultTM-ACF Dendritic Cell Medium等。另外还可加入有补充添加物例如ImmunocultTM-ACF Dendritic Cell Supplement等。示例性实施方案中，树突细胞分化培养基是添加有10％FBS、100ng/mL FLT-3L、20ng/mL SCF、20ng/mL GM-CSF、20ng/mL IL-4的IMDM基础培养基。
一些实施方案中，树突细胞分化培养基还含有DC细胞成熟因子。DC细胞成熟因子可为toll样受体(Toll-like receptor，TLR)的配体和/或激活剂等，例如其可选自poly(I:C)、R848、LPS等中的一种或多种。
本发明还提供由前述由本文任一实施方案所述的方法获得的树突细胞。
本发明还提供一种细胞冻存制剂，包括前述由本文任一实施方案所述的方法获得的树突细胞祖细胞和/或树突细胞；以及冻存液。
此外，本文所述的方法制备的树突细胞祖细胞和树突细胞可以用于制备药物组合物。因此，本发明还提供一种药物组合物，包含有效量的本文任一实施方案所述的方法制备的树突细胞祖细胞和/或树突细胞；以及药学上可接受的辅料。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。这类辅料包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式(例如，冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
本发明也提供通过施用本发明任一实施方案所述的树突细胞祖细胞或其药物组合物来治疗患者(尤其是树突细胞或树突细胞祖细胞相关疾病，包括但不限于感染疾病、代谢疾病和/或癌症)的方法。本文中，术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方案可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重及疗法激发受试者的抗癌反应的能力)而变。
将采用的含有本发明树突细胞祖细胞的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。
给药频率将取决于所用配制物中树突细胞祖细胞的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射；通过持续释放***或通过植入装置。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例
试剂和材料：
实施例中所使用的抗体、试剂来源如下：
StemSpanTMSFEM培养基，Stemcell Technologies公司，货号09650。
StemSpanTMSFEM II培养基，Stemcell Technologies公司，货号09655。
StemSpanTM-XF培养基，Stemcell Technologies公司，货号100-0073。
StemSpanTM-AOF培养基，Stemcell Technologies公司，货号100-0130。
IMDM培养基，Thermo Fisher公司，货号12440053。
DMEM/F12培养基，Thermo Fisher公司，货号11330032。
Neurobasal培养基，Thermo Fisher公司，货号21103049。
人血清白蛋白(CAS号70024-90-7)，Sigma-Aldrich公司，货号A3782。
Human insulin(CAS号11061-68-0)，Sigma-Aldrich公司，货号91077C。
转铁蛋白(CAS号11096-37-0)，Sigma-Aldrich公司，货号T0665。
***钠(CAS号10102-18-8)，Sigma-Aldrich公司，货号S9133。
DL-α-生育酚(CAS号10191-41-0)，Sigma-Aldrich公司，货号T3251。
亚油酸(CAS号60-33-3)，Sigma-Aldrich公司，货号L1012。
Human SCF，PeproTech公司，货号AF-300-07。
Animal-Free Recombinant Human GM-CSF，PeproTech公司，货号300-03。
Animal-Free Recombinant Human G-CSF，PeproTech公司，货号AF-300-23。
Recombinant Human IL-3，PeproTech公司，货号GMP200-03。
Human Flt3-Ligand，PeproTech公司，货号300-19-10。
GDC-0879，Selleck公司，货号S1104。
PLX-4720，Selleck公司，货号S1152。
Vemurafenib(PLX4032)，Selleck公司，货号S1267。
Sorafenib(BAY 43-9006)，Selleck公司，货号S7397。
Dabrafenib，Selleck公司，货号S2807。
化合物1-21、24-44，上海吉量医药工程有限公司。
UM171，ApexBio Technology公司，货号A8950。
UM729，ApexBio Technology公司，货号A8952。
Ficoll-Paque PREMIUM，GE Healthcare公司，货号17-5442-03。
Dulbecco's磷酸盐缓冲液，货号14190250。
ViaStainTMAO/PI Staining Solution，Nexcelom公司，货号CS2-0106。
Pan Monocyte Isolation Kit，Miltenyi Biotec公司，货号130-096-537。
CD123 MicroBeads，Miltenyi Biotec公司，货号130-094-432。
CD34 MicroBeads，Miltenyi Biotec公司，货号130-100-453。Fixable ViabilityStain 780，BD Biosciences公司，货号565388。
FITC Mouse Anti-Human CD11c，BD Biosciences公司，货号561355。
PE Mouse Anti-Human HLA-DR，BD Biosciences公司，货号555812。
BV605 Mouse Anti-Human CD40，BD Biosciences公司，货号740410。
BV786 Mouse Anti-Human CD80，BD Biosciences公司，货号564159。
实验方法：
1、Ficoll工艺分离外周血细胞的方法，包括以下步骤：
1)将血袋中的血(含抗凝剂)使用无菌注射器抽出平均分装到50mL离心管中；
2)使用Thermo Fisher的离心机2500g离心10min，设置参数升7降7；
3)抽出中间白膜层转移至新的50mL离心管中，每管20mL；
4)加入30mL常温DPBS稀释血样，轻柔充分混匀；
5)根据样本量，准备若干50mL离心管(30mL稀释血样/管)，每管加入15mL Ficoll备用(不要碰到管壁上部)，室温放置；
6)将30mL稀释血样缓慢加到Ficoll上(按Ficoll溶液：稀释好的血液为1：2)，室温，800g，离心20min，设置参数升1降0。
7)离心结束后，从下往上分为红细胞层、Ficoll层、白膜层、血浆层。弃血浆层至白膜层上方5mL刻度处，用1mL枪头缓慢吸取细胞白膜层至新50mL离心管中，加至少3倍体积DPBS至50mL；室温400g，离心10min，设置参数升9降9；
8)弃去上清(不要倒尽上清)，每管用1mL DPBS重悬细胞，加DPBS至50mL，室温400g，离心10min，设置参数升9降9；
9)弃去上清，用培养基重悬接种，放入37℃5％CO2培养箱培养。
2、从外周血细胞中获得iGDP的方法，包括以下步骤：
1)分离的新鲜外周血细胞使用DPBS重悬，室温300g，离心10min，设置参数升9降9(冻存外周血细胞从液氮罐取出，37℃水浴锅内快速融化，转移至9mL新鲜培养基中，轻轻吹打混匀，同样参数进行离心)；
2)弃去上清，使用1mL相应培养基重悬，取10μL细胞悬液与10μLViaStainTMAO/PIStaining Solution轻轻吹打混匀；
3)转移至细胞计数板，***Cellometer K2 Fluorescent CellViabilityCounter，选择相应程序进行AO/PI细胞活性检测；
4)加入适量培养基调整密度为1.4E6个活细胞/mL培养基，接种至Tissue-treated培养板内，放入37℃，5％CO2培养箱培养。
5)细胞汇合度达70-80％时，转移细胞悬液于离心管内，取10μL细胞悬液与10μLViaStainTMAO/PI Staining Solution轻轻吹打混匀；
6)转移至细胞计数板，***Cellometer K2 Fluorescent Cell ViabilityCounter，选择相应程序进行AO/PI细胞活性检测；
7)根据计数结果补加新鲜培养基调整密度为1E5个活细胞/mL培养基，接种后放入37℃5％CO2培养箱培养。
3、从CD14+单核细胞和CD14-非单核细胞中获得iGDP的方法，包括以下步骤：
1)外周血细胞使用DPBS重悬，室温300g，离心10min，设置参数升9降9；
2)配制分选buffer：将MACS BSA Stock Solution和autoMACS Rinsing Solution按1：20比例混合，置于冰上；
3)每1E7细胞用30μL分选buffer重悬，加入10μL FcR Blocking Solution试剂和10μL Biotin-Antibody Cocktail混匀，2-8℃孵育5min；
4)每1E7细胞用30μL分选buffer，加入20μL Anti-Biotin MicroBeads混匀，2-8℃孵育5min；
5)使用MACS Separator固定LS column，加入3mL buffer浸润LS column；
6)滴加细胞悬液，收集未标记即高纯CD14+单核细胞悬液，随后加入3mL buffer清洗，收集未标记细胞悬液，混合两次细胞悬液；
7)从MACS Separator上取下LS column至于收集管上，加入5mL buffer，将塞子推入柱内，立即将磁性标记的细胞冲洗出来，收集CD14-非单核细胞悬液；
8)分别混匀CD14+单核细胞和CD14-非单核细胞悬液，各取10μL细胞悬液置于离心管中，加入10μL ViaStainTMAO/PI Staining Solution轻轻吹打混匀加入计数板，Cellometer K2 Fluorescent Cell Viability Counter，选择相应程序进行AO/PI细胞活性检测；
9)CD14+单核细胞和CD14-非单核细胞悬液分别离心，300g，离心10min，设置参数升9降9，轻柔吸弃上清；
10)使用适当体积培养基重悬，调整细胞密度为1E5个活细胞/mL培养基，接种后放入37℃5％CO2培养箱培养。
4、从CD123+和CD123-细胞中获得iGDP的方法，包括以下步骤：
1)外周血细胞使用DPBS重悬，室温300g，离心10min，设置参数升9降9；
2)配制分选buffer：将MACS BSA Stock Solution和autoMACS Rinsing Solution按1：20比例混合，置于冰上；
3)每1E8细胞用400μL分选buffer重悬，加入100μL CD123MicroBeads混匀，2-8℃孵育15min；
4)每1E8细胞用10mL分选buffer重悬，300g，离心10min，设置参数升9降9，轻柔吸弃上清；
5)每1E8细胞用500μL分选buffer重悬；
6)使用MACS Separator固定LS column，加入3mL buffer浸润LS column；
7)滴加细胞悬液，收集未标记即CD123-细胞悬液，随后加入3mL buffer清洗，收集未标记细胞悬液，混合两次细胞悬液；
8)从MACS Separator上取下LS column至于收集管上，加入5mL buffer，将塞子推入柱内，立即将磁性标记的细胞冲洗出来(为提高CD123+细胞纯度，可以将冲洗的细胞悬液用一根新的LS column进行二次分选)；
9)分别混匀CD123+和CD123-细胞悬液，各取10μL细胞悬液置于离心管中，加入10μLViaStainTMAO/PI Staining Solution轻轻吹打混匀加入计数板，Cellometer K2Fluorescent Cell Viability Counter，选择相应程序进行AO/PI细胞活性检测；
10)CD123+和CD123-细胞悬液分别离心，300g，离心10min，轻柔吸弃上清；
11)使用相应体积相应培养基重悬，调整密度为1E5个活细胞/mL培养基，接种后放入37℃5％CO2培养箱培养。
5、从CD34-细胞中获得iGDP的方法，包括以下步骤：
1)外周血细胞使用DPBS重悬，室温300g，离心10min，设置参数升9降9；
2)配制分选buffer：将MACS BSA Stock Solution和autoMACS RinsingSolution按1：20比例混合，置于冰上；
3)每1E7细胞用30μL分选buffer重悬，加入10μL FcR Blocking Solution试剂和10μL Biotin-Antibody Cocktail混匀，2-8℃孵育5min；
4)每1E7细胞用30μL分选buffer，加入20μL Anti-Biotin MicroBeads混匀，2-8℃孵育5min；
5)使用MACS Separator固定LS column，加入3mL buffer浸润LS column；
6)滴加细胞悬液，收集未标记即高纯CD34-细胞悬液，随后加入3mL buffer清洗，收集未标记细胞悬液，混合两次细胞悬液；
7)混匀CD34-细胞悬液，各取10μL细胞悬液置于离心管中，加入10μLViaStainTMAO/PI Staining Solution轻轻吹打混匀加入计数板，Cellometer K2Fluorescent CellViability Counter，选择相应程序进行AO/PI细胞活性检测；
9)CD34-细胞悬液分别离心，300g，离心10min，设置参数升9降9，轻柔吸弃上清；
10)使用适当体积培养基重悬，调整细胞密度为1E5个活细胞/mL培养基，接种后放入37℃5％CO2培养箱培养。
6、诱导iGDP向树突细胞分化和成熟的方法，包括以下步骤：
1)iGDP细胞使用DPBS重悬，室温300g，离心10min，设置参数升9降9；
2)弃去上清，使用1mL培养基，取10μL细胞悬液与10μL ViaStain AO/PI StainingSolution轻轻吹打混匀；
3)转移至细胞计数板，***Cellometer K2 Fluorescent Cell ViabilityCounter，选择相应程序进行AO/PI细胞活性检测；
4)加入适量分化培养基(IMDM基础培养基添加10％FBS、100ng/mL FLT-3L、20ng/mL SCF、20ng/mL GM-CSF、20ng/mL IL-4)调整密度为5E5个活细胞/mL悬液，接种后放入37℃，5％CO2培养箱培养。
5)每隔3天半换液；
6)培养第12天，收集一半体积细胞悬液，室温300g，离心10min，设置参数升9降9；
7)弃去上清，使用适量成熟培养基(IMDM基础培养基添加10％FBS、100ng/mL FLT-3L、20ng/mL SCF、20ng/mL GM-CSF、20ng/mL IL-4、200IU/mL IFNγ、60μg/mL poly(I:C)、10μg/mL R848、2μg/mL LPS)重悬细胞，接种至原孔中继续培养24h。
7、iGDP细胞和iGDP衍生树突细胞流式检测方法，包括以下步骤：
1)取已知数量的iGDP/iGDP衍生树突细胞，室温静置3-5min，400g，离心5min，轻柔吸弃上清；
2)调整细胞密度为1E7个活细胞/mL DPBS，按每1E7加1.5μL比例加入FVS780，将样品与染料充分混匀，室温避光孵育10min；
3)再取4mL DPBS清洗两次，每次清洗后离心，400g，离心10min，轻柔吸弃上清；
4)按比例加入对应抗体(FITC Mouse Anti-Human CD11c，PE Mouse Anti-HumanHLA-DR，BV605 Mouse Anti-Human CD40，BV786 Mouse Anti-Human CD80)于1.5mL离心管中，将抗体完全混匀；
5)将混匀后的细胞密度调整至2E6个活细胞/100μL悬液，样品管中加入100μL细胞悬液，室温避光孵育15min；
6)样品管中加入1mL DPBS，使用台式离心机离心，400g离心5min，轻柔吸弃上清；
7)重复步骤6清洗一次；
8)样品管中加入300μL DPBS，使用枪头小心吹打混匀；
9)上机检测。
实施例1，iGDP扩增培养基的配制
iGDP扩增培养基1-32的组成及比例如表1所示，其中培养基StemSpanTM SFEM、StemSpanTMSFEM II、StemSpanTM-XF、StemSpanTM-AOF、IMDM、DMEM/F-12和Neurobasal的用量单位为v/v，人血白蛋白用量单位为g/L，胰岛素、转铁蛋白、DL-α-生育酚和亚油酸的用量单位为mg/L，***钠的用量单位为μg/L，SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-3和FLT-3L的用量单位为μg/L，GDC-0879的用量单位为μM，5-furan-2-yl-isoxazole-3-carboxylic acid(2-pyrazol-1-yl-ethyl)-amide(化合物21)的用量单位为μM，嘧啶并吲哚衍生物UM171的用量单位为nM。
详见下表1。
表1中未写用量的即用量为0。
此外，发明人将上述培养基中的GDC-0879替换为PLX-4720、Vemurafenib(PLX4032)、Sorafenib(BAY 43-9006)、或Dabrafenib，获得对应于培养基2、3、5-9、11-32的培养基33-61(PLX-4720)、培养基62-90(PLX4032)、培养基91-119(Sorafenib)、培养基120-148(Dabrafenib)。
此外，发明人将上述培养基3-10、12-22、24-30、32中的化合物21替换为化合物1-20，获得对应于培养基3-10、12-22、24-30、32的其它多种培养基。
此外，发明人将上述培养基14-20中的UM171替换为UM729和化合物24-44，获得对应于培养基14-20的其它多种培养基。
实施例2，血液细胞样本的采集
本发明中血液细胞样品来源于非动员外周血，供者包含18-70岁健康人群，性别不限。采用Ficoll工艺分离非动员外周血CD45+细胞，以新鲜细胞和冻存再复苏细胞为起始细胞进行扩增。样本8和9为样本6磁珠分选后的CD14+单核细胞和CD14-非单核细胞，样本10和11为样本7磁珠分选后的CD123+和CD123-细胞，样本12为外周细胞磁珠分选后的CD34-细胞。
详见下表2。
实施例3，iGDP扩增培养基配方研究-不同培养基培养样品1第7/14天的细胞扩增倍数
以Ficoll工艺分离的机采外周血细胞样本1为起始细胞，使用iGDP培养基1-9为受试培养基，采集培养第0天和第7/14天的活细胞数。
实施例4，iGDP扩增培养基配方研究-不同培养基培养样品2-5第14天的细胞扩增倍数
以Ficoll工艺分离的手采外周血细胞为起始细胞，使用iGDP培养基11-27为受试培养基，采集培养第0天和第14天的活细胞数。
由图1以看出，使用iGDP扩增培养基11-27培养14天后，细胞扩增倍数为0.32±0.15至4.94±1.19(数据为样本2-5的平均值和标准差)。
实施例5，iGDP扩增培养基配方研究-不同培养基培养样品6-7第14天的细胞扩增倍数
以Ficoll工艺分离的机采外周血细胞为起始细胞，使用iGDP培养基15、23、24、28-32为受试培养基，采集培养第0天和第14天的活细胞数。
由图2可以看出，使用iGDP扩增培养基15、23、24、28-32培养14天后，细胞扩增倍数为11.83±1.36至43.23±5.34(数据为样本6-7的平均值和标准差)。
实施例6，iGDP长期扩增能力研究-不同培养基培养样品7第28天的细胞扩增倍数
以Ficoll工艺分离的机采外周血细胞样本7为起始细胞，使用iGDP培养基15、24、30为受试培养基，起始细胞接种数量为1E6个活细胞，培养第28天进行活细胞计数，收集细胞活率和细胞直径数据。
由表3可以看出，样本7在iGDP扩增培养基15中扩增能力最优，培养28天扩增197倍且细胞活率维持在85.8％，其次是培养基30和24，培养28天扩增分别扩增194倍和83倍，细胞直径范围为11.8-12.1μm。
详见下表3。
表3
实施例7，iGDP扩增起始细胞来源研究-CD45+细胞、CD14+单核细胞、CD14-非单核细胞、CD123+细胞、CD123-细胞和CD34-细胞起始细胞培养
分别以Ficoll工艺分离的机采外周血CD45+细胞(样品7)、Ficoll工艺分离结合磁珠分选获得的CD14+单核细胞(样品8)、CD14-非单核细胞(样品9)、CD123+细胞(样品10)、CD123-细胞(样品11)和CD34-细胞(样品12)为起始细胞，使用iGDP培养基15接种，采集培养第14天的iGDP细胞光镜图片。
由图4可以看出，CD45+细胞、CD14+单核细胞、CD14-非单核细胞、CD123+细胞、CD123-细胞和CD34-细胞均可扩增获得iGDP细胞，iGDP细胞悬浮或贴壁生长、细胞呈圆球形、大小较均一。
实施例8，iGDP衍生DC细胞得率和流式表征检测
以iGDP细胞为分化起始细胞，根据本发明中树突状细胞分化方法进行定向分化和成熟，分化成熟后进行得率(分化细胞数/初始PBMC细胞数*CD11c+细胞占比)和细胞流式表征检测。
由表4可以看出，样本7在iGDP扩增培养基15、24和30中的DC细胞得率分别为138.05倍、75.42倍和132.64倍。
详见下表4。
由表5可以看出，由不同培养基获得的iGDP细胞可高效分化为DC细胞，其中培养基24获得的iGDP细胞向DC细胞分化效率最高，CD11c+细胞占比为85.70％、HLA-DR+细胞占比为56.04％、CD40+细胞占比为79.91％、CD8+细胞占比为64.83％。
详见下表5。
另，培养基15获得的iGDP衍生DC细胞流式表征检测结果如图4所示，iGDP衍生DC细胞CD11c+占比为75.77％，HLA-DR+占比为30.29％，CD40+占比为72.12％，CD80+占比为75.28％，表明iGDP具有DC分化潜能。

Claims (34)

1.一种制备树突细胞祖细胞的方法，其特征在于，将来自外周血的细胞在培养基中培养，获得树突细胞祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基含有生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂、异恶唑衍生物中的至少两种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生长因子选自SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种，更优选地，所述生长因子含有SCF以及选自GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
SCF的浓度为10-150ug/L，优选为30-120ug/L；
GM-CSF的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L；
G-CSF的浓度为0-200ug/L，优选为0-150ug/L；
IL-3的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L；和/或
FLT-3L的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂为MEK激活剂和/或ERK激活剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂选自GDC-0879、PLX4720、Vemurafenib、Sorafenib、Dabrafenib中的一种或几种，优选为GDC-0879。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂的浓度为0.1-5μM，优选为0.5-1.5μM。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述异恶唑衍生物为式(I)所示的化合物：
其中，R1为未取代或取代的杂芳基，
m为0-4的整数，优选为1-3的整数，
X为CH2、NH或O，
R2为未取代或取代的杂芳基；
优选地，所述异恶唑衍生物为式1-21中任一所示的化合物；
更优选地，所述异恶唑衍生物为5-呋喃-2-基-异恶唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述异恶唑衍生物的浓度为0-15μM，优选为0-10μM，更优选为1-10μM，进一步优选为4-6μM。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基还含有嘧啶并吲哚衍生物，优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物如式(II)所示，
其中，Ra选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的杂芳基、RdOC(＝O)-、ReNHC(＝O)-，其中Rd为未取代或取代的C1-C4烷基，Re为未取代或取代的C1-C4烷基；
Rb选自-NRfRg、-ORh，其中，Rf、Rg、Rh各自独立选自H、C1-C4烷基、-(CH2)nRi，其中，n为0-4的整数，Ri选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、-NRjRk、-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基；
Rc选自H、-(CH2)iRp，其中，i为0-4的整数，Rp选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、-NRjRk、-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基；
更优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物为式22-44中任一所示的化合物；
进一步优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物选自UM171和UM729中的一种或两种，更进一步优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物为UM171。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述嘧啶并吲哚衍生物的浓度为0-80nM，优选为0-50nM。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基还含有基础培养基，例如基础无血清培养基；优选地，所述基础培养基包括商业无血清培养基或补充有添加物的基本培养基。
13.根据权利要求12中任一项所述的方法，其特征在于，
所述商业无血清培养基选自StemSpanTMSFEM培养基、StemSpanTMSFEM II培养基、StemSpanTM-XF培养基、StemSpanTM-AOF培养基、StemProTM-34 SFM中的一种或多种，
所述基本培养基选自IMDM培养基、DMEM/F-12培养基、Neurobasal培养基、AIM-V中的一种或多种，
所述补充添加物选自人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、***钠、DL-α-生育酚、亚油酸中的一种或多种。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，
人血白蛋白的浓度为1-10g/L，优选为1g/L-5g/L；
胰岛素浓度为1-20mg/L，优选为3-15mg/L；
转铁蛋白的浓度为1-30mg/L，优选为3-25mg/L；
***钠的浓度为1-20ug/L，优选为5-15ug/L；
DL-α-生育酚的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-8mg/L；和/或
亚油酸的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-5mg/L。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，所述外周血为未经造血干细胞动员的外周血。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自CD45+白细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD123+细胞、CD123-细胞、CD34-细胞中的一种或多种。
17.一种培养基，其特征在于，用于从外周血制备树突细胞祖细胞，所述培养基含有生长因子、Raf/MEK/ERK通路调节剂、异恶唑衍生物中的至少两种。
18.根据权利要求17所述的培养基，其特征在于，所述生长因子选自SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种，更优选地，所述生长因子含有SCF以及选自GM-CSF、G-CSF、IL-3、FLT-3L中的至少一种。
19.根据权利要求18所述的培养基，其特征在于，
SCF的浓度为10-150ug/L，优选为30-120ug/L；
GM-CSF的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L；
G-CSF的浓度为0-200ug/L，优选为0-150ug/L；
IL-3的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L；和/或
FLT-3L的浓度为0-80ug/L，优选为0-50ug/L。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的培养基，其特征在于，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂为MEK激活剂和/或ERK激活剂。
21.根据权利要求20所述的培养基，其特征在于，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂选自GDC-0879、PLX4720、Vemurafenib(PLX4032)、Sorafenib(BAY 43-9006)、Dabrafenib(GSK2118436)中的一种或几种，优选为GDC-0879。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的培养基，其特征在于，所述Raf/MEK/ERK通路调节剂的浓度为0.1-5μM，优选为0.5-1.5μM。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的培养基，其特征在于，
所述异恶唑衍生物为式(I)所示的化合物：
其中，R1为未取代或取代的杂芳基，
m为0-4的整数，优选为1-3的整数，
X为CH2、NH或O，
R2为未取代或取代的杂芳基；
优选地，所述异恶唑衍生物为式1-21中任一所示的化合物；
更优选地，所述异恶唑衍生物为5-呋喃-2-基-异恶唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的培养基，其特征在于，所述异恶唑衍生物的浓度为0-15μM，优选为0-10μM，更优选为1-10μM，进一步优选为4-6μM。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的培养基，其特征在于，
所述培养基还含有嘧啶并吲哚衍生物，优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物如式(II)所示，
其中，Ra选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的杂芳基、RdOC(＝O)-、ReNHC(＝O)-，其中Rd为未取代或取代的C1-C4烷基，Re为未取代或取代的C1-C4烷基；
Rb选自-NRfRg、-ORh，其中，Rf、Rg、Rh各自独立选自H、C1-C4烷基、-(CH2)nRi，其中，n为0-4的整数，Ri选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、-NRjRk、-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基；
Rc选自H、-(CH2)iRp，其中，i为0-4的整数，Rp选自未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、-NRjRk、-CN，其中Rj、Rk各自独立选自未取代或取代的C1-C4烷基；
更优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物为式22-44中任一所示的化合物；
进一步优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物选自UM171和UM729中的一种或两种，更进一步优选地，所述嘧啶并吲哚衍生物为UM171。
26.根据权利要求25所述的培养基，其特征在于，所述嘧啶并吲哚衍生物的浓度为0-80nM，优选为0-50nM。
27.根据权利要求17-25中任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基还含有基础培养基，例如基础无血清培养基；优选地，所述基础培养基包括商业无血清培养基或补充有添加物的基本培养基。
28.根据权利要求27所述的培养基，其特征在于，
所述商业无血清培养基选自StemSpanTMSFEM培养基、StemSpanTMSFEM II培养基、StemSpanTM-XF培养基、StemSpanTM-AOF培养基、StemProTM-34 SFM中的一种或多种，
所述基本培养基选自IMDM培养基、DMEM/F-12培养基、Neurobasal培养基、AIM-V中的一种或多种，
所述补充添加物选自人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、***钠、DL-α-生育酚、亚油酸中的一种或多种。
29.根据权利要求28所述的培养基，其特征在于，
人血白蛋白的浓度为1-10g/L，优选为1g/L-5g/L；
胰岛素浓度为1-20mg/L，优选为3-15mg/L；
转铁蛋白的浓度为1-30mg/L，优选为3-25mg/L；
***钠的浓度为1-20ug/L，优选为5-15ug/L；
DL-α-生育酚的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-8mg/L；和/或
亚油酸的浓度为0.5-10mg/L，优选为0.5-5mg/L。
30.一种由权利要求1-16中任一项所述的方法制备的树突细胞祖细胞。
31.一种树突细胞的制备方法，其特征在于，将权利要求30所述的树突细胞祖细胞在树突细胞分化培养基中培养，获得树突细胞。
32.一种由权利要求31所述的制备方法制备的树突细胞。
33.权利要求30所述的树突细胞祖细胞或权利要求32所述的树突细胞在制备用于药物中的用途，优选地，所述药物用于治疗癌症、感染疾病和/或衰老相关疾病。
34.一种药物组合物，包含有效量的权利要求30所述的树突细胞祖细胞和/或权利要求32所述的树突细胞，以及药学上可接受的辅料。
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