CN117625498B - 长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用 - Google Patents

长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化妆品领域，尤其涉及长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用。本发明提供了微生物菌剂，由菌株的发酵上清、发酵滤液和发酵浓缩液中的一种或多种组成；菌株为长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)，其保藏编号为：CGMCC NO.27851。本发明涉及的菌种的滤液可在食品及美妆领域达到抗衰、去角质的功效，功效范围更广泛，能在美容护肤领域有更好的发挥。

Description

长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用
技术领域
本发明涉及化妆品领域，尤其涉及长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用。
背景技术
皮肤分为表皮，真皮，皮下组织；皮肤的表层又分为五层，从下往上依序是基底层，棘状细胞层，颗粒层，透明层，角质层。皮肤细胞是从基底层开始生长，随着往外推移，历经了衰老和死亡的过程，角质是表皮细胞不断再生的最后产物，皮肤表面角质层厚，皮肤会失去光泽，灰暗、脱皮、产生皱纹、生长痘痘等。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用。本发明提供的菌种的滤液可在美妆领域达抗衰、去角质的功效，且效果更显著。
本发提供了微生物菌剂，由菌株的发酵上清、发酵滤液和发酵浓缩液中的一种或多种组成；
所述菌株为长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)，其保藏编号为：CGMCC NO.27851。
在本发明的一些实施方案中，上述微生物菌剂中，所述微生物菌剂包括：有机酸15~20%、氨基酸5~10%、无机酸5~10%、无机盐1~10%和糖醇1~5%。
在本发明的一些实施方案中，上述微生物菌剂中，所述微生物菌剂包括：有机酸17%、氨基酸8.5%、无机酸6%、无机盐4.5%和糖醇3%。
在本发明的一些实施方案中，上述微生物菌剂中，所述微生物菌剂包括：乙醇酸17%、焦谷氨酸8.5%、柠檬酸6%、羟胺4.5%和山梨醇3%。
本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：取所述长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)接种培养后，获得种子液；
S2：取所述种子液发酵后，离心，取上清液，获得所述微生物菌剂。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述接种的接种量为5%。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述离心的转速为3000 rpm，时间为30 min。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述取上清液后还包括浓缩的步骤。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述浓缩的倍数为5倍。
本发明还提供了上述微生物菌剂和/或上述制备方法获得的微生物菌剂在制备抗衰的化妆品中的应用。
本发明还提供了上述微生物菌剂和/或上述制备方法获得的微生物菌剂在制备去角质的化妆品中的应用。
本发明还提供了化妆品，包括上述微生物菌剂和/或上述制备方法获得的微生物菌剂以及化妆品领域可接受的助剂。
本发提供了微生物菌剂，由菌株的发酵上清、发酵滤液和发酵浓缩液中的一种或多种组成；
所述菌株为长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)，其保藏编号为：CGMCC NO.27851。
本发明提供的菌种分离自母乳喂养的健康婴儿，试验结果表明，本发明提供的菌种的滤液具有抗衰、去角质的功效，且效果更显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示菌株形态图；
图2示菌株进化树；
图3示革兰氏染色图；
图4示无溶血环；
图5示菌株发酵滤液制备工艺；
图6示菌株发酵滤液在离体乳猪皮上促进去角质的实物照片；
图7示菌株发酵滤液在3D表皮模型上改善UVB诱导的组织形态的实物结果；
图8示菌株发酵滤液在离体皮肤上促进透明质酸生成的荧光图片；
图9示菌株发酵滤液在离体皮肤上促进XVII型胶原蛋白生成的IHC染色图片。
生物保藏证明
生物材料：YSGBifido001；分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacteriumlongum subsp. infantis）；于2023年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.27851。
具体实施方式
本发明公开了长双歧杆菌婴儿亚种的滤液的应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。
本发明的菌种来源：
微生物来源(细菌来源），DNA序列验证为独家菌种，CGMCC NO.:27851。
本发明的菌种类别：
长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)，细菌。
本发明的菌种介绍：
YSGBifido001分离自4月龄广州母乳喂养的健康婴儿，经16S rDNA序列比对鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）。其在MRS培养基（固体/液体）中生长情况良好，厌氧条件下培养1天即能达到对数生长期。在MRS固体培养基上生长的菌株菌落形态为乳白色圆形，边缘整齐。菌株在血平板上生长无明显溶血环。革兰染色后在显微镜下菌体呈蓝紫色，杆状，中间细两端膨大，似“杠铃”。
本发明中，总蛋白的测定使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（Biosharp公司）。
本发明涉及的引物：
表1
名称 引物
27F 3’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-5’（如SEQ ID NO:1所示）
1492R 3’-GGTTACCTTGTTACGACTT-5’（如SEQ ID NO:2所示）
菌株序列 序列：3’-TGCAAGTCGAACGGGATCCATCAGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGTTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGTGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGTCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGATCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTGTGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACGCGGCGACGCGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCA-5’（如SEQ ID NO:3所示）。
COL I引物 F:5'-GTGGCAGTGATGGAAGTGTG-3'（如SEQ ID NO:4所示）R:5'-AGGACCAGCGTTACCAACAG-3'（如SEQ ID NO:5所示）
COL Ⅲ引物 F:5'-ACCAGGAGCTAACGGTCTCA-3'（如SEQ ID NO:6所示）；R:5'-TCTGATCCAGGGTTTCCATC-3'（如SEQ ID NO:7所示）。
COL Ⅳ的引物 F:5'-AGGTGTCATTGGGTTTCCTG-3'（如SEQ ID NO:8所示）；R:5'-GGTCCTCTTGTCCCTTTTGTT-3'（如SEQ ID NO:9所示）。
COL Ⅶ的引物 F:5'-ACTGTGATTGCCCTCTACGC-3'（如SEQ ID NO:10所示）；R:5'-GGCTGTGGTATTCTGGATGG-3'（如SEQ ID NO:11所示）。
VCAN的引物 F:5'-GTGTGGGCATTTCTTCCTGTTAG-3'（如SEQ ID NO:12所示）；R:5'-TCAAAGTCATCTTCAGCAGTCACT-3'（如SEQID NO:13所示）。
弹性蛋白的引物 F:5'-TCCAGGTGTAGGTGGAGCTT-3'（如SEQ ID NO:14所示）；R:5'-GTGTAGGGCAGTCCATAGCC-3'（如SEQ ID NO:15所示）。
纤连蛋白的引物 F:5'-AGCCAGTCGAGGATACCTGT-3'（如SEQ ID NO:16所示）；R:5'-GCACCAAAGCCTGAAACCAG-3'（如SEQ ID NO:17所示）。
HAS1的引物 F:5'-ACTCGGACACAAGGTTGGAC-3'（如SEQ ID NO:18所示）；R:5'-TTAGGAAGCTGACCCAGGAG-3'（如SEQ ID NO:19所示）。
NF-κB的引物 F:5'-GGTGCGGCTCATGTTTACAG-3'（如SEQ ID NO:20所示）；R:5'-GATGGCGTCTGATACCACGG-3'（如SEQ ID NO:21所示）。
p21的引物 F:5'-TCTCTGTGTTAGGGGTATATGATGG-3'（如SEQ ID NO:22所示）；R:5'-GAAGGTCGCTGGACGATTTG-3'（如SEQ IDNO:23所示）。
p16的引物 F:5'-CTCTGAGAAACCTCGGGAAAC-3'（如SEQ ID NO:24所示）；R:5'-ATGAAAACTACGAAAGCGGG-3'（如SEQ ID NO:25所示）。
TIMP-1的引物 F:5'-CTGTTGTTGCTGTGGCTGAT-3'（如SEQ ID NO:26所示）；R:5'-TCTGGTTGACTTCTGGTGTCC-3'（如SEQ ID NO:27所示）。
LC3-II的引物 F:5'-GAACTGAGCTGCCTCTACCG-3'（如SEQ ID NO:28所示）；R:5'-GGGACAACCCTAACACGACC-3'（如SEQ ID NO:29所示）
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
本发明实施例1~实施例2和验证例1~验证例4中，所用原料及试剂均可由市场购得。
实施例1 长双歧婴儿亚种菌株的分离纯化
（1）、实验方法
1）粪便收集：细胞培养瓶中加入20 mL细菌冻存液，使用灭菌棉签收集刚***出来的粪便（来源于广州母乳喂养婴儿的粪便样本）于培养瓶中，将培养瓶封入厌氧袋里，保存（冰盒中）、运输。
2）稀释涂布：震荡后吸取100 μL步骤1）的粪便悬液至900 μL PBS缓冲液中，吹打混匀后再吸取100 μL悬液至900 μL PBS缓冲液中，以此类推，梯度稀释10次。各取20 μL每个梯度的稀释液，分别涂布于MRS、BHI、CBA平板上，37℃有氧或厌氧环境下培养48~72 h。
3）单菌落增菌培养：使用一次性接种环随机挑取菌落数量在5~100个的平板的单菌落于20 μL PBS缓冲液中，吹打混匀后取15 μL菌液涂布于同种平板上，37℃有氧或厌氧环境下培养48~72 h，留5 μL菌液待革兰氏染色鉴定。
4）细菌传代：使用一次性接种环尽量刮取平板上生长的细菌，重悬于200 μL的PBS中，接着将200 μL菌液重新涂布到同种平板上，相同条件下培养48~72 h。
5）细菌冻存：将增菌量足够的平板上的细菌用接种环收集于由胎牛血清、BHI培养基、甘油混合而成的无菌冻存液中，吹打混匀，-80℃保存菌种。同时留取适量细菌待提取细菌基因组DNA。
6）革兰氏染色鉴定：于载玻片中央滴加挑取单菌落时制备的5 μL菌液，使用酒精灯间歇烘烤固定，分别滴加结晶紫染色液、卢戈碘液覆盖1 min，流水洗涤，再用脱色酒精覆盖载玻片表面20-30 s，期间轻轻摇晃载玻片，流水洗去酒精后使用番红染液复染1 min，再次流水洗涤，待载玻片干燥后使用光学显微镜镜检观察细菌形态。若菌落不纯，存在一种以上的细菌形态，则对样本进行平板划线接种，培养后重新挑取单菌落。
7）细菌基因组DNA提取：使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照天根生化科技公司的说明书进行细菌基因组DNA提取，并用NanoDrop2000测定DNA浓度。
8）16S片段扩增：
<1>采用27F/1492R引物对，采用如下的反应体系：
表2
<2>PCR扩增程序如下：95℃预变性60 s；95℃ 变性30 s，56℃复性 30 s，72℃ 延伸90 s，循环数为31；72℃ 再延伸7 min，结束温度设为4℃。
9）琼脂糖凝胶电泳，大小是否在1500 bp左右。
10）16S rRNA测序与结果比对，初步鉴定细菌的类型。
（2）、实验结果
长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp. Infantis YSGBifido001）的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。其16S rDNA与已知长双歧杆菌菌株对比至少存在两个碱基突变位点，其亲缘关系最近的菌株为B. longum subsp. infantis strain ATCC15697。
实施例2 长双歧杆菌婴儿亚种菌株滤液生产流程
（1）、甘油管菌种制备
1）、原始冻干粉菌种活化：冻干粉转接100 mL环凯MRS三角瓶培养基，37℃厌氧静止培养20~24小时，制成菌液备用；
2）、分离单菌落：菌液MRS固体培养基平板划线分离，37℃厌氧静止培养48小时，长大后备用；
3）、单菌落活化：单菌落转接100 mL液体三角瓶培养基（如表3所示），37℃厌氧静止培养活化20小时制菌液，镜检是否达标OD*10>0.260、pH<4.50；
4）、原始甘油管菌种保种：上述菌5%接种量（培养20~24小时后检测OD*10>0.260可判定培养合格）转接配方卡1三角瓶培养基（如表3所示），至培养20小时检测OD*10>0.260、pH<4.50，镜检达标后，菌种甘油管(0.70 mL保菌液与菌液0.70 mL)保种；
5）、种子批的建立：生产用菌种应按照“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定建立种子批***。
（2）、将步骤（1）获得的菌株长双歧杆菌婴儿亚种，接种于培养基（培养基配方如表3所示），接种量（培养20~24小时后检测OD*10>0.260可判定培养合格）为5％，于37℃培养20~24h，离心沉淀取上清液，冻干干燥浓缩五倍，得到浓缩发酵液；
表3
（3）、步骤（2）获得的菌株浓缩发酵液的成分如表4所示。
表4
验证例1 总酸、pH、总蛋白测定
对实施例2获得的滤液检测。
（1）采用酸碱滴定法测定总酸含量。
（2）采用pH计测定pH。
（3）利用检测试剂盒测定总蛋白含量。
实验结果如表5所示。
表5
验证例2 去角质
1）测试方法
工作液配置：
<1>清洗液（0.1% Triton X-100）配置：称取0.1 mL Triton X-100 溶于100 mL的PBS中，配制成0.1%的Triton X-100溶液。
<2>氢氧化钠溶液（12 M）配置：称取4.8 g NaOH固体，加去离子水定容至10 mL，配制成12 M的NaOH溶液。
给药：
<1>猪皮解冻后清洗，将皮肤固定于Franz cell扩散池的供给室和接收室之间，皮肤角质层面向供给室，真皮层朝向接收室；向接收室中加入接收液（PBS缓冲液）7.0 mL，将乳猪皮绷紧固定好后，通过取样器向接收室中添加1.5 mL接收液，排净空气，使皮肤真皮层面与接收液紧密接触。
<2>向供给室中皮肤表面加入如表6所示的样品，将50 μL样品添加至猪皮表面（添加PBS缓冲液作为空白对照），将样品自皮肤中心部位辐射状向边缘均匀涂开，样品暴露面积为3.14 cm2。每种样品3个重复与平行，保持（32±1）℃恒温水浴，并确保水浴夹层无气泡。
<3>孵育24h后，戴上手套，对样品使用区域进行揉搓，揉搓两分钟后，添加0.5 mL清洗液（0.1% Triton X-100）至供给室中，吹打清洗皮肤表面脱落的角质细胞。
<4>将清洗液转移至1.5 mL离心管中，备用。
<5>显微拍照：将装有清洗液（0.1% Triton X-100）的1.5 mL离心管放置在迷你混合仪（MIX-2500）上，以最大转速振荡2分钟，然后取清洗液点在细胞计数板上，将细胞计数板放在倒置显微镜下在10×放大倍数下进行拍照观察。
总蛋白含量检测：
<1>将收集的清洗液放入高速离心机中，15000 rpm，离心10 min，弃去上清液，将沉淀用0.5 mL去离子水重悬。
<2>将步骤<1>重悬后的液体中添加25 μL NaOH（12 M）溶液，水浴（100℃）30 min裂解角质细胞，添加25 μL浓HCl（12 M）中和裂解液。
<3>根据BCA蛋白测定试剂盒说明书进行总蛋白含量检测。
结果判定：
将洗脱下来的角质细胞进行裂解，检测蛋白含量，裂解液中的总蛋白含量与脱落角质细胞数成正比，总蛋白含量越高说明洗脱下来的角质细胞越多，说明样品有去角质功效。
结果统计分析：
应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
实验结果如表6和图6所示，利用离体皮肤模型检测总蛋白浓度的平均值发现，与5%的杏仁酸或2%的水杨酸相比，3%的滤液具有更强的角质剥落的作用，甚至比10%的水杨酸的角质剥脱效果强。
表6
验证例3 抗衰功效
（1）、基于3D表皮皮肤模型下的DNA损伤修护&表皮萎缩
机体接触外源性的UV照射时，会发生DNA损伤，该损伤可诱导机体衰老，若损伤没有得到及时的修复，会造成机体的衰老。
表7
其中：样品组中，溶胞和滤液+溶胞为对比例，滤液+溶胞中，滤液占比50%，溶胞占比50%。
1）测试方法
模型给药：
<1>根据测试分组，将模型转移到6孔板中（提前添加0.9 mL相应分组的EpiGrowth培养液），在6孔板上标注测试组编号。
<2>按表7所示分组对需要进行UVB辐照的组别进行UVB辐照（辐照剂量为600mJ/cm2），辐照后，将样品工作液均匀分布于模型表面，置37℃、5%CO2继续孵育24h。
<3>孵育结束后，用无菌PBS缓冲液清洗模型表面残留的受试物。
组织形态测试：
取用于组织形态检测的模型，用4%的多聚甲醛进行固定处理24h后，进行H&E染色检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。
免疫组化检测：
取用于检测的模型，用4%的多聚甲醛进行固定处理24h后，进行免疫组化检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。
抑制率/下调率计算：
抑制率/下调率（%）=（阴性对照组-样品）/阴性对照组×100%
结果统计分析：
应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
测试结果：
①CPD：
表8 CPD阳性细胞率
由表8可知，CPD阳性细胞（数值越小越好），5%滤液的CPD阳性细胞率小于相同浓度的溶胞和滤液+溶胞。
表9 CPD荧光强度统计
由表9可知，5%滤液CPD荧光强度下调率好于5%溶胞和5%二裂酵母。
②表皮萎缩：
表10
由表10和图7所示，滤液5%Sunburn Cells 抑制率与视黄醇0.1%相当，高于相同浓度的其他样品。
（2）、基于成纤维细胞的抗衰效果测试
表11
其中：样品组中，溶胞和滤液+溶胞为对比例，滤液+溶胞中，滤液占比50%，溶胞占比50%。
1）测试方法
细胞接种：细胞复苏后，待铺板率达到60%左右时，接种细胞至6孔板，37℃、5%CO2中孵育过夜。
给药：待6孔板中细胞铺板率达到40%~60%时，进行分组给药，每组设3个复孔。阳性对照组每孔加入2 mL含有TGF-β1的培养液，空白对照组每孔加入2 mL培养液，样品组每孔加入2 mL含有相应浓度待测样品的培养液。给药完成后将6孔板放置在CO2培养箱中培养24h。
收集细胞：孵育结束后，弃去旧液，PBS清洗两次，每孔加入1 mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。
基因表达检测：提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
上调率计算：上调率（%）=（样品组-空白对照组）/空白对照组 ×100%。
结果统计分析：应用软件作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
2）测试结果
①COL I
表12
实验结果如表12所示，滤液可显著上调I型胶原蛋白基因的表达。
②COL III
表13
实验结果如表13所示，滤液可显著上调III型胶原蛋白基因的表达。
③COL IV
表14
实验结果如表14所示，滤液对COL IV的上调率高于滤液+溶胞。
④COL VII
表15
实验结果如表15所示，滤液对VII型胶原蛋白基因的上调率高达116%。
⑤VCAN
表16
实验结果如表16所示，滤液可明显上调蛋白聚糖相关基因VCAN的表达。
弹性蛋白
表17
实验结果如表17所示，只有滤液可显著上调弹性蛋白的表达。
纤连蛋白
表18
实验结果如表18所示，滤液可以显著上调纤连蛋白的表达。
HAS1
表19
实验结果如表19所示，只有滤液可上调透明质酸合成酶HAS1的表达。
（3）、基于UVA辐照成纤维细胞的测试
1）测试方法-特殊给药（UVA连续辐照）
表20
表21
细胞接种：细胞复苏后，待铺板率达到60%左右时，接种细胞至6孔板，37℃、5%CO2中孵育过夜。
给药：待6孔板中细胞铺板率达到50%~60%时，对有UVA辐照的组别进行30 J/cm2的UVA辐照，辐照结束后，进行分组给药，每组设3个复孔。阳性对照组每孔加入2 mL含有TGF-β1的培养液，空白对照组和阴性对照组每孔加入2 mL培养液，样品组每孔加入2 mL含有相应浓度待测样品的培养液。给药完成后将6孔板放置在CO2培养箱（37℃、5%CO2）23/52中培养24h。重复上述操作3次。
ELISA测试：孵育结束后，收集细胞培养上清液于离心管中，于-80℃冰箱冷冻保存，根据ELISA试剂盒的操作说明书进行检测分析。
基因表达检测：孵育结束后，1 mL/孔PBS缓冲液清洗两次，每孔加入1 mL RNAisoPlus，吹打裂解细胞后，收样。提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
上调率和下调率计算：
上调率=（样品组-阴性对照组）/阴性对照组×100%
下调率=（阴性对照组-样品组）/阴性对照组×100%
结果统计分析：应用GraphPad Prism Program软件作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
其中：*表示差异显著，**表示差异极显著。
样品组中，溶胞和滤液+溶胞为对比例。
测试结果：
①NF-κB PCR
表22
实验结果如表22所示，滤液抑制炎症信号通路相关基因NF-κB的表达高于其他样品组。
②p21 PCR
表23
实验结果如表23所示，滤液可显著下调衰老相关基因p21的表达。
③p16 PCR
表24
实验结果如表24所示，滤液可显著下调p16基因的表达。
2）测试方法-常规给药
表25
细胞接种：细胞复苏后，待铺板率达到60%左右时，接种细胞至6孔板，CO2培养箱（5%CO2）中孵育过夜。
给药：根据表25测试分组，待6孔板中细胞铺板率达到40%~60%时，进行分组给药，每组设3个复孔。样品组每孔加入2 mL含有相应浓度待测样品的培养液，空白对照组和阴性对照组每孔加入2 mL培养液，阳性对照组每孔加入2 mL含有TGF-β1的培养液。给药完成后将6孔板放置在CO2培养箱（37℃、5%CO2）中培养24h。
UVA辐照：根据表25的分组，除空白对照组外，其余组均进行UVA辐照（30J/cm2）。辐照结束后，置于CO2培养箱中继续培养24h。
ELISA测试：孵育结束后，收集细胞培养上清液于离心管中，置于-80℃冰箱冷冻保存，根据ELISA试剂盒的操作说明书进行检测分析。
基因表达检测：孵育结束后，1 mL/孔PBS清洗两次，每孔加入1 mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收细胞。提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
上调率和下调率计算：
上调率=（样品组-阴性对照组）/阴性对照组×100%
下调率=（阴性对照组-样品组）/阴性对照组×100%
结果统计分析：应用GraphPad Prism Program软件作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
其中：*表示差异显著，**表示差异极显著。
样品组中，溶胞和滤液+溶胞为对比例。
测试结果：
①TIMP-1 PCR
表26
实验结果如表26所示，滤液可显著提升基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1的表达，且好于溶胞以及滤液+溶胞。
（4）基于UVA和UVB联合辐照离体皮肤组织的测试
表27
其中：滤液+溶胞中，滤液占比50%，溶胞占比50%。
表28
其中：滤液+溶胞中，滤液占比50%，溶胞占比50%。
1）测试方法
组织处理：将获得的新鲜皮肤组织浸入75%酒精中，清洗30s，再使用无菌的PBS缓冲液清洗三次；结束后，将皮肤切成24±2 mm2的组织块，真皮面向下，表皮面向上，放入培养模具中，然后将培养模具转入6孔板中，每孔加入3.7 mL培养液，CO2培养箱（37℃，5%CO2）中培养，每天换液。
给药：上述离体皮肤组织培养2天后，参照表27和表28的测试分组及相应处理条件，开始进行辐照和给药；辐照剂量为UVA（30J/cm2）和UVB（50mJ/cm2），连续辐照4天，每次辐照完后更换新的培养液，并进行给药处理，阳性对照（VC+VE）采用液下给药的方式，待测样品采用表面给药的方式，每组3个重复。连续辐照4天后，将离体皮肤组织继续培养3天，在此期间不进行辐照，只样品给药。
胶原纤维检测：给药结束后的皮肤组织采用4%的多聚甲醛固定，组织包埋，切片后Masson染色，回收切片结果，使用显微镜拍照，使用Image-ProⓇPlus图像处理软件进行分析。
免疫组化检测：根据免疫组化具体操作步骤进行检测。
免疫荧光检测：根据免疫荧光具体操作步骤进行检测。
提升率计算：
提升率=（样品组-阴性对照组）/阴性对照组×100%
结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
其中：*表示差异显著，**表示差异极显著。
样品组中，溶胞和滤液+溶胞为对比例。
2）测试结果
①透明质酸
表29
实验结果如表29、图8所示，滤液可提升透明质酸的表达，且提升率高达106.82%。
②XVII型胶原
表30
其中：*表示差异显著，**表示差异极显著。
实验结果如表30、图9所示，滤液可显著提升XVII型胶原的表达，且提升率远远高于对比例。
验证例4 细胞自噬-基于成纤维细胞的测试
（1）、LC3 II基因表达量
LC3-II的数量和自噬体的数量存在一一对应的关系，LC3-II被普遍认为是哺乳动物自噬体的标记物。自噬过程中，自噬体内膜上的LC3-II被溶酶体降解，在加入溶酶体抑制剂的情况下，通过免疫荧光比较自噬过程中LC3-II蛋白量的变化即可检测自噬流，反映自噬活性。
1）测试方法
细胞接种：细胞复苏后，待铺板率达到60%左右时，接种细胞至6孔板，CO2培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。
给药：根据表31测试分组，待6孔板中细胞铺板率达到40%~60%时，进行分组给药，每组设3个复孔。样品组每孔加入2 mL含有相应浓度待测样品的培养液，空白对照组每孔加入2 mL的培养液。给药完成后将6孔板放置在CO2培养箱中继续孵育24h。
收集细胞：培养24h后，弃去旧液，PBS缓冲液清洗两次，每孔加入1 mL RNAisoPlus，吹打裂解细胞后，收样。
基因表达检测：提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
上调率计算：上调率=（样品组-阴性对照组）/阴性对照组×100%
结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
2）测试结果
表31
其中：*表示差异显著，**表示差异极显著。
实验结果如表31所示，滤液可显著提升自噬发生相关基因LC3 II的表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取菌株接种培养后，获得种子液；所述菌株为长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)，其保藏编号为：CGMCC NO.27851；
S2：取所述种子液发酵后，离心，取上清液，获得所述微生物菌剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中所述接种的接种量为5%。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S2中所述离心的转速为3000 rpm，时间为30 min。
4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，S2中所述取上清液后还包括浓缩的步骤。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩的倍数为5倍。
6.权利要求1~5任意一项所述的制备方法制备得到的微生物菌剂，包括：乙醇酸17%、焦谷氨酸8.5%、柠檬酸6%、羟胺4.5%和山梨醇3%。
7.如权利要求6所述的微生物菌剂在制备抗衰老的化妆品中的应用。
8.如权利要求6所述的微生物菌剂在制备去角质的化妆品中的应用。
9.化妆品，其特征在于，包括如权利要求6所述的微生物菌剂以及化妆品领域可接受的助剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
婴儿双歧杆菌发酵液的化妆品功效性评价初探;马雪;中国优秀硕士学位论文全文数据库;20220531;第4页第1.2.2节至第8页第1.3.3节，第11页第2.2.1节，第62页第7.2.1节至第69页第8.2节，图7.4 *

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