CN117624379A - 一种人工蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于人工蛋白技术领域，具体涉及一种人工蛋白及其应用。本发明所述人工蛋白具有独特的体内外免疫活性，而且能够满足恢复患者免疫功能的需要；即所述人工蛋白结构既能识别衰竭的免疫细胞，又能增加侵袭性，恢复其功能；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
Description
技术领域
本发明属于人工蛋白技术领域，具体涉及一种人工蛋白及其应用。
背景技术
肿瘤的发生是由于机体细胞***过程中产生基因突变，突变细胞的生长失去控制的结果。如果肿瘤细胞不能在短期内被清除，持续的抗原刺激会逐渐造成肿瘤抗原特异性T细胞的功能性衰竭，形成对肿瘤的耐受，免疫***对肿瘤细胞不再敏感，造成肿瘤进一步的生长和扩散，最终形成癌症。由病毒感染导致慢性疾病的发生也是抗原特异性细胞衰竭的结果，众多研究已经证明了这个结论。
研究还表明，由于持续地抗原刺激，大部分肿瘤侵润性淋巴细胞(TIL)和抗病毒特异性T细胞都高表达免疫抑制性受体，处于功能性衰竭状态，减弱或丧失了特异性识别与杀伤抗原阳性靶细胞的功能。衰竭性免疫细胞丧失分泌功能性细胞因子的能力，如伽马干扰素(IFNγ)等。即使机体内存在大量的特异性免疫细胞，衰竭的免疫细胞也不能清除抗原阳性靶细胞。在表型上，衰竭性T细胞普遍高表达的免疫抑制检查点受体包括程序性死亡受体(PD-1)，程序性死亡配体(PD-L1/L2)，T细胞免疫球蛋白3(Tim-3)，细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和淋巴细胞活化基因3(Lag-3)等。这些信号通路的激活会通过诱导磷酸酶抑制磷酸化反应，消弱免疫细胞活化信号，抑制免疫细胞的扩增，降低效应免疫细胞的功能，促进T细胞的凋亡，引起免疫耐受。所以，激活这一类抗原特异性的免疫细胞群体，让他们重新恢复杀灭抗原阳性靶细胞的功能，才能清除肿瘤细胞或病毒感染细胞，最终达到治愈的目的。
抗体可以特异性地识别靶细胞表面的蛋白抗原，检查点抑制性抗体可以阻抑衰竭性细胞表面的免疫抑制性信号，例如通过PD-1抗体(Pembrolizumab和Nivolumab)与PD-1的结合防止抑制性信号的传导与激活，恢复衰竭性免疫细胞的功能，已经在临床上显示治疗癌症的临床效果，尤其是在部分患者身上得到了肿瘤完全消失和较长的临床效果持续性。但是，对缺乏效应细胞的患者临床效果还不理想，而且这种T细胞的恢复持续时间较短，患者体内的特异性免疫细胞又会很快重新回到衰竭状态。同时，只是阻断T细胞抑制信号不会导致免疫细胞数量的增加，而缺乏免疫效应细胞的患者基本上又不会产生临床效果，所以进一步限制检查点抗体的临床治疗效果。
细胞因子已经被批准用于癌症治疗，interleukin-2(IL-2)在1992年被批准用于结直肠癌治疗。但是，只有少部分患者受益，同时，大部分患者会有严重的副作用。高剂量的IL-2会造成患者休克甚至死亡，最后，应用IL-15***的临床试验也没有产生明显的临床效果。
CD137是T细胞受刺激后表达一个TNFR受体.CD137-CD137L的相互作用可以引起免疫细胞扩增和生存，增强免疫细胞功能，防止免疫细胞凋亡。在抗原刺激性细胞中，CD137能促进抗原递呈细胞的功能，增强对T细胞的激活作用。实验证明，CD137分子的激活，可以增加抗原特异性免疫细胞的活性。动物实验表明，只有CD137+的免疫细胞才有控制肿瘤生长的作用。近几年，CD137+T细胞控制肿瘤患者恶化得到进一步证明，其在肿瘤微环境中的表达可能受到PD-1抑制而活性降低。临床研究表明，CD137在淋巴细胞中的表达与节直肠癌患者的生存成正相关。再者，在肺癌患者中，CD137+细胞的减少和患者的生存呈反向关系。同时，CD8+CD137+阳性T细胞的比例与癌症患者的生存率呈明显正相关性，高比例的CD3+CD137+PD1+免疫细胞明显减少患者恶化的机率。
综合上述证明，截止目前，本领域中还没有一种既能针对性地识别衰竭性免疫细胞，又能增加免疫细胞功能的蛋白药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工蛋白及其应用，所述人工蛋白既能够衰竭性免疫细胞又能增强免疫细胞的功能。
本发明提供了一种人工蛋白，所述人工蛋白包括识别功能区、激活功能区和连接所述识别功能区和激活功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别功能区的C端与所述激活功能区的N端通过非功能性氨基酸片段进行连接；
所述识别功能区包括PD-1单链抗体，所述PD-1单链抗体的氨基酸如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述激活功能区包括细胞因子IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。
优选的，所述细胞因子IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述细胞因子IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述细胞因子IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或与SEQ ID NO.4所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述细胞因子IL-21的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或与SEQ ID NO.5所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
优选的，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述人工蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了上述技术方案所述人工蛋白在制备恢复免疫细胞功能的药物中的应用。
优选的，所述免疫细胞包括T细胞和/或NK细胞。
优选的，所述药物包括同时识别衰竭性免疫细胞和/或增强免疫细胞功能的药物。
优选的，所述药物包括治疗癌症和/或慢性病毒感染的药物。
优选的，所述癌症包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、头颈部鳞癌、膀胱癌和肺癌中的一种或多种。
本发明还提供了一种恢复免疫细胞功能的药物，所述药物包括上述技术方案所述的人工蛋白。
有益效果：
本发明提供了一种人工蛋白，所述人工蛋白包括识别功能区、激活功能区和连接所述识别功能区和激活功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别功能区的C端与所述激活功能区的N端通过非功能性氨基酸片段进行连接；所述识别功能区包括PD-1单链抗体，所述PD-1单链抗体的氨基酸如SEQ ID NO.1所示；所述激活功能区包括细胞因子IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。本发明所述人工蛋白具有独特的体内外免疫活性，而且能够满足恢复患者免疫功能的需要；即所述人工蛋白结构既能识别衰竭的免疫细胞，又能增加侵袭性，恢复其功能；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1～实施例4中重组融合人工蛋白的电泳检测图；
图2为实施例1和对照组中重组融合人工蛋白对人T细胞体外培养的活性及功能测定结果图；
图3为实施例2～实施例4中重组融合人工蛋白对人T细胞体外培养的活性及功能测定结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种人工蛋白，所述人工蛋白包括识别功能区、激活功能区和连接所述识别功能区和激活功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别功能区的C端与所述激活功能区的N端通过非功能性氨基酸片段进行连接；
所述识别功能区包括PD-1单链抗体，所述PD-1单链抗体的氨基酸如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述激活功能区包括细胞因子IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。
在本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具体为：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS。本发明所述识别功能区识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是具有共抑制性功能的免疫检查点PD-1。此类受体基因在免疫细胞表面会过度表达，此信号通路的活化会导致免疫细胞的衰竭和功能丧失。
在本发明中，所述细胞因子IL-2的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，或与SEQID NO.2所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具体为：APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP KLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT。
本发明所述细胞因子IL-7的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ IDNO.3所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具体为：DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNN EFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTIL LNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH。
本发明所述细胞因子IL-15的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示，或与SEQ IDNO.4所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具体为：GIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQS MHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANN SLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
本发明所述细胞因子IL-21的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，或与SEQ IDNO.5所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；所述SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列具体为：QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPE DVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQK HRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS。
本发明细胞因子部分与其表达在T细胞和NK细胞表面的受体结合，从而发挥激活和增加侵袭性的功能。细胞因子或以突变体形式存在，突变体是指在不改变其基本功能的前提下，通过氨基酸序列突变或只是利用功能区多肽，增强或减弱其对非目细胞的作用。例如，通过细胞因子上氨基酸序列的改变，突变体可能降低或增加与T调节性细胞的激活，减少对非靶细胞及组织器官的作用，从而减少临床应用的副作用。
在本发明中，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.6所示，具体为：APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。本发明所述非功能性氨基酸片段起到连接识别功能区蛋白和激活功能区蛋白的作用。
在本发明中，所述人工蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10所示。本发明所述SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具体为：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQK PGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT；所述SEQID NO.8所示的氨基酸序列具体为：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTS GYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH；所述SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具体为：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAP RLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS；所述SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列具体为：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSY LHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS。在本发明中，所述SEQ IDNO.7由SEQ ID NO.1所示的PD-1单链抗体、SEQ ID NO.6所示的非功能性氨基酸片段、linker“GGGS”和SEQ ID NO.2所示的细胞因子IL-2顺次连接组成；所述SEQ ID NO.8由SEQID NO.1所示的PD-1单链抗体、SEQ ID NO.6所示的非功能性氨基酸片段、linker“GGGS”和SEQ ID NO.3所示的细胞因子IL-7顺次连接组成；所述SEQ ID NO.9由SEQ ID NO.1所示的PD-1单链抗体、SEQ ID NO.6所示的非功能性氨基酸片段、linker“GGGS”和SEQ ID NO.4所示的细胞因子IL-15顺次连接组成；所述SEQ ID NO.10由SEQ ID NO.1所示的PD-1单链抗体、SEQ ID NO.6所示的非功能性氨基酸片段、linker“GGGS”和SEQ ID NO.5所示的细胞因子IL-21顺次连接组成。
本发明所述SEQ ID NO.7～10所示的人工蛋白中的识别功能区识别衰竭性免疫细胞且是利用PD-1单链抗体识别衰竭性免疫细胞表型的受体PD-1；激活功能区采用IL-2、IL-7、IL-15或IL-21来激活免疫细胞，进而达到识别衰竭性免疫细胞和增强免疫细胞的功能的作用。
本发明还提供了上述技术方案所述人工蛋白在制备恢复免疫细胞功能的药物中的应用。在本发明中所述免疫细胞优选包括T细胞和/或NK细胞，更优选为T细胞或NK细胞；所述T细胞优选包括特异性T细胞。
本发明所述药物优选包括同时识别衰竭性免疫细胞和/或增强免疫细胞功能的药物，进一步包括同时识别衰竭性免疫细胞和增强免疫细胞功能的药物，更优选包括同时阻断免疫细胞PD-1表达和增加CD137表达的药物。本发明所述增强细胞功能优选包括增加免疫细胞的侵袭功能。
本发明所述药物优选包括治疗癌症和/或慢性病毒感染的药物，更优选为治疗癌症和慢性病毒感染的药物。本发明所述癌症优选包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、头颈部鳞癌、膀胱癌和肺癌中的一种或多种。
本发明还提供了一种恢复免疫细胞功能的药物，所述药物包括上述技术方案所述的人工蛋白。本发明所述人工蛋白优选为所述药物中的有效成分。本发明所述药物优选单独使用，或与其他药物或治疗方法联合使用；所述其他药物优选包括化疗药物、靶向药物或抗体药物；所述治疗方法优选包括细胞治疗法活放射疗法。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人工蛋白结构的基因构建和生产纯化，步骤如下：
1)根据人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素2(SEQ ID NO.2)的N端氨基酸序列，通过基因对应的碱基合成，酶切和进一步克隆，通过非功能人工构建氨基酸(SEQ IDNO.6)和linker“GGGS”将人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素2(SEQ ID NO.2)的N端氨基酸序列连接，组成人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.7)，并将编码人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.7)的核苷酸序列克隆到pcDNA3.1(-)载体中。
2)将蛋白结构的表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。转染的细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，一周后取上清液，进一步通过ProteinA的亲和层析纯化，最后纯化的蛋白为设计的重组融合人工蛋白。
实施例2
1)根据人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素7(SEQ ID NO.3)的N端氨基酸序列，通过基因对应的碱基合成，酶切和进一步克隆，通过非功能人工构建氨基酸(SEQ IDNO.6)和linker“GGGS”将人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素7(SEQ ID NO.3)的N端氨基酸序列连接，组成人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.8)，并将编码人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.8)的核苷酸序列克隆到pcDNA3.1(-)载体中。
2)同实施例1。
实施例3
1)根据人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素15(SEQ ID NO.4)的N端氨基酸序列，通过基因对应的碱基合成，酶切和进一步克隆，通过非功能人工构建氨基酸(SEQID NO.6)和linker“GGGS”将人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素15(SEQ ID NO.4)的N端氨基酸序列连接，组成人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.9)，并将编码人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.8)的核苷酸序列克隆到pcDNA3.1(-)载体中。
2)同实施例1。
实施例4
1)根据人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素21(SEQ ID NO.5)的N端氨基酸序列，通过基因对应的碱基合成，酶切和进一步克隆，通过非功能人工构建氨基酸(SEQID NO.6)和linker“GGGS”将人PD-1单链抗体(SEQ ID NO.1)C端和白介素21(SEQ ID NO.5)的N端氨基酸序列连接，组成人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.10)，并将编码人工蛋白结构氨基酸序列(SEQ ID NO.8)的核苷酸序列克隆到pcDNA3.1(-)载体中。
2)同实施例1。
对实施例1～4中的制备得到的重组融合人工蛋白进行电泳检测，结果如图1所示，其中在图1中泳道1～4依次表示实施例1～实施例4中重组融合人工蛋白的展示结果。通过图1中的电泳检测确认纯化的蛋白结构分子量大约为67kD，证明依据本发明设计的重组人工蛋白结构可以通过CHO细胞生产。最后用分光光度计测试蛋白浓度并稀释在PBS中，用作进一步体内外的活性测试及功能研究。
应用例1
实施例1～实施例4中重组融合人工蛋白对人T细胞体外培养的活性及功能测定，步骤如下：
人外周血经利用淋巴细胞密度梯度离心法(Ficoll)分离纯化成PBMC部分，然后在24孔板中用X-Vivo15培养基稀释至细胞密度为5×106/mL，加入试验蛋白至最终浓度为100ng/mL；其中试验蛋白分别为实施例1～实施例4中的重组融合人工蛋白。然后置于37℃、5％CO2孵箱中培养72h，细胞收集后用相对应的流式抗体(Biolegend)染色(相对应的PD-1抗体为APC和CD137抗体为PE)，洗涤后用流式细胞仪进行表型测定和数据分析，结果如图2～3所示，在图2～3中纵向表示PD-1的阳性率，横向表示CD137的阳性率，且图2中从左到右依次表示Control组和实施例1中的重组融合人工蛋白，图3中从左到右依次表示实施例2～4中的重组融合人工蛋白。
图2～3中显示，与未加蛋白组的对照(Control)相比，4种人工蛋白结构处理都能显著增加T细胞中CD137的表达，具体的对照组中CD137的阳性率仅为4.06％，而添加实施例1～4中重组融合人工蛋白的试验组中CD137的阳性率依次为21.2％、19.8％、11.3％和25.7％。同时，与未加蛋白组对照(Control)相比(7.64％)，4种蛋白结构培养后，PD-1的表达都明显降低，具体的对照组中PD-1的阳性率高达7.64％，而添加实施例1～4中重组融合人工蛋白的试验组中PD-1的阳性率仅依次为0.14％、0.05％、0.03％和0.02％。试验证明，依据本发明设计的重组蛋白结构不但能够激活人T细胞，增加CD137分子的表达，还能够屏蔽细胞表面PD-1+的信号，达到设计目的蛋白结构而产生的活性。
由上述实施例可知，本发明所述的人工蛋白结构，既能识别衰竭性免疫细胞，又能激活和增加免疫细胞的侵袭性，恢复免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能。蛋白结构具有非蛋白结构具有的功能，既能激活免疫细胞，又能屏蔽PD-1的信号，诱导免疫细胞肿瘤的亲润。由于肿瘤的发生与扩散和慢性病毒感染是免疫细胞衰竭与免疫***耐受的结果，而恢复衰竭性免疫细胞的功能和扩增免疫细胞的数量可以增强机体抗肿瘤和抗慢性病毒感染的能力，由此类推，上述蛋白结构的临床应用可以抑制肿瘤生长和控制病毒感染，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
上述人工蛋白为双功能重组蛋白结构，其可单独应用或与化疗，靶向药物，抗体药物，细胞治疗及放射疗法组成联合应用，用于制备治疗因免疫细胞衰竭而引起的疾病的药物，例如治疗癌症药物和治疗慢性病毒感染的药物等。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种人工蛋白，其特征在于，所述人工蛋白包括识别功能区、激活功能区和连接所述识别功能区和激活功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别功能区的C端与所述激活功能区的N端通过非功能性氨基酸片段进行连接；
所述识别功能区包括PD-1单链抗体，所述PD-1单链抗体的氨基酸如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述激活功能区包括细胞因子IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。
2.根据权利要求1所述的人工蛋白，其特征在于，所述细胞因子IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述细胞因子IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述细胞因子IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或与SEQ ID NO.4所示氨基酸具有相同功能的突变体序列；
所述细胞因子IL-21的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或与SEQ ID NO.5所示氨基酸具有相同功能的突变体序列。
3.根据权利要求1或2所述的人工蛋白，其特征在于，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的人工蛋白，其特征在于，所述人工蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
5.权利要求1～4任一项所述人工蛋白在制备恢复免疫细胞功能的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞和/或NK细胞。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物包括同时识别衰竭性免疫细胞和/或增强免疫细胞功能的药物。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗癌症和/或慢性病毒感染的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、头颈部鳞癌、膀胱癌和肺癌中的一种或多种。
10.一种恢复免疫细胞功能的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1～4任一项所述的人工蛋白。
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