CN117616044A - 抗Her3抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗Her3抗体及其应用。所述抗Her3抗体包含轻链和重链,所述轻链中轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13中的第1‑113位所示,所述重链中重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3中的第1‑117位所示。本发明的抗Her3抗体的表达量达到现有抗体的3~5倍,同时保持了与靶点Her3的高亲和力。
Description
本发明属于生物医药领域,尤其涉及一种抗Her3抗体及其应用。
Her(Human epidermal growth factor receptor,人表皮受体)家族由4个结构相近、功能相关的RTK组成,分别为Her1(EGFR)、Her2、Her3和Her4,受体间的二聚化是Her家族发挥其功能及信号转导活性的基本条件。受体二聚化后,诱导胞内高度保守的激酶残端发生交联磷酸化,进而招募并激活下游蛋白,引起信号级联反应,调节细胞增殖、生存、迁移、发生、转移等过程。Her3虽可与神经调节蛋白(Neuregulin,NRG)结合,但由于其缺乏内在的酪氨酸激酶活性,只能通过与其他受体形成异二聚体发挥功能。相反,Her2虽具有酪氨酸激酶活性,但并无相应的配体与之结合。Her2胞外区结构为天然的开放构象,此构象使Her2无需配体激活即可与其他受体发生二聚化,因此Her2是Her3首选的二聚化伴侣。
Her2与Her3形成异二聚体,可直接激活PI3K/AKT通路,PI3K/AKT通路是促进肿瘤细胞增殖的最重要的信号通路,参与调节基因表达、细胞代谢、细胞骨架重排等过程,因此Her2-Her3异二聚体被认为是Her家族中信号传导能力最强的二聚体。研究表明,直接或间接抑制PI3K/AKT通路的药物可导致Her3转录增加,通过PI3K/AKT负反馈调节使Her3表达上调及活化,重新激活下游通路而产生耐药,该现象与抗Her2及抗EGFR靶向治疗的耐药相关。此外,Her3的主要配体NRG1可通过旁分泌和自分泌途径参与Her3的信号转导等进而诱导Her3通路活化,也可能参与Her家族靶向治疗的耐药。此外,Her3还可与其他Her家族成员如EGFR,以及非Her家族成员如MET、IGF-1R形成二聚体,参与肿瘤的发生、发展。鉴于Her3可与其他靶点形成异二聚体传递最强的PI3K/AKT,并且由于缺乏酪氨酸激酶活性,因此Her3的治疗药物主要以Her3的胞外区为靶点开发抗体类药物。
抗体类药物的开发,其抗体的表达对于生产成本的控制至关重要,影响抗体基因在哺乳动物细胞高效表达的因素主要包括抗体基因本身的序列、抗体基因在宿主染色体上的整合位点、抗体基因的拷贝数、转录翻译水平、宿主细胞的选择和修饰以及轻、重链基因的均衡表达等。其中,抗体序列中除重链CDR3以外的五个CDR,在序列和结构上具 有固定的特点,表现为特定的CDR长度,并且抗体序列在CDR或Framework区存在一些保守的位点,这些位点对于维持CDR/loop区的构象和功能至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术缺少高表达量的抗Her3抗体的缺陷,提供一种抗Her3抗体及其应用。本发明的抗Her3抗体的表达量达到现有抗体的3~5倍,同时保持了与靶点Her3的高亲和力。
为了提高抗体的表达量,节约生产成本,发明人尝试对抗体的各个方面进行改造。例如,发明人对现有的单克隆抗体进行密码子优化、更换信号肽、更换宿主细胞、调整稳定转染条件等,试图改善抗体表达。但是,经过前述改造的抗体在宿主细胞中的表达量仍然达不到预期标准。在大量试验中,发明人经过层层筛选,意外在轻重链组合交叉转染中发现抗体的轻链氨基酸序列会对抗体的表达量具有关键性影响。基于该研究结果,发明人对抗体的轻链进行了改造,在轻链的突变体中筛选得到具有高表达量、同时维持与Her3结合活性的抗体,其表达量得到显著改善,相对改造前的抗体提高了3~5倍。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面提供一种抗Her3抗体,所述抗Her3抗体包含轻链和重链;
所述轻链中轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13中的第1-113位所示,所述重链中重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3中的第1-117位所示。
在本发明一些实施方案中,所述轻链还包含轻链恒定区,所述重链还包含重链恒定区。
本发明中,所述轻链恒定区较佳地为人源抗体或小鼠抗体的轻链恒定区;更佳地为人源抗体的κ或λ链的恒定区。
本发明中,所述重链恒定区较佳地为人源抗体或小鼠抗体的重链恒定区;更佳地为人源抗体IgG1、IgG2、IgG3或者IgG4的重链恒定区。
在本发明一些实施方案中,所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在本发明一些实施方案中,所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中,所述的抗Her3抗体的重链可为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区发生了一个或多个氨基酸残基的突变(缺失、取代或添加),且与如序列表SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%以上的同源性;优选为至少85%的同源性,更优选为至少90%的同源性,再优选为至少95%、96%、97%或98%的同源性,最优选为至少99%的同源性。
本发明的第二方面提供一种融合蛋白,所述融合蛋白包含如第一方面所述的抗Her3抗体。
本发明的第三方面提供一种分离的核酸,所述核酸编码如第一方面所述的抗Her3抗体或第二方面所述的融合蛋白。
在本发明一些实施方案中,编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:14中的第1-339位所示。
在本发明一些实施方案中,所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6中的第1-351位所示。
在本发明一些实施方案中,编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在本发明一些实施方案中,编码所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明的第四方面提供一种重组表达载体,所述重组表达载体包含如第三方面所述的核酸。
本发明的第五方面提供一种抗体偶联药物,所述抗体偶联药物包含如第一方面所述的抗Her3抗体或者如第二方面所述的融合蛋白。
本发明的第六方面提供一种双特异性抗体分子,所述双特异性抗体分子包含如第一方面所述的抗Her3抗体或者如第二方面所述的融合蛋白。
本发明的第七方面提供一种嵌合抗原受体T细胞,所述嵌合抗原受体T细胞包含如第一方面所述的抗Her3抗体或者如第二方面所述的融合蛋白。
本发明的第八方面提供一种药物组合物,所述药物组合物包含如第一方面所述的抗Her3抗体、如第二方面所述的融合蛋白、如第五方面所述的抗体偶联药物、如第六方面所述的双特异性抗体分子、或者如第七方面所述的嵌合抗原受体T细胞及其药学上可接受的盐、溶剂合物、或者其药学上可接受的盐的溶剂合物。
在本发明一些实施方案中,所述药物组合物还包括药用辅料。
本发明的第九方面提供一种试剂盒,所述试剂盒包含如第一方面所述的抗Her3抗体或者如第二方面所述的融合蛋白。
本发明的第十方面提供一种套装药盒,所述套装药盒包括药盒A和药盒B;
其中,所述药盒A包括如第一方面所述的抗Her3抗体或者如第八方面所述的药物组合物;所述药盒B包括其他治疗剂。
在本发明一些实施方案中,所述药盒A与药盒B的施用时间不分先后或者先施用所述药盒A。
本发明的第十一方面提供一种给药装置,所述给药装置包含:(1)用于对有需要的 受试者施用如第八方面所述的药物组合物的输注模块,以及(2)任选的药效监控模块。
本发明的第十二方面提供一种治疗/预防疾病的方法,所述方法包括向有需要的患者施用有效剂量的如第一方面所述的抗Her3抗体、如第二方面所述的融合蛋白、如第五方面所述的抗体偶联药物、如第六方面所述的双特异性抗体分子、如第七方面所述的嵌合抗原受体T细胞、如第八方面所述的药物组合物、或施用如第十一方面所述的给药装置。
在本发明一些实施方案中,所述疾病为肿瘤;
在本发明一些较佳的实施方案中,所述肿瘤为Her3阳性肿瘤。
在本发明一些更佳的实施方案中,所述Her3阳性肿瘤选自Her3阳性肺癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、***癌和胃癌中的一种或多种。
本发明的第十三方面提供一种如第一方面所述的抗Her3抗体、如第二方面所述的融合蛋白、如第五方面所述的抗体偶联药物、如第六方面所述的双特异性抗体分子、如第七方面所述的嵌合抗原受体T细胞、或者如第八方面所述的药物组合物在制备Her3蛋白抑制剂、或者制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
所述肿瘤的优选限定如第十二方面所述。
本发明中,所述***癌可为本领域通常理解的***癌,***癌细胞例如含有22Rv1细胞和/或LNCaP细胞。
本发明中,所述结直肠癌可为本领域通常理解的结直肠癌,结直肠癌细胞例如含有SW620细胞。
本发明中,所述肺癌可为本领域通常理解的肺癌,肺癌细胞例如含有NCI-H820细胞或HCC827细胞。
本发明中,所述卵巢癌可为本领域通常理解的卵巢癌,卵巢癌细胞例如含有OVCAR-8细胞。
本发明中,所述乳腺癌可为本领域通常理解的乳腺癌,乳腺癌细胞例如含有SK-BR-3细胞。
除非另有说明,在本发明说明书中出现的以下术语具有下述含义:
所述药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物,还可以提供方法,使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出,或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂,或者提供某种功能,例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可包括下列辅料中的一种或多种:缓冲剂、螯合剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂、赋形剂和表面活性剂着色剂、矫味剂和甜味剂。
术语“药学上可接受的”是指盐、溶剂、辅料等一般无毒、安全,并且适合于患者使用。所述的“患者”优选哺乳动物,更优选为人类。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的盐。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时,可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于:锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、锌盐、铋盐、铵盐、二乙醇胺盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时,可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。所述的药学上可接受的酸包括无机酸,所述无机酸包括但不限于:盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、磷酸、亚磷酸、硫酸等。所述的药学上可接受的酸包括有机酸,所述有机酸包括但不限于:乙酸、丙酸、草酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、异烟酸、酸式柠檬酸、油酸、单宁酸、泛酸、酒石酸氢、抗坏血酸、龙胆酸、富马酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、双羟萘酸(即4,4’-亚甲基-双(3-羟基-2-萘甲酸))、氨基酸(例如谷氨酸、精氨酸)等。当本发明的化合物中含有相对酸性和相对碱性的官能团时,可以被转换成碱加成盐或酸加成盐。具体可参见Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977)、或、Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(P.Heinrich Stahl and Camille G.Wermuth,ed.,Wiley-VCH,2002)。
术语“溶剂合物”是指本发明化合物与化学计量或非化学计量的溶剂结合形成的物质。溶剂合物中的溶剂分子可以有序或非有序排列的形式存在。所述的溶剂包括但不限于:水、甲醇、乙醇等。
术语“治疗”或它的同等表达当用于例如癌症时,指用来减少或消除患者体内癌细胞数目或减轻癌症的症状的程序或过程。癌症或另外的增生性障碍的“治疗”不一定指癌症细胞或其它障碍会实际上被消除,细胞或障碍的数目会实际上被减少或者癌症或其它障碍的症状会实际上被减轻。通常,即使只具有低的成功可能性也会进行治疗癌症的方法,但是考虑到患者的病史和估计的生存预期,其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。
术语“预防”是指获得或发生疾病或障碍的风险降低。
在不违背本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
如无特殊说明,本发明中的室温是指20-30℃。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
本发明的抗Her3抗体具有高表达量,可达到现有抗体的3~5倍,同时保持了与靶点Her3的高亲和力,对表达Her3等的多种肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
图1为实施例2中2F8瞬转表达上清(2天)的SDS-PAGE检测纯化产物的表达量检测结果示意图。
图2为实施例2中2F8瞬转纯化产物的SDS-PAGE检测结果;
其中:A为6%非还原性SDS-PAGE,B为12%还原性SDS-PAGE。
图3为实施例2中调整轻链转染比例后2F8瞬转表达上清的12%还原性SDS-PAGE检测结果;
其中:A为转染2天,B为转染4天。
图4为实施例3中2F8与1A9轻、重链组合瞬转表达上清的12%还原性SDS-PAGE检测结果。
图5为实施例3中更换轻链信号肽的2F8瞬转纯化产物的6%非还原性SDS-PAGE检测结果。
图6为实施例3中更换轻链信号肽的2F8瞬转纯化产物的12%还原性SDS-PAGE检测结果。
图7为实施例4中2F8轻链突变体瞬转后表达上清的12%还原性SDS-PAGE检测结果示意图;
其中:A为瞬转3天,B为瞬转5天。
图8为实施例4中2F8轻链突变体瞬转5天后的纯化产物的12%还原性SDS-PAGE检测结果示意图;
其中:A为2F8轻链突变体瞬转,B为2F8Lm1重复瞬转。
图9为实施例5中3F5(上)与2F8-L(下)氨基酸序列Blast图。
图10为实施例6中FACS检测2F8及3F5在T-47D细胞上的结合分析结果示意图。
图11为实施例6中FACS检测2F8及3F5在MDA-MB-453细胞上的结合分析结果示意图。
图12为2F8与Her3-His重组蛋白的反应曲线图。
图13为3F5与Her3-His重组蛋白的反应曲线图。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
缩写说明:
PCR:聚合酶链式反应;
CHO:中国仓鼠卵巢细胞;
HTRF:均相时间分辨荧光。
实施例1 抗Her3抗体稳定表达细胞株的制备
如表1所示,本实施例选取高亲和力并特异性靶向Her3的单克隆抗体2F8,其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2F8的轻、重链核苷酸序列通过全基因合成(苏州金唯智生物科技有限公司),其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,其重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。通过EcoR I和Hind III(TAKARA,R3104S、R3101S)双酶切将轻、重链分别单独构建至表达载体pV81中(上海翊圣生物,pEE14.2),通过连接转化至Trans 1-T1感受态细胞(北京全式金生物,CD501-03)中,从中挑取克隆进行PCR鉴定并送检、测序确认,培养扩增阳性克隆进行质粒中抽,从而获得抗体轻链真核表达质粒2F8-L/pV81和抗体重链真核表达质粒2F8-H/pV81,轻、重链真核表达质粒比例1.5/1,通过电击转化至已适应悬浮生长的CHO细胞中(ATCC,CCL-61
TM),电转48小时后采用HTRF法(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,均相时间分辨荧光)测得平均表达量为1.8μg/mL,表达量较低。经过稳定转染筛选及亚克隆,从中挑选表达量TOP10的克隆进行培养评估,在发酵罐中经过14天fed-batch培养(基础培养基:Dynamis AGT Medium,Gibco;补料培养基:EfficientFeedC+,Gibco),最高表达量仅为1.2g/。综合以上,抗体2F8在宿主细胞CHO中表达量未达到预期目标。
表1. 2F8轻重链氨基酸和核苷酸序列
实施例2.抗Her3抗体表达优化
对于抗体表达问题,研究中尝试通过更换信号肽加密码子优化、更换宿主细胞以及调整稳定转染条件等技术方法,以期改善抗体表达。
向抗体2F8的氨基酸序列中加上不同的信号肽,利用三联体密码子编码原则,进行密码子优化,得到氨基酸序列相同、核苷酸不同的2种2F8轻、重链分子(2F8-L-new,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;2F8-H-new,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;2F8-L-2,其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示;2F8-H-2,其核苷酸序列如序列SEQ ID NO:8所示,具体如表2所示)。重新进行基因合成,并构建至表达载体pV81,将轻、重链进行组合(组合方式如表2所示),通过转染试剂293fectin(Invitrogen,12347019)转入HEK293细胞(中科院细胞库,GNHu43)中,转染体积20mL;转染2天后,取少量细胞培养上清,检测表达量;转染4天后收集细胞培养上清,上清体积为25mL,经一步Protein-A亲和纯化后,检测纯化产物表达量。检测结果如图1所示,结果显示HEK293瞬时转染2天,2F8的野生型和2种优化序列的表达量无明显差异。
表2. 2F8轻链核苷酸序列、重链核苷序列及组合方式
转染4天后,对2F8-new、2F8-1和2F8-2进行纯化、定量;其中2F8-new、2F8-1表达无明显差异,2F8-2表达稍高于2F8-1;抗体的基础表达量均偏低,约20μg/mL;蛋白纯化信息如表3所示;纯化产物6%非还原性SDS-PAGE检测结果如图2的A所示,12%还原性SDS-PAGE检测结果如图2的B所示,可见2F8分子轻链表达比例偏低。
表3. 2F8及FDA029瞬转表达上清纯化信息
调整2F8分子轻链转染比例整,将2F8-new的轻、重链质粒按正常转染比例以及轻链多加一倍的比例,通过转染试剂293fectin,共转入HEK293细胞中,转染体积20mL;转染2天和4天时,取少量细胞培养上清,检测表达量。瞬转细胞培养上清的检测结果如图3的A和B所示,增加轻链转染比例后,2F8-new的基础表达量没有改善。
将2F8-new的轻重链片段构建到新的表达载体中,命名为2F8-3,并电击转染至宿主细胞CHOK1SV(载体和细胞均源于Lonza),具有良好表达的抗体1A9(其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示;其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)作为***对照,培养基为CD CHO Medium(Gibco,10743029),表达结果如表5所示,实验组2F8-3在CHOK1SV中的表达量较原实验体系的2F8-new有所提升,但远低于***对照,表明抗体2F8属于难表达抗体。
表4. 1A9轻重链氨基酸序列
表5. 2F8稳定转染48小时表达量
抗体 | 培养基 | 48小时表达量(mg/L) | 备注 |
2F8-new | CD CHO Medium | 0.158 | / |
2F8-3 | CD CHO Medium | 0.327 | 实验组 |
1A9 | CD CHO Medium | 0.778 | ***对照 |
实施例3.交叉转染组合评价
将2F8分子轻、重链组合交叉转染,将2F8-new的轻、重链质粒及抗体1A9的轻、重链质粒进行组合(组合方式如表6所示),通过转染试剂293fectin,转入HEK293细胞中,转染体积20mL;转染2天后,取细胞培养上清检测表达量。瞬转细胞培养上清的检测结果如图4所示,与2F8-new相比,2F8的重链与1A9轻链组合表达明显增强,2F8的轻链与1A9重链组合表达没有改善,2F8的轻链对2F8的表达有关键性的影响。
表6. 2F8轻、重链与1A9轻、重链组合方式
更换2F8轻链信号肽;将2F8-new的轻链信号肽MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:11)更换为新的信号肽MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQ ID NO:12),通过转染试剂293fectin,转入HEK293细胞中,转染体积20mL;转染4天后收集细胞培养上清,上清体积为25mL,经一步Protein-A亲和纯化后,检测纯化产物表达量。更换轻链信号肽的2F8分子瞬转纯化产物的6%非还原性SDS-PAGE检测结果如图5所示,12%还原性SDS-PAGE检测结果如图6所示。更换轻链信号肽后,2F8的基础表达有轻微提高,但未得到明显改善。
实施例4.抗体序列分析
根据2F8分子轻链的序列特征,对其进行了3种轻链突变体的设计(Lm1、Lm2和Lm3),其氨基酸序列与核苷酸序列如表7所示。按实施例1相同方式进行载体构建,获得轻链突变体2F8-Lm1、2F8-Lm2和2F8-Lm3。
表7. 2F8分子突变体序列
2F8分子轻链突变体的转染
将2F8分子的轻链突变体、重链进行组合(组合方式如表8所示)通过转染试剂293fectin,转入HEK293细胞中,转染体积20mL;转染3天后,取少量细胞培养上清,检测表达量;转染5天后收集细胞培养上清,上清体积为25mL,经一步Protein-A亲和纯化后,检测纯化产物表达量。
表8 2F8轻链突变体组合方式
名称 | 重链 | 轻链 |
2F8-new | 2F8-H-new | 2F8-L-new |
2F8-m1 | 2F8-H-new | 2F8-Lm1 |
2F8-m2 | 2F8-H-new | 2F8-Lm2 |
2F8-m3 | 2F8-H-new | 2F8-Lm3 |
2F8轻链突变体转染后3天表达上清的12%还原性SDS-PAGE检测结果如图7的A所示,转染后5天表达上清的12%还原性SDS-PAGE检测结果如图7的B所示,上清纯化产物的12%还原性SDS-PAGE检测结果如图8的A所示,其中2F8-m1的表达量有明显提高,对其进行重复转染确认,转染后5天表达上清的12%还原性SDS-PAGE检测结果如图8的B所示,2F8-m1的表达明显得到改善,以SDS-PAGE的灰度分析及纯化后蛋白量计算,表达量提高约3-5倍;轻链突变体2F8-Lm1与2F8-L氨基酸差异如图9所示。
实施例5.位点改造抗体的表达制备
将2F8轻链突变体2F8-Lm1与重链2F8-H-new的组合,重命名为抗体3F5。使用ExpiCHO细胞瞬转2F8、3F5两个抗体,按照如下表9进行转染操作,转染体积每个摇瓶100mL,培养8天经HTRF检测表达量;结果显示3F5的瞬转表达量为2F8的2.9倍。
表9. 2F8和3F5瞬时转染
抗体3F5进行稳定细胞株筛选、亚克隆,从中挑选表达量高的细胞进行培养评估,发酵罐中经过14天fed-batch培养,3F5的表达量最高为3.3g/L;而2F8的表达量仅为1.2g/L,实现了在大规模培养下的表达提升。综合以上结果,抗体3F5表达量较抗体2F8有明显提高,满足项目抗体表达量预期。
实施例6.抗Her3抗体突变序列的功能分析
3F5突变体在T-47D细胞上的结合分析
利用FACS检测结合能力,首先按3×10
5~1×10
6密度收集T-47D细胞(中科院细胞库,TCHu 87),去上清;加入FACS染色缓冲液(Moregate,3827104)洗涤细胞一次, 再次离心细胞去上清,并使用2ml FACS重悬均分至2个1.5mL离心管中,冰浴封闭0.5小时,1000rpm离心处理5分钟,去上清;向细胞中加入100μL相应浓度梯度的3F5突变体(10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL、0.12μg/mL),冰浴孵育1h后,离心去上清,加入0.5mL/管FACS染色缓冲液1000rpm离心处理5min(4℃),去上清,重复两次。加入100μL荧光标记二抗(Thermo,A11013),冰浴孵育30min后,离心去上清,加入0.5mL/管FACS染色缓冲液1000rpm离心处理5min(4℃),去上清,重复两次;加入0.5mL PBS稀释液(上海双螺旋生物科技有限公司,P10033)重悬细胞,冰上避光放置;流式细胞仪检测荧光值。FACS检测结果如图10所示。结果显示,3F5与T-47D细胞有结合,且具有量效关系。在不同抗体浓度下,与亲本分子2F8结合能力无明显差异。
按照上述方法进行FACS检测的结果如图11所示,2F8Lm1与MDA-MB-453细胞(中科院细胞库,TCHu233)有结合,且具有良好的量效关系。在不同抗体浓度下,与亲本分子2F8结合能力无明显差异。
实施例7. 3F5突变体的亲和力分析
检测抗体2F8与3F5对Her3-His重组蛋白结合的亲和力,通过使用BLI的方法检测固化的抗体与Her3的结合动力学曲线,检测的方法参照仪器(Fortebio,Octet 96e)的使用说明进行,简言之,先用Loading Buffer/Sample dilution buffer(1×PBS,pH7.4,0.1%BSA+0.02%Tween-20)对AMC传感器平衡60s,得到Baseline 1。将待测抗体用Loading Buffer稀释成10μg/mL的浓度与平衡后的传感器进行结合,结合后的传感器再次用Loading Buffer进行再平衡,得到Baseline 2。然后把载有抗体的传感器至于用样品稀释液稀释为100~3.13nM的人Her3-His中结合90s,得到抗体与蛋白的结合曲线,如图12和图13所示。然后将结合有抗原的传感器再次置于Sample Dilution Buffer中解离180s,得到解离曲线。通过结合与解离曲线分别计算抗体与蛋白结合的k-on、k-off值,计算KD值,所得结果显示2F8与3F5对Her3-His重组蛋白的亲和力无差异,2F8亲和力为2.43E-09mol/L(以下表10中简写为M),3F5亲和力为2.53E-09mol/L,详细动力学参数如下表10所示。
表10. 2F8及2F8Lm1亲和力测定结果
样品名称 | 批号 | KD(M) | kon(1/Ms) | koff(1/s) |
2F8 | Elu-20200911 | 2.43E-09 | 1.47E+05 | 3.57E-04 |
3F5 | 20201214G | 2.53E-09 | 1.56E+05 | 3.93E-04 |
虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是本领域的技术人员应当理解,这些仅是举例说明,在不背离本发明的原理和实质的前提下,可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此,本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
Claims (15)
- 一种抗Her3抗体,其特征在于,所述抗Her3抗体包含轻链和重链,所述轻链中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13中的第1-113位所示,所述重链中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3中的第1-117位所示。
- 如权利要求1所述的抗Her3抗体,其特征在于,所述轻链还包含轻链恒定区,所述重链还包含重链恒定区;所述轻链恒定区较佳地为人源抗体或小鼠抗体的轻链恒定区;更佳地为人源抗体的κ或λ链的恒定区;和/或,所述重链恒定区较佳地为人源抗体或小鼠抗体的重链恒定区;更佳地为人源抗体IgG1、IgG2、IgG3或者IgG4的重链恒定区。
- 如权利要求2所述的抗Her3抗体,其特征在于,所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示;和/或,所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
- 一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包含如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体。
- 一种分离的核酸,其特征在于,所述核酸编码如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体或如权利要求4所述的融合蛋白;较佳地,编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:14中的第1-339位所示;和/或,编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6中的第1-351位所示;更佳地,编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示;和/或,编码所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
- 一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含如权利要求5所述的核酸。
- 一种抗体偶联药物,其特征在于,所述抗体偶联药物包含如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体或如权利要求4所述的融合蛋白。
- 一种双特异性抗体分子,其特征在于,所述双特异性抗体分子包含如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体或如权利要求4所述的融合蛋白。
- 一种嵌合抗原受体T细胞,其特征在于,所述嵌合抗原受体T细胞包含如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体或如权利要求4所述的融合蛋白。
- 一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体、如权利要求4所述的融合蛋白、如权利要求7所述的抗体偶联药物、如 权利要求8所述的双特异性抗体分子、或者如权利要求9所述的嵌合抗原受体T细胞及其药学上可接受的盐、溶剂合物、或者其药学上可接受的盐的溶剂合物;较佳地,所述药物组合物还包括药用辅料。
- 一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体或者如权利要求4所述的融合蛋白。
- 一种套装药盒,其特征在于,所述套装药盒包括药盒A和药盒B;其中,所述药盒A包括如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体或者如权利要求10所述的药物组合物;所述药盒B包括其他治疗剂;较佳地,所述药盒A与药盒B的施用时间不分先后或者先施用所述药盒A。
- 一种给药装置,其特征在于,所述给药装置包含:(1)用于对有需要的受试者施用如权利要求10所述的药物组合物的输注模块,以及(2)任选的药效监控模块。
- 一种治疗/预防疾病的方法,其特征在于,所述方法包括向有需要的患者施用有效剂量的如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体、如权利要求4所述的融合蛋白、如权利要求7所述的抗体偶联药物、如权利要求8所述的双特异性抗体分子、或者如权利要求9所述的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求10所述的药物组合物、或施用如权利要求13所述的给药装置;较佳地,所述疾病为肿瘤;更佳地,所述肿瘤为Her3阳性肿瘤;进一步更佳地,所述Her3阳性肿瘤选自Her3阳性肺癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、***癌和胃癌中的一种或多种。
- 一种如权利要求1~3任一项所述的抗Her3抗体、如权利要求4所述的融合蛋白、如权利要求7所述的抗体偶联药物、如权利要求8所述的双特异性抗体分子、如权利要求9所述的嵌合抗原受体T细胞、或者如权利要求10所述的药物组合物在制备Her3蛋白抑制剂、或者制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用;较佳地,所述肿瘤为Her3阳性肿瘤;更佳地,所述Her3阳性肿瘤选自Her3阳性肺癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、***癌和胃癌中的一种或多种。
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