CN117607049A - 一种空间谱估计双光子超分辨显微装置与方法 - Google Patents
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Abstract
一种空间谱估计双光子超分辨显微装置与方法属于超分辨荧光显微技术领域，是针对现有双光子荧光显微成像技术存在成像分辨率低的问题所提出。包括飞秒激光器，准直扩束镜，微透镜阵列(MLA)，准直透镜，扫描振镜，扫描透镜，管镜，二向色镜，物镜，荧光样品，滤光片，集光透镜和相机。将空间谱估计与双光子荧光显微成像技术结合，利用飞秒激光器发出的短脉冲激光，使荧光物质同时吸收两个光子，发射一个荧光光子，由于对光子密度的要求较高，只有在焦点附近很小区域内被激发，最大限度减少焦外激发；利用MLA产生多焦点照明，提高成像效率；再根据特征值大小将特征向量分为信号特征向量和噪声特征向量，利用两个子空间的正交特性构造出“针状”空间谱峰，最后通过谱峰搜索重构出超分辨图像。可以实现快速高分辨率三维成像，具有更好的光学切片性能和更高的空间和时间分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及超分辨荧光显微技术领域，特别是涉及空间谱估计双光子超分辨显微装置与方法。
背景技术
双光子荧光显微成像技术，具有较强的层析能力，有利于厚样品的成像。利用多焦点照明的多焦点双光子荧光显微成像技术，可以提高成像效率。然而，现有双光子荧光显微成像技术存在成像分辨率低的问题，需要进一步提高成像分辨率。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种空间谱估计双光子超分辨显微装置与方法，可以解决现有双光子荧光显微成像技术存在成像分辨率低的问题。
本发明采用的技术方案在于：
一种空间谱估计双光子超分辨显微装置，包括飞秒激光器，沿激光器的光线传播方向依次设有准直扩束镜，微透镜阵列(MLA)，准直透镜，扫描振镜，扫描透镜，管镜，二向色镜，物镜，荧光样品，滤光片，集光透镜和相机。
飞秒激光器发出的光束经准直扩束镜形成平行光入射到MLA，光束经过准直透镜和二维振镜，会聚于扫描透镜与管镜的公共焦面。其中管镜和物镜组成无限远成像***，管镜的后焦面与物镜前焦面为一组共轭面，在物镜的前焦面产生多焦点照明。样品发出的荧光经物镜收集以及二向色镜和滤光片滤除杂散光后，经集光透镜会聚于其前焦面，相机感光平面与集光透镜前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。MLA产生不同的点阵列图案可以改变物镜前焦面的强度分布，对荧光样品进行随时间变化的扫描，CCD相机采集每一扫描位置被照明区域内荧光样品闪烁过程中所生成低分辨率图像序列，所有照明图案累积结果分布均匀。
一种空间谱估计双光子超分辨显微方法，包括以下步骤：
S1、利用飞秒激光器产生的短脉冲激光实现双光子激发照明；
S2、在MLA的焦平面，照明光束调制为多焦点形式，利用扫描振镜实现多焦点光束随时间变化的移动扫描，所有照明图案累积结果分布均匀；
S3、激发的荧光与照明光混合经过二向色镜和滤光片滤除照明光后，聚焦于相机表面；
S4、利用相机采集由荧光样品在随时间变化的多焦点照明下受激发生成的低分辨率图像序列；
S5、利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构，获得高分辨率图像。
作为本发明更优的技术方案，所述步骤S1中双光子激发利用飞秒激光器发出的短脉冲激光，使荧光探针同时吸收两个光子，发射一个荧光光子，由于对光子密度的要求较高，只有在焦点附近很小区域内被激发，最大限度减少焦外激发；低分辨率图像光强分布公式为：
式(1)中，I(r)为光强度，代表卷积运算，r代表空间坐标，O(r)代表荧光样品(10)的物函数，G(r)表示***的点扩散函数，p(r)表示照射在样品(10)表面的多焦点照明图案的强度分布。
作为本发明更优的技术方案，所述步骤S2和S3中多焦点光束的扫描照明主要由MLA和扫描振镜配合得到，光斑间的距离随各透镜的焦距变化而改变。
作为本发明更优的技术方案，所述步骤S5中将空间谱估计与双光子荧光显微成像技术结合，由MLA产生的多焦点照明双光子激发下的低分辨率图像序列的重构由空间谱估计处理得到高分辨率图像。
低分辨图像序列组成矩阵I：
I＝[I1 I2 … IK] (2)
式(2)中，K表示采集的低分辨率图像总帧数；求其协方差矩阵：
R＝I*I' (3)
对矩阵R进行特征值分解，基于信息论方法中的最小描述长度准则(MDL)，根据成像***噪声模型，通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ0。大于的σ0特征值对应的特征向量代表信号S:{uσi＝0}，其他特征向量代表N:{uσi＝0}；
求解点扩散函数在信号子空间、噪声子空间的特征向量上的投影分别为dPR(r′test)和dPN(r′test)：
式(4)中，dPR(r′test)为点扩散函数在信号子空间的特征向量上的投影，uσi＝0为奇异值对应的特征向量；
式(5)中，dPN(r′test)为点扩散函数在噪声子空间的特征向量上的投影；
dPR(r′test)和dPN(r′test)的比值为指示函数f(r′test)：
式(6)中，α表示指示函数的指数因子，r′test为成像平面像素点坐标；
判别测试点有无荧光探针，当测试点为有荧光探针时，指示函数分母的值无限趋近于零，导致指示函数的值极大，否则指示函数的分子接近于0，指示函数的值较小，通常小于1，以指示函数的值为重构的结果，能清晰地区分出样品与背景噪声，提高图像分辨率。
本发明的有益效果是：
将空间谱估计与双光子荧光显微成像技术结合，利用飞秒激光器发出的短脉冲激光，使荧光物质同时吸收两个光子，发射一个荧光光子，由于对光子密度的要求较高，只有在焦点附近很小区域内被激发，最大限度减少焦外激发；利用MLA产生多焦点照明，提高成像效率；再根据特征值大小将特征向量分为信号特征向量和噪声特征向量，利用两个子空间的正交特性构造出“针状”空间谱峰，最后通过谱峰搜索重构出超分辨图像。可以实现快速高分辨率三维成像，具有更好的光学切片性能和更高的空间和时间分辨率。
附图说明
图1是一种空间谱估计双光子超分辨显微装置的结构示意图；
图2是仿真所用荧光样品和传统双光子成像结果；
图3(a)和(b)分别是图像扫描显微成像(ISM)和空间谱估计双光子超分辨显微成像结果对比图；
图4是图3(a)和(b)成像结果中沿虚线方向的强度分布对比图；
图1中：1、飞秒激光器；2、准直扩束镜；3、MLA；4、准直透镜；5、扫描振镜；6、扫描透镜；7、管镜；8、二向色镜；9、物镜；10、荧光样品；11、滤光片；12、集光透镜、13相机；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
图1是本实施例的成像装置结构示意图，包括飞秒激光器1，沿飞秒激光器1光线传播方向依次设有准直扩束镜2，微透镜阵列3、准直透镜4、扫描振镜5、扫描透镜6、管镜7、二向色镜8、物镜9、荧光样品10、滤光片11、集光透镜12和相机13。成像过程为非相干成像。
所述的一种空间谱估计双光子超分辨显微方法具体步骤是：
步骤一、利用飞秒激光器1产生的短脉冲激光实现双光子激发照明；
步骤二、在MLA 3的焦平面，照明光束调制为多焦点形式，利用扫描振镜5实现多焦点光束随时间变化的移动扫描，所有照明图案累积结果分布均匀；
步骤三、激发的荧光与照明光混合经过二向色镜8和滤光片11滤除照明光后，聚焦于相机13表面；
步骤四、利用相机13采集由荧光样品在随时间变化的多焦点照明下受激发生成的低分辨率图像序列；
步骤五、利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构，获得高分辨率图像。
下面详述本实例的内容。飞秒激光器1发出的光束经准直扩束镜2形成平行光入射到MLA3，光束经过准直透镜4和二维振镜5，会聚于扫描透镜6与管镜7的公共焦面。其中管镜7和物镜9组成无限远成像***，管镜7的后焦面与物镜9前焦面为一组共轭面，在物镜9的前焦面产生多焦点照明。样品10发出的荧光经物镜9收集以及二向色镜8和滤光片11滤除杂散光后，经集光透镜12会聚于其前焦面，相机13感光平面与集光透镜12前焦面重合而采集到荧光样品10的成像结果。MLA3产生不同的点阵列图案可以改变物镜9前焦面的强度分布，对荧光样品10进行随时间变化的扫描，CCD相机13采集每一扫描位置被照明区域内荧光样品10闪烁过程中所生成低分辨率图像序列，所有照明图案累积结果分布均匀。
将空间谱估计与双光子荧光显微成像技术结合，低分辨率图像序列的重构由空间谱估计处理得到高分辨率图像。
低分辨图像序列组成矩阵I：
I＝[I1 I2 … IK] (2)
式(1)中，K表示采集的低分辨率图像总帧数；求其协方差矩阵：
R＝I*I' (3)
对矩阵R进行特征值分解，基于信息论方法中的最小描述长度准则(MDL)，根据成像***噪声模型，通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ0。大于的σ0特征值对应的特征向量代表信号S:{uσi＝0}，其他特征向量代表N:{uσi＝0}；
求解点扩散函数在信号子空间、噪声子空间的特征向量上的投影分别为dPR(r′test)和dPN(r′test)：
式(4)中，dPR(r′test)为点扩散函数在信号子空间的特征向量上的投影，uσi＝0为奇异值对应的特征向量；
式(5)中，dPN(r′test)为点扩散函数在噪声子空间的特征向量上的投影；
dPR(r′test)和dPN(r′test)的比值为指示函数f(r′test)：
式(6)中，α表示指示函数的指数因子，r′test为成像平面像素点坐标；
判别测试点有无荧光探针，当测试点为有荧光探针时，指示函数分母的值无限趋近于零，导致指示函数的值极大，否则指示函数的分子接近于0，指示函数的值较小，通常小于1，以指示函数的值为重构的结果，能清晰地区分出样品与背景噪声，提高图像分辨率。
本实施例可以实现的效果。图2(a)中荧光样品10从右到左中间线对间距分别为66nm、99nm、132m、165nm、198nm，图2(b)是双光子荧光显微成像结果，受限于衍射极限无法分辨上述间距的荧光线对。从图3(a)中可以看出，ISM可以分辨间距132nm的线对，提高了成像分辨率和成像对比度，但提高的程度有限，无法满足更高需求；图3(b)中空间谱估计双光子超分辨显微可以分辨间距66nm的线对，能清晰地区分出样品与背景噪声，说明该方法有效提高了成像分辨率。
在本说明书的描述中，参考术语“本实施例”、“具体实施例”的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多种实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种空间谱估计双光子超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、利用飞秒激光器(1)产生的短脉冲激光实现双光子激发照明；
S2、在MLA(3)的焦平面，照明光束调制为多焦点形式，利用扫描振镜(5)实现多焦点光束随时间变化的移动扫描，所有照明图案累积结果分布均匀；
S3、激发的荧光与照明光混合经过二向色镜(8)和滤光片(11)滤除照明光后，聚焦于相机(13)表面；
S4、利用相机(13)采集由荧光样品在随时间变化的多焦点照明下受激发生成的低分辨率图像序列；
S5、利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构，获得高分辨率图像。
2.根据权利要求1所述的一种空间谱估计双光子超分辨显微方法，其特征在于，所述步骤S1中双光子激发利用飞秒激光器(1)发出的短脉冲激光，使荧光探针同时吸收两个光子，发射一个荧光光子，由于对光子密度的要求较高，只有在焦点附近很小区域内被激发，最大限度减少焦外激发；低分辨率图像光强分布公式为：
式(1)中，I(r)为光强度，代表卷积运算，r代表空间坐标，O(r)代表荧光样品(10)的物函数，G(r)表示***的点扩散函数，p(r)表示照射在样品(10)表面的多焦点照明图案的强度分布。
3.根据权利要求1所述的一种空间谱估计双光子超分辨显微方法，其特征在于，所述步骤S2和S3中多焦点光束的扫描照明主要由MLA(3)和扫描振镜(5)配合得到，光斑间的距离随各透镜的焦距变化而改变。
4.根据权利要求1所述的一种空间谱估计双光子超分辨显微方法，其特征在于，所述步骤S5中将空间谱估计与双光子荧光显微成像技术结合，由MLA(3)产生的多焦点照明双光子激发下的低分辨率图像序列的重构由空间谱估计处理得到高分辨率图像。
低分辨图像序列组成矩阵I：
I＝[I1 I2…IK] (2)
式(2)中，K表示采集的低分辨率图像总帧数；求其协方差矩阵：
R＝I*I' (3)
对矩阵R进行特征值分解，基于信息论方法中的最小描述长度准则(MDL)，根据成像***噪声模型，通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ0。大于的σ0特征值对应的特征向量代表信号S:{uσi＝0}，其他特征向量代表N:{uσi＝0}；
求解点扩散函数在信号子空间、噪声子空间的特征向量上的投影分别为dPR(r′test)和dPN(r′test)：
式(4)中，dPR(r′test)为点扩散函数在信号子空间的特征向量上的投影，uσi＝0为奇异值对应的特征向量；
式(5)中，dPN(r′test)为点扩散函数在噪声子空间的特征向量上的投影；
dPR(r′test)和dPN(r′test)的比值为指示函数f(r′test)：
式(6)中，α表示指示函数的指数因子，r′test为成像平面像素点坐标；
判别测试点有无荧光探针，当测试点为有荧光探针时，指示函数分母的值无限趋近于零，导致指示函数的值极大，否则指示函数的分子接近于0，指示函数的值较小，通常小于1，以指示函数的值为重构的结果，能清晰地区分出样品与背景噪声，提高图像分辨率。
5.一种空间谱估计双光子超分辨显微装置，用于实现权利要求1所述的一种空间谱估计双光子超分辨显微方法。装置包括飞秒激光器(1)，沿飞秒激光器(1)光线传播方向依次设有准直扩束镜(2)、MLA(3)、准直透镜(4)、扫描振镜(5)、扫描透镜(6)、管镜(7)、二向色镜(8)、物镜(9)、荧光样品(10)、滤光片(11)、集光透镜(12)和相机(13)。
6.一种空间谱估计双光子超分辨显微装置，其特征在于，飞秒激光器(1)发出的光束经准直扩束镜(2)形成平行光入射到MLA(3)，光束经过准直透镜(4)和扫描振镜(5)，会聚于扫描透镜(6)与管镜(7)的公共焦面。其中管镜(7)和物镜(9)组成无限远成像***，管镜(7)的后焦面与物镜(9)前焦面为一组共轭面，在物镜(9)的前焦面产生多焦点照明。样品(10)发出的荧光经物镜(9)收集以及二向色镜(8)和滤光片(11)滤除杂散光后，经集光透镜(12)会聚于其前焦面，相机(13)感光平面与集光透镜(12)前焦面重合而采集到荧光样品(10)的成像结果。MLA(3)产生不同的点阵列图案可以改变物镜(9)前焦面的强度分布，对荧光样品(10)进行随时间变化的扫描，相机(13)采集每一扫描位置被照明区域内荧光样品(10)闪烁过程中所生成低分辨率图像序列，所有照明图案累积结果分布均匀。
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