CN117603888A - 一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用,菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),命名为WR‑3,于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.29355。该菌株对异丙甲草胺具有优异的降解作用,且还可有效降解养殖尾水中的COD、TN和TP;该菌株耐受能力强,可耐受4~25℃的低温环境,在应用过程中不易受外界环境冲击,在实际冬季养殖尾水处理应用中具有良好的价值,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用。
背景技术
水质污染是水产养殖过程不可避免的问题,尾水中的污染物主要是有机物、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、磷等。养殖密度过高、投喂饵料的方式方法不科学或投喂量过大、渔业生产过程中用药不符合要求等等,必然会对水域环境造成一定程度的破坏,进而影响水产品的品质。养殖方式关乎到水产的质量,而为获取更高的利润,大部分个体想要获取更高的利润,会越来越多的使用化学药品。在水产养殖中,常见的化学成分是杀菌剂、杀真菌剂、寄生虫剂、藻类除草剂、杀虫剂,以及减少水生动物伤口的***和促进产卵或提高生长的荷尔蒙。这些化学药品使用后会残留在养殖尾水中,对养殖区域和周边环境造成污染,对人类的生产和生活造成极大的影响。
异丙甲草胺是一种非选择性草胺类除草剂,可以用于控制水体中的藻类生长,有效控制过度繁殖的藻类,改善水质,防止水体富营养化和赤潮的发生。然而,带有异丙甲草胺的养殖尾水如果直接排放,会杀死多种植物类型,包括农作物、蔬菜和观赏植物,加速农田退化,减少生物多样性,并且会在土壤中残留一段时间,影响土壤微生物群落的结构和功能,降低土壤肥力和水分保持能力,还可能通过地下水和水生生物链进入生态***,对水生生物造成危害,从而导致生态环境的失衡。
目前针对异丙甲草胺的处理方法鲜有研究,对养殖尾水中的有机物、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐和磷的处理主要以微生物处理为主,而低温状态下菌种的代谢及繁殖能力都会大大缩小甚至休眠死亡,这也导致了养殖塘口在11月至次年三月的集中排水季中排放的尾水温度较低,微生物难以发挥作用处理污染物质。这就需要筛选低温耐受的菌种并且具有高效降解污染物的能力。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一株能够在4~25℃水温环境下定殖生长、并能快速降低养殖尾水中异丙甲草胺、COD、TN、TP等浓度水平的菌株,以实现冬季养殖尾水的净化处理。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一株蜡样芽孢杆菌,菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),命名为WR-3,于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.29355。
蜡样芽孢杆菌降解养殖尾水中异丙甲草胺的应用,养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为50~100 mg/L,pH为6.0~8.0,温度为4~25℃。
利用蜡样芽孢杆菌制备的菌剂。
蜡样芽孢杆菌降解养殖尾水中异丙甲草胺的应用,养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为 50~100 mg/L,pH为6.0~8.0,温度为4~25℃。
一种利用蜡样芽孢杆菌降解养殖尾水中异丙甲草胺的方法,具体步骤为:将菌剂按照体积比为0.1%~0.2%的投加量投加于养殖尾水中,搅拌均匀,进行降解。
一种菌剂的制备方法,包括以下具体步骤:
S1、将菌株WR-3接种于LB固体平板培养基上,恒温培养至长出菌落,挑选单菌落接种于LB斜面培养基上,继续培养至得到菌种;
S2、将菌种和生理盐水混合制成菌悬液,接种于LB液体培养基中,振荡培养获得种子液;
S3、将种子液接种于发酵培养基中,振荡培养,得到液体菌剂;
S4、向液体菌剂中加入沸石粉,烘干得到固体菌剂。
优选地,前述步骤S1中,LB固体平板培养基的组分为:蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0g、氯化钠10.0 g,加水至1.0 L,pH为7.0;LB斜面培养基的组分为:酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
优选地,前述步骤S2中,制备菌悬液的浓度为1×109CFU/mL ,菌悬液的接种量为2%~4%;LB液体培养基的组分为:酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
优选地,前述步骤S3中,种子液的接种量为2%~ 4%;发酵培养基的组分为碳源10g/L、氮源5 g/L、氯化钠10 g/L,剩余为水,pH为5.5~8.0;所述碳源为废糖蜜或玉米淀粉和废糖蜜的混合物,玉米淀粉和废糖蜜的质量比为2:1;所述氮源为酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨和氯化铵中的一种或几种的混合物;种子液于发酵培养基中培养至活菌数为2×109CFU/mL,中止发酵。
优选地,前述步骤S4中,固体菌剂的具体制备方法为:每100 mL发酵液中加入15 g沸石粉,振荡后静止,离心,去除上清液,得到沉淀物,向每100 g沉淀物中加入30 g沸石粉,烘干,得到固体菌剂。
本发明的有益之处在于:本发明筛选出一株能够降解养殖尾水污染物的菌株WR-3,该菌株对异丙甲草胺具有优异的降解作用,且还可有效降解养殖尾水中的COD、TN和TP;该菌株耐受能力强,可耐受4~25℃的低温环境,在应用过程中不易受外界环境冲击,在实际冬季养殖尾水处理应用中具有良好的价值,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为菌株WR-3的菌落形态图;
图2为菌株WR-3的***发育树;
图3为菌株WR-3在低温培养基中的OD生长曲线图;
图4为菌株WR-3在不同温度下对异丙甲草胺的降解效果图;
图5为菌株WR-3在不同温度下对COD的降解效果图;
图6为菌株WR-3在不同温度下对TP的降解效果图;
图7为菌株WR-3在不同温度下对TN的降解效果图;
图8为菌株WR-3在不同pH下的降解效果图;
图9为不同异丙甲草胺初始浓度下菌株WR-3的降解效果图;
图10为8℃下菌株WR-3对实际养殖尾水的降解效果图;
图11为15℃下菌株WR-3对实际养殖尾水的降解效果图。
实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1 Bacillus cereus WR-3的分离及鉴定:
从连云港获取低温养殖尾水样本,煮沸15 min,经过梯度稀释后,将其均匀涂布在牛肉膏琼脂平板上,15℃好氧培养24~48 h。待菌落形成后挑取单菌落再次平板划线分离,得到单菌落。共获得32种菌株,我们对32种不同菌株进行了降解异丙甲草胺测试,发现WR-3菌对降解异丙甲草胺有着优异的性能,至此我们选择WR-3菌作为目标菌种。
对WR-3菌进行革兰氏染色及芽孢染色,该菌株为革兰氏阳性菌,无荚膜,产芽孢,芽孢圆形或柱形,菌体细胞成杆状,其菌落形态图如图1所示。
本发明测定了菌株的16S rDNA序列,其序列表详见SEQ ID NO:1。细菌扩增的引物采用细菌通用引物。正向引物为Eubac27F:(5-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3),其序列表详见SEQ ID NO:2,反向引物为Eubac1492R:(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3),其序列表详见SEQ IDNO:3,将25 μL2×Mix Taq与正反向引物各2 μL、菌液2 μL混匀后,加水至50 μL体系后进行PCR扩增。PCR反应程序为94℃预变性4 min;94℃变性30 s;55℃复性1 min;72℃延伸1.5min,共30个循环;72℃延伸10min。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后送至测序公司进行测序,对菌株16S rDNA序列结果采用BLAST方法在NCBI数据库搜索比对分析。将菌株及其相近菌株的16S rDNA序列通过Mega(Version7.0)软件进行多序列比对,并采用Neighbor-joining方法构建***进化树。如图2,***发育树结果显示,该菌株为蜡样芽孢杆菌。
上述菌株于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus WR-3),保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,菌种保藏号为:CGMCC No.29355。
实施例2 菌剂的制备包括以下步骤:
(1)将WR-3菌菌株接种于LB固体平板培养基上,LB固体平板培养基的组分为:蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、氯化钠10.0g,加水至1.0 L,pH为7.0,并将其置于恒温培养箱内,15℃培养24 h左右至培养基上长出菌落;然后挑选单菌落接种于LB斜面培养基上,LB斜面培养基的组分为:酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L,于15℃培养24 h。
(2)将第一步培养的菌种用5‰灭菌的生理盐水制成1×109CFU/mL的菌悬液,以3%的接种量接种于LB液体培养基中,LB液体培养基的组分为:酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L ,15℃,180 rpm振荡培养24 h,获得种子液。
(3)将第二步中的种子液以3%的接种量接种于发酵培养基中,发酵培养基的组分为碳源10 g/L、氮源5 g/L、氯化钠10 g/L和纯水,15℃,180 rpm振荡培养,至活菌数为2×109CFU/mL,中止发酵,得到液体菌剂。
(4)向第三步的发酵液中加入沸石粉,每100 mL发酵液中加入15 g沸石粉,150rpm振荡50 min后静止1 h,然后于4℃ 6000 rpm离心20 min,去除上清液,得到沉淀物,向沉淀物每100 g中加入30 g沸石粉,于60℃烘箱中烘干6 h,得到固体菌剂。
上述LB培养基由蛋白胨10.0g,酵母粉5.0 g,氯化钠10.0 g,加水至1.0 L配制,调节pH值至7.0,121℃灭菌20 min后使用。
实施例3 检测WR-3菌株的生长温度范围及最适生长温度:
将WR-3菌株接种至在LB液体培养基中,LB液体培养基的组分为:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化钠10 g/L,记录WR-3菌株在4~30℃下的生长状况,用OD600nm来表征菌液浓度,我们在15℃下对其进行了相应的生长曲线测定,测定结果如图3所示。
结果表明,菌株WR-3接种到LB培养基后,在4~30℃条件下培养均可以正常生长,在4℃下虽然发现生长缓慢,但是连续四天OD600在不断增加。培养四天后,菌株WR-3的OD600可达到0.689。由图3可知,菌株在16 h之内生长缓慢,16~48 h迅速生长,在72 h之后达到生长阈值,这说明菌株WR-3为一株耐冷菌株。
实施例4 不同温度下菌株WR-3的降解效果:
在温度分别为0℃、4℃、8℃、15℃、20℃、25℃、30℃的条件下,按1%(v/v)的接种量,将菌株WR-3分别接种至12组含不同污染物的无机盐培养基中,无机盐培养基的组分为:Na2HPO4·12H20 2.3 g、NH4NO3 1.5 g、ZnSO40.05 g、KH2PO41.0 g、CuSO40.85 g、MgSO40.6 g、MnSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.3 g和 CaCl21 g,用双蒸水定容至1L,1~3组培养基中分别含50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的异丙甲草胺,4~6组培养基中分别含50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的COD,7~9组培养基中分别含1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0mg/L 的TP,10~12组培养基中分别含10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L的TN,pH 7.0,160r/min震荡培养,每48h取样,检测污染物降解效果如图4~7所示。
由图4~7可知,0~3℃时,菌株对异丙甲草胺、COD、TN和TP的降解率几乎为零;4℃时,对异丙甲草胺的降解率在50%左右;8~15℃时,对异丙甲草胺的降解率在60%~80%之间;20~25℃时,对异丙甲草胺的降解率在90%~98%之间,25℃左右时达到最大值。菌株对COD、TN和TP的降解最佳适宜温度为20~25℃,降解率均在65~98%之间,因此,菌株WR-3对养殖尾水的最佳处理温度为20~25℃,处理效果优异,且在4℃时对异丙甲草胺也具有较好的降解效果,可在低温养殖尾水的处理环境下使用。
实施例5 不同PH下菌株WR-3的降解效果:
分别采取10组温度为4℃以及15℃,异丙甲草胺初始浓度为100 mg/L的培养基,每组培养基设置不同的pH(分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5)条件,转速160 r/min,培养48 h,将上述培养结束的培养液取样检测异丙甲草胺的降解情况,如图8所示。
由图8可知,该菌株可适应范围较广,在4℃之间时,处理效果最佳pH值在7.0~8.0之间,异丙甲草胺的降解率在50%左右;温度为15℃时,处理效果最佳pH值在6.0~8.0之间,异丙甲草胺的降解率可达75%~80%左右。因此,菌株WR-3处理养殖尾水的最佳pH值为6.0~8.0。
实施例6 不同异丙甲草胺初始浓度下菌株WR-3的降解效果:
在异丙甲草胺初始浓度分别为20 mg/L、50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L的条件下,按1%(v/v)的接种量,将菌株WR-3分别接种至含不同异丙甲草胺初始浓度的无机盐培养基中,无机盐培养基的组分为:Na2HPO4·12H20 2.3 g、NH4NO3 1.5 g、ZnSO40.05 g、KH2PO41.0 g、CuSO40.85 g、MgSO40.6 g、MnSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.3g和 CaCl21 g,用双蒸水定容至1 L,降解温度为20℃,pH 7.0,160 r/min震荡培养,每48h取样,检测降解效果如图9所示。
由图9可知,异丙甲草胺初始浓度为50~100 mg/L时,降解率在90%以上,降解效果优异。
实施例7 菌剂对养殖废水的处理效果:
按照实施例2的方法制备WR-3菌剂,培养温度为15±1℃,得到的菌剂活菌数为1.2×1010cfu/mL。处理水质来源为低温养殖尾水治理***,实验室模拟生化***曝气处理,处理量为5 L,菌剂的添加量为0.1%(V/V),曝气处理使溶氧在2 mg/L以上,污水pH6.0~8.5,控制处理温度分别为8℃和15℃,48 h为1 d进出水一次,每次进出水1 L,取样分别检测两种温度下菌剂的处理效果,结果见图10和图11。
根据图10和图11可知,在pH6.0~8.5,温度为8℃的低温环境下,菌剂对异丙甲草胺的降解率最高可达65%,对COD、TP和TN的降解率均为40%~55%之间;温度为15℃时,菌剂对异丙甲草胺的降解率可达80%以上,对COD、TP和TN的降解率均为75%以上,由此可以看出,菌剂对低温养殖尾水的处理具有很好的降解效果,可快速有效的去除异丙甲草胺、COD、TP和TN。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一株蜡样芽孢杆菌,其特征在于,所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)命名为WR-3,于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.29355。
2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在降解养殖尾水中异丙甲草胺中的应用,其特征在于,所述养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为50~100 mg/L,pH为6.0~8.0,温度为4~25℃。
3.利用权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌制备的菌剂。
4.权利要求3所述的菌剂在降解养殖尾水中异丙甲草胺中的应用,其特征在于,所述养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为50~100 mg/L,pH为6.0~8.0,温度为4~25℃。
5.一种利用权利要求3所述的菌剂降解养殖尾水中异丙甲草胺的方法,其特征在于,具体步骤为:将菌剂按照体积比为0.1%~0.2%的投加量投加于养殖尾水中,搅拌均匀,进行降解。
6.一种权利要求3所述的菌剂的制备方法,其特征在于,包括以下具体步骤:
S1、将菌株WR-3接种于LB固体平板培养基上,恒温培养至长出菌落,挑选单菌落接种于LB斜面培养基上,继续培养至得到菌种;
S2、将菌种和生理盐水混合制成菌悬液,接种于LB液体培养基中,振荡培养获得种子液;
S3、将种子液接种于发酵培养基中,振荡培养,得到液体菌剂;
S4、向液体菌剂中加入沸石粉,烘干得到固体菌剂。
7.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中,LB固体平板培养基的组分为:蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、氯化钠10.0 g,加水至1.0 L,pH为7.0;LB斜面培养基的组分为:酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
8.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中,LB液体培养基的组分为:酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
9.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中,发酵培养基的组分为碳源10 g/L、氮源5 g/L、氯化钠10 g/L,剩余为水,pH为5.5~8.0。
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