CN117757688B - 一株弗氏柠檬酸杆菌jys及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株弗氏柠檬酸杆菌JYS及其菌剂和应用，属于微生物净化废水技术领域，该弗氏柠檬酸杆菌JYS的保藏编号为GDMCC No：63823；本发明还公开了一种处理养殖废水的固定化菌剂，该菌剂含有弗氏柠檬酸杆菌JYS和固定化载体。本发明筛选得到一株高效好氧反硝化菌，该菌株同时具备反硝化作用和硝化作用，可直接用于养殖水体异位处理的脱氮过程。本发明还通过制备复合生物炭对菌株进行固定化，以增强菌株在养殖尾水中的脱氮性能，菌株与生物炭的结合，增加了孔径，能够提高水处理的脱氮效率且加快弗氏柠檬酸杆菌菌体自聚集，促进生物膜形成，在生物膜处理养殖尾水领域具有重要前景。

Description

一株弗氏柠檬酸杆菌JYS及其菌剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物净化废水技术领域，特别是涉及一株弗氏柠檬酸杆菌JYS及其菌剂和应用。

背景技术

随着人民生活水平日益提高，营养要求愈发全面，水产品需求也逐年增加，因此人工水产养殖规模和产量持续增加。在人工养殖过程中，由于密度过高，大量投喂带来养殖***中饵料残留和水体中水生动物***物的大量累积。并且在目前的集约化养殖模式下，养殖动物对饲料的利用率仅为20％～30％，饲料残留在养殖水体后，绝大部分溶解在水中，造成养殖水体严重的氮污染。加上养殖过程中消毒药剂使用杀灭了有益微生物，极易引发养殖水生生物暴发疾病、影响水生生物的生长和产量，进而造成养殖水体中氮磷含量超标的情况。此外，随着水产养殖业的快速发展，大量养殖尾水排放到自然水体，其中超标的污染物造成自然水体富营养化，引起更多的水环境污染问题。

一般情况下，水体的氮循环处于一种稳定的状态，水体水质维持在正常水平。但是，在水产养殖中，由于高密度养殖，致使水生态失衡、水质恶化、水体缺氧，进而造成养殖水体中氮磷含量超标的情况。总氮和总磷是衡量水体富营养化的重要指标之一，水产养殖尾水产出的大量氮、磷排放到环境中，会导致湖泊、河流或近岸海域的水体产生富营养化，浮游生物大量繁殖，水中的溶解氧下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡。面对越来越严重的氮污染状况，加强和深化对养殖尾水脱氮技术的研究，尤其是筛选高效脱氮微生物，开发新型脱氮技术有重要意义。目前针对微生物修复，纯种高效脱氮微生物的筛选就愈发重要。

水产养殖水体的处理可以分为两种主要方法，一是原位处理，比如在养殖水体中直接种植水生植物，以直接修复或降低养殖水体的污染程度；另一种是异位处理，即将废水排出后再进行处理，例如最常见的循环水养殖***属于此类。微生物修复指利用微生物的生命代谢活动降低环境中有毒有害物质的浓度使其无害化，从而使被污染的环境能够部分或完全恢复到初始状态的过程，具有效果好、投资少、安全性高等特点。

生物炭是一种由生物质制成的炭材料，具有较高的碳含量和孔隙率。生物炭具有高度的微孔结构，这使得其有着优异的吸附性能和微生物养分保持能力。在农业领域中，生物炭可以用作土壤改良剂，有效促进植物生长和提高土壤肥力。在水处理领域，生物炭可以用作吸附剂，去除水中各种有害物质，如重金属离子、有机污染物等，从而提高水处理的效率。但是，不同原料来源的生物炭对同一微生物的生长有不同的影响。筛选高效脱氮效果、具有生态安全性、易于自聚集形成生物膜的微生物菌种，以及制备能够提高脱氮效率的复合生物碳材料具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株弗氏柠檬酸杆菌JYS及其菌剂和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌株同时具备反硝化作用和硝化作用，可直接用于养殖水体异位处理的脱氮过程，本发明将菌株与生物炭结合，增加了孔径，能够提高水处理的脱氮效率且加快弗氏柠檬酸杆菌菌体自聚集，促进生物膜形成，在生物膜处理养殖尾水领域具有重要前景。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)JYS，其于2023年09月21日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：63823。

本发明还提供一种处理养殖废水的固定化菌剂，含有上述弗氏柠檬酸杆菌JYS和固定化载体。

进一步地，所述固定化载体包含农业废弃物、天然高分子材料和聚羟基丁酸酯。

进一步地，所述农业废弃物包含甘蔗皮、香蕉杆、甘蔗粉、椰子壳或香蕉皮；所述天然高分子材料包含硅酸钠或海藻酸钠。

进一步地，所述农业废弃物为椰子壳；所述天然高分子材料为海藻酸钠。

本发明还提供一种上述固定化菌剂的制备方法，包括以下步骤：

向农业废弃物、天然高分子材料和聚羟基丁酸酯中加水混合均匀，经高温煅烧、冷却后得到复合生物炭；

将复合生物炭与弗氏柠檬酸杆菌JYS混合培养后，冲洗、烘干。

进一步地，所述农业废弃物、天然高分子材料和聚羟基丁酸酯与所述加水的用水量质量比为1：1：1：0.8；所述高温煅烧的温度为300℃，时间为3h；所述冷却的时间为24h。

进一步地，所述弗氏柠檬酸杆菌JYS以菌液形式与所述复合生物炭混合培养；所述复合生物炭和所述菌液的比例为25g：1L；所述培养的条件为30℃，140r/min摇床培养12h。

进一步地，所述农业废弃物包含甘蔗皮、香蕉杆、甘蔗粉、椰子壳或香蕉皮；所述天然高分子材料包含硅酸钠或海藻酸钠。

本发明还提供一种上述的弗氏柠檬酸杆菌JYS或上述固定化菌剂在处理养殖废水中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明筛选得到一株高效好氧反硝化菌，该菌株同时具备反硝化作用和硝化作用，可同时去除养殖过程中产生的硝态氮和氨氮，且反硝化作用过程中极少积累亚硝酸盐，无二次污染。经扩培后，可直接用于养殖水体异位处理的脱氮过程，在实际应用中有较大潜力。

本发明还通过制备复合生物炭对菌株进行固定化，以增强菌株在养殖尾水中的脱氮性能，菌株与生物炭的结合，增加了孔径，能够提高水处理的脱氮效率且加快弗氏柠檬酸杆菌菌体自聚集，促进生物膜形成，在生物膜处理养殖尾水领域具有重要前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为菌株JYS在反硝化培养基中的生长速率图；

图2为菌株JYS的透射电镜图；

图3为构建的菌株JYS***进化树；

图4为菌株JYS的初步反硝化能力测定结果；

图5为菌株JYS在反硝化培养基培养72h产生絮状物沉淀的照片；

图6为复合生物炭固定化菌株在混合氮源培养基去除铵态氮的统计图；

图7为复合生物炭固定化菌株在混合氮源培养基去除硝态氮的统计图；

图8为复合生物炭固定化菌株在混合氮源培养基去除亚硝态氮的统计图；

图9为复合生物炭固定化菌株在混合氮源培养基中的脱氮效果柱状图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

下述实施例中所使用的各个培养基配方如表1所示：

表1各个培养基配方

实施例1好氧反硝化菌的分离、鉴定和保藏

发明人于2022年6月从广东省广州市荔湾区珠江水产研究所放置有PHB缓释碳源的养殖水体中分离得到弗氏柠檬酸菌杆菌(Citrobacterfreundii)JYS，具体如下：

1菌株的分离、纯化

从工厂化模拟养殖***的水处理单元收集添加的聚羟基丁酸酯(PHB)缓释碳源颗粒，将其与养殖水体混合并置于灭菌锥形瓶中经超声波震荡2h，静置1h取上清得到初始环境样品。直接取初始环境样品10mL接种于含90mL反硝化细菌富集培养基的三角瓶中，放置于30℃，180r/min摇床培养。将富集培养液稀释，菌悬液梯度稀释过程如下：

从锥形瓶中吸取1mL菌悬液接入装有9mL无菌水的离心管中，充分混匀，即稀释到10^-1。再从此离心管中吸取1mL接入另一装有9mL无菌水的离心管中混匀，重复此步骤可以依次稀释达到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8共八个梯度。然后从每个梯度各取0.1mL稀释液，分别涂布到已制作好的BTB固体平板培养基上，标明稀释梯度与日期，在恒温生化培养箱中30℃培养2-3d。观察平板长出单菌落后，判断周围产生明显蓝色晕圈的菌落为初步筛选的具有反硝化活性的菌落，用接种环挑取并进行纯化。采用平板划线分离法在固体基础富集培养基上划线，将平板分四个区域，每个区域划满，划线后正面放置于室温下5-10min，然后倒置于恒温生化培养箱内30℃培养。按照上述步骤反复划线分离2-3次后，划出单菌落，观察没有异常菌落出现，则认为菌株已完全纯化，选取呈现反硝化反应最强烈的菌株JYS。

2菌株的鉴定和保藏

菌株JYS的生物学特性如表2所示：

表2菌株JYS的生物学特性

将菌株JYS接种至反硝化培养基中进行培养，定期取样测OD₆₀₀，如图1所示，该菌株在培养2h后进入对数生长期，其生长速度较快，6h后生物量达到最高，随后进入稳定生长期。通过透射电镜观察菌体菌落形态，如图2可知，其有单端鞭毛、无芽孢、无荚膜，菌体呈杆状、菌体易自聚集。

利用DNA提取试剂盒提取菌株JYS基因组。以菌株基因组为模板，进行16S rRNA基因的PCR扩增，将获得的16S rRNA基因序列在NCBI上比对发现，该菌株与Citrobacterfreundii菌的16S rRNA序列相似性较高，为99.9％，基于16S rRNA序列选择在种属水平上最接近的20株菌，通过MEGA6.0软件选择NJ(Neighbor-Joining)法构建***进化树，如图3所示。基于16S rRNA基因的***发育分析结果以及生理生化特性，鉴定菌株JYS为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)的一株新菌株。

将弗氏柠檬酸菌杆菌(Citrobacterfreundii)JYS于2023年09月21日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：63823。

实施例2菌株JYS的初步反硝化能力测定

纯化后的菌株接种至液态基础富集培养基中，置于30℃，180r/min的恒温震荡培养箱中培养10h，活化后的菌液8000g离心，倒掉上清液，用0.75％的无菌生理盐水漂洗，重复2次，再将菌悬液OD₆₀₀值调节到0.4左右重悬，按接种量为1mL接种于装有100mL、以KNO₃为唯一氮源的反硝化培养基中，30℃，180r/min培养0、24、48、72h，分别取10mL菌液，8000g离心，取上清液测定培养液中NO₃ ^--N的浓度、NH₄ ⁺-N的浓度，以计算氮的去除率。

脱氮效果如图4所示，培养24h后硝态氮去除率为4％左右，到72h时硝态氮去除率达97.7％左右，铵态氮在24h时迅速积累，48h时去除率达68％左右，后去除率下降。观察72h锥形瓶内培养基(图5)，观察到了明显的絮状物沉淀。

实施例3复合生物炭固定化菌颗粒的制备以及在混合氮源培养基中的应用

复合生物炭制备方法为：

(1)将椰子壳、甘蔗皮、香蕉皮、香蕉杆、甘蔗皮进行烘干研磨，并用10目筛网去除大颗粒，得到固体粉末，分别将固体粉末与PHB、硅酸钠粉末以及去离子水以质量比1：1：1：0.8混合均匀成团，用模具固定形状，进行300℃高温煅烧持续3h后，冷却24h得到复合生物炭G1-G5(见表3)。

将椰子壳、甘蔗皮、香蕉皮、香蕉杆、甘蔗皮进行烘干研磨，并用10目筛网去除大颗粒，得到固体粉末，分别将固体粉末与PHB、海藻酸钠粉末以及去离子水以质量比1：1：1：0.8混合均匀成团，用模具固定形状，进行300℃高温煅烧持续3h后，冷却24h得到复合生物炭H1-H5(见表3)。

(2)弗氏柠檬酸菌杆菌JYS悬液的制备：即在100mL LB培养基中加入100μL JYS菌株进行8h扩培，后进行离心，弃上清、洗涤后加入无菌生理盐水，调整OD₆₀₀值至0.4后得到菌悬液。

(3)固定化颗粒制备方法：分别将上述复合生物炭以25g/L比例加入已经扩培活化的JYS菌悬液中，30℃，140r/min摇床培养12h后取出，用无菌水洗涤，反复冲洗4-5次，烘干得到复合生物炭固定化菌颗粒，烘干时间为24h，烘干温度为30℃。

按接种量为0.05g/mL，分别将上述复合生物炭固定化菌颗粒接种于混合氮源培养基中，混合氮源培养基配方为：柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇2H₂O)5g/L、NaCl 0.01g/L、K₂HPO₄0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.05g/L、微量元素溶液1mL/L、硫酸铵0.055g/L、硝酸钾0.25g/L、亚硝酸钠0.03g/L。30℃，140r/min摇床中培养，分别于培养0、4、8、12、24、48h取10mL菌液，8000g离心，取上清液测定培养液中NO₃ ^--N、NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N的浓度，以计算氮的去除率。

结果显示：将复合生物炭固定化菌颗粒加入培养基培养48h后，复合生物炭成型情况如表3所示：

表3复合生物炭成型情况

选用生物炭成型良好的G2、G3、G4、G5、H1、H4组对其脱氮情况进行计算。

复合生物炭固定化菌株在混合氮源培养基(未严格控制无菌状态)中的脱氮效果如图6、图7、图8所示，培养48h后G5组铵态氮去除能力低于其他各组，添加有硅酸钠的复合生物炭固定化菌株无法显著去除硝态氮，除G3组外其余各G组亚硝态氮有明显累积，而添加有海藻酸钠的两个组可去除亚硝态氮。

观察图9可知各组对于三态氮的去除率情况，培养48h后G2组铵态氮去除率达99.08％，亚硝态氮去除率仅为4.01％，硝态氮去除率仅为11.03％；G3组铵态氮去除率达94.75％，亚硝态氮去除率仅为27.95％，硝态氮去除率仅为15.14％；G4组铵态氮去除率达98.04％，亚硝态氮明显累积，亚硝态氮去除率逆增长39.31％，硝态氮去除率仅为17.63％；G5组铵态氮去除率达67.24％，亚硝态氮明显累积，亚硝态氮去除率逆增长23.31％，硝态氮去除率仅为3.66％；H1组铵态氮去除率达94.55％，亚硝态氮去除率仅为90.66％，硝态氮去除率90.48％；H4组铵态氮去除率达96.71％，亚硝态氮去除率仅为84.53％，硝态氮去除率86.64％；根据三态氮的去除率分析，添加硅酸钠的复合生物炭固定化菌对亚硝态氮和硝态氮的去除能力显著减弱，而海藻酸钠的添加能够使得复合生物炭固定化菌去除三态氮的时间提前，而椰子壳和甘蔗粉两者比较，添加椰子壳的复合生物炭固定化菌脱氮能力更强，故在复合生物炭固定化菌株制备时，优先选择椰子壳和海藻酸钠。

综合上述，本发明采用自放置有聚羟丁酸酯的养殖***中筛选所得的高效好氧反硝化菌，该菌株菌液、固定化菌株以及休眠细胞均能在以氨氮、硝氮、亚硝态氮为氮源以及混合氮源的基础培养基中生长，并将氨氮经硝化作用转化为硝态氮，同时可以经过反硝化作用，将硝态氮转化为氮气，实现同步硝化－反硝化，对氨氮的降解速度快。该菌株未对养殖***中水生生物产生不良影响，易自聚集，在形成生物膜方向有较好效果。本发明还利用椰子壳和甘蔗皮等农业废弃物以及PHB和硅酸钠或海藻酸钠等天然高分子材料高温煅烧制备复合生物炭，与菌株JYS进行混合固定后，可直接应用于养殖水体的脱氮，复合生物炭具有较高的碳含量，硅酸钠的添加可减缓其释放速度，海藻酸钠可以增强颗粒稳定性，并且生物炭高度的微孔结构使其具有良好的吸附性，使得菌株能更好的生长成膜，避免了非土著菌的环境不适应问题，在水产养殖尾水处理中具有较大潜力。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种处理养殖废水的固定化菌剂，其特征在于，含有弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)JYS和固定化载体；

所述固定化载体包含农业废弃物、天然高分子材料和聚羟基丁酸酯；

所述农业废弃物为椰子壳；所述天然高分子材料为海藻酸钠；

所述弗氏柠檬酸杆菌JYS于2023年09月21日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：63823；

所述固定化菌剂的制备方法为：包括以下步骤：

向农业废弃物、天然高分子材料和聚羟基丁酸酯中加水混合均匀，经高温煅烧、冷却后得到复合生物炭；

将复合生物炭与弗氏柠檬酸杆菌JYS混合培养后，冲洗、烘干；

所述农业废弃物、天然高分子材料和聚羟基丁酸酯与所述加水的用水量质量比为1：1：1：0 .8；所述高温煅烧的温度为300℃，时间为3h；所述冷却的时间为24h。

2.根据权利要求1所述的固定化菌剂，其特征在于，所述弗氏柠檬酸杆菌JYS以菌液形式与所述复合生物炭混合培养；所述复合生物炭和所述菌液的比例为25g：1L；所述培养的条件为30℃，140r/min摇床培养12h。

3.一种如权利要求1所述固定化菌剂在处理养殖废水中的应用。