CN117603886A - 一种耐盐碱根际促生菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种耐盐碱根际促生菌剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。本发明从盐碱地水稻根际分离筛选具有耐盐碱特性的促生菌，以腐熟牛粪堆肥为基质制备促生菌剂，通过水稻盆栽试验，研究不同浓度盐碱胁迫下，促生菌剂对土壤改良和水稻促生效果，试验证明该菌剂可有效改良盐碱土壤，具有显著促进盐碱地水稻生长的效果，具有重要的理论意义和应用价值。

Description

一种耐盐碱根际促生菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐盐碱根际促生菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着育种技术的进步，水稻单产已经达到较高水平，粮食产量仅靠提高单产来突破难度越来越大。因此，利用盐碱地扩大水稻种植面积，已成为确保粮食安全和产量的重要举措之一。经研究发现，盐碱胁迫会通过影响水稻的多个生理过程降低其产量及品质。针对盐碱地作物生产的迫切需求，通过功能微生物改善盐碱胁迫下作物生长微环境、促进作物生长的研究也有相关报道，但不同微生物分泌大分子有机物、小分子酸、生长激素等物质不同，对盐碱地作物的促生作用有很大的区别，有的甚至会影响作物的生长。同时单一菌株微生物生长性能有限，对盐碱地作物的促生作用也有很大限度，组合菌株的复合菌株是现阶段亟需研究的课题。同时关于微生物与其他生物质资源联用在盐碱地修复和盐碱地作物促生方面的研究很少有报道。
发明内容
本发明提供了一种耐盐碱根际促生菌剂，所述菌剂包括如下菌株：特基拉芽孢杆菌CSJS-1、塔宾曲霉RGPF-1、产黄青霉RGPF-2和贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1；所述特基拉芽孢杆菌CSJS-1分类命名为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，保藏编号为CGMCCNo.27150；所述塔宾曲霉RGPF-1分类命名为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis，保藏编号为CGMCC No.40731；所述产黄青霉RGPF-2分类命名为产黄青霉Penicillium chrysogenum，保藏编号为CGMCC No.40732；所述贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.27879。本发明所述菌株是从盐碱地水稻根际分离筛选得到，具有耐盐碱特性。本发明所述特基拉芽孢杆菌CSJS-1具有固氮和产IAA特性，所述塔宾曲霉RGPF-1具有固氮、解磷、降低pH特性，所述产黄青霉RGPF-2具有产铁载体特性，所述贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1具有产铁载体特性。
本发明还提供所述耐盐碱根际促生菌剂的制备方法，包括如下步骤：将特基拉芽孢杆菌CSJS-1和贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1分别接种到LB液体培养基中培养，分别制成特基拉芽孢杆菌CSJS-1菌悬液和贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1菌悬液；将塔宾曲霉RGPF-1和产黄青霉RGPF-2分别接种到PDA固体培养基培养，分别制成塔宾曲霉RGPF-1孢子悬液和产黄青霉RGPF-2孢子悬液；将所述菌悬液及孢子悬液接种到腐熟牛粪堆肥中，混匀，培养，即得根际促生菌剂。
在本发明中，可将所述菌悬液和孢子悬液混合成混合悬液，所述特基拉芽孢杆菌CSJS-1菌悬液、贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1菌悬液、塔宾曲霉RGPF-1孢子悬液和产黄青霉RGPF-2孢子悬液的混合体积比为0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5，优选为1:1:1:1。
在本发明中，所述混合悬液接种量为3~8%（混合悬液体积/腐熟牛粪干重）。本发明将所述混合悬液接种到腐熟牛粪堆肥中的培养时间为3~8天，培养温度为25~35℃。本发明所述腐熟牛粪堆肥的理化性质如下：pH 7.38，有机质35.28%，全氮1.80%，全钾3.53%，全磷0.65%，铬（Cr）127.56mg·kg-1，砷（As）3.32mg·kg-1，镉（Cd）0.19mg·kg-1，铅（Pb）11.25mg·kg-1，汞（Hg）0.01mg·kg-1。
在本发明中，先将特基拉芽孢杆菌CSJS-1或贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1菌落分别接种到LB液体培养基中，25~33℃培养至培养液OD值为0.2~0.9（对数生长期）；然后将特基拉芽孢杆菌CSJS-1或贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1培养液分别接种到LB液体培养基中进一步扩繁，25~33℃培养12~36h，分别加入LB液体培养基调整至OD值为0.5~1.5的菌悬液，即分别得特基拉芽孢杆菌CSJS-1菌悬液和贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1菌悬液。本发明所述LB液体培养基配方为胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，pH 7.0。
在本发明中，先将塔宾曲霉RGPF-1或产黄青霉RGPF-2接种至PDA固体培养基中心（点接种方式），25~30℃培养3~5d；用打孔器沿培养基表面菌落边缘向中心位置按直径0.5cm的大小取塔宾曲霉RGPF-1或产黄青霉RGPF-2菌饼，分别接种到PDA固体培养基中心，25~30℃培养4~6d，分别将培养基上的孢子用生理盐水制备浓度为0.5~1.5×109个·mL-1的孢子悬液，即分别得塔宾曲霉RGPF-1孢子悬液和产黄青霉RGPF-2孢子悬液。本发明所述PDA固体培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g，自然pH。
本发明还提供所述耐盐碱根际促生菌剂在改良盐碱地以及盐碱胁迫下水稻促生中的应用。本发明所述耐盐碱根际促生菌剂在盐碱胁迫下均显著降低了土壤pH，可溶性盐及交换性钠离子含量，提高了有机质含量，速效磷速效钾含量及土壤酶活性（P<0.05），有效改良了盐碱土。本发明所述菌剂在盐碱胁迫下均可显著提升细菌和真菌ACE、Chao、Sobs和Shannon指数（P<0.05），对微生物丰富度及多样性均有提升作用。本发明所述耐盐碱根际促生菌剂显著提升了水稻农艺性状及叶绿素含量，并有效提高了水稻叶片中抗氧化酶（CAT、POD）活性以及渗透性物质（可溶性糖和可溶性蛋白）含量，减少了丙二醛的积累，减轻了盐碱胁迫，促进了水稻生长。
在本发明中，若无特殊说明，所有的组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从盐碱地水稻根际分离筛选具有耐盐碱特性的促生菌，以腐熟牛粪堆肥为基质制备促生菌剂，通过水稻盆栽试验，研究不同浓度盐碱胁迫下，促生菌剂对土壤改良和水稻促生效果，试验证明该菌剂可有效改良盐碱土壤，提升土壤中微生物丰富度及多样性，具有显著促进盐碱地水稻生长的效果，具有重要的理论意义和应用价值。
本发明将筛选的菌株与有机基质配合施用可提高根际促生菌存活率，在盐碱土修复及植物促生方面拥有巨大潜力。
本发明耐盐碱根际促生复合菌剂制备方法简便易行，可适用于大生产。
附图说明
图1 菌株特基拉芽孢杆菌CSJS-1、贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1、塔宾曲霉RGPF-1及产黄青霉RGPF-2的菌落（a、b、c和d）及显微形态（e、f、g、h）。
图2 特基拉芽孢杆菌CSJS-1（a）、贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1（b）、塔宾曲霉RGPF-1（c）及产黄青霉RGPF-2（d）的***发育树。
图3 塔宾曲霉RGPF-1在PKO培养基上的溶磷圈。
图4 特基拉芽孢杆菌CSJS-1（a）及塔宾曲霉RGPF-1（b）在Ashby平板上的固氮能力检测结果图。
图5 菌株贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1（a）及产黄青霉RGPF-2（b）在CAS平板上的产铁载体能力检测结果图。
图6 菌株特基拉芽孢杆菌CSJS-1产IAA能力检测结果图。
图7 4株促生菌生长相容情况图。
图8 不同处理对土壤可溶性盐（a）及交换性钠含量（b）的影响结果。
图9 不同处理对土壤过氧化氢酶（a）、脲酶（b）及蔗糖酶（c）的影响结果。
图10 不同处理对水稻叶绿素（a）和丙二醛（b）含量的影响结果。
图11 不同处理对水稻CAT（a）和POD（b）活性的影响结果。
图12不同处理对水稻可溶性蛋白（a）和可溶性糖（b）含量影响结果。
生物保藏说明
特基拉芽孢杆菌CSJS-1，分类命名为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，拉丁名为Bacillus tequilensis，于2023年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27150；
塔宾曲霉RGPF-1，分类命名为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis，拉丁名为Aspergillus tubingensis，于2023年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.40731；
产黄青霉RGPF-2，分类命名为产黄青霉Penicillium chrysogenum，拉丁名为Penicillium chrysogenum，于2023年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.40732；
贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，拉丁名为Bacillus velezensis，于2023年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27879。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种耐盐碱根际促生菌剂的制备：
挑取特基拉芽孢杆菌CSJS-1或贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1菌落，分别接种到LB液体培养基中，30℃培养至培养液OD值为0.5（对数生长期）；将OD值为0.5（对数生长期）的特基拉芽孢杆菌CSJS-1和或贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1培养液分别按照1%（体积百分比）接种量接种到新鲜LB液体培养基中进一步扩繁，30℃培养24h，分别加入LB液体培养基调整至OD值为1的菌悬液，即分别得特基拉芽孢杆菌CSJS-1菌悬液和贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1菌悬液；
将塔宾曲霉RGPF-1或产黄青霉RGPF-2接种至PDA固体培养基中心（点接种方式），28℃培养4d；用打孔器沿培养基表面菌落边缘向中心位置按直径0.5cm的大小取塔宾曲霉RGPF-1或产黄青霉RGPF-2菌饼，分别接种到PDA固体培养基中心，28℃培养5d，分别将培养基上的孢子用生理盐水制备浓度为1×109个·mL-1的孢子悬液，即分别得塔宾曲霉RGPF-1孢子悬液和产黄青霉RGPF-2孢子悬液；
将特基拉芽孢杆菌CSJS-1菌悬液、贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1菌悬液、塔宾曲霉RGPF-1孢子悬液和产黄青霉RGPF-2孢子悬液按照体积比1:1:1:1混合，得混合悬液；按照体积/质量比（混合悬液体积/腐熟牛粪干重，mL/g）为5%的比例接种到未灭菌的腐熟牛粪堆肥中，混匀，30℃培养4d，即得根际促生菌剂。
其中，LB液体培养基配方为胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，pH 7.0；PDA固体培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g，自然pH。
实施例2
试验材料如下：
主要试剂与培养基：试验所用试剂均购于天津科密欧化学试剂有限公司。试验中用到的培养基配方见表1。
表1 培养基配方
培养基名称 成分（1L）
PKO 葡萄糖10.0 g，氯化钠0.3 g，氯化钾0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，磷酸三钙10.0 g，氯化镁5.0 g，硫酸铵0.5 g，硫酸镁0.3 g，pH 7.0
Ashby 磷酸氢二钾0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸钾0.2 g，碳酸钙5 g，葡萄糖5 g，甘露醇5 g，pH 7.0
CAS 刃天青0.06 g，氯化铁0.0027 g，十六烷基三甲基溴化铵0.075 g，哌嗪二乙醇磺酸30.2 g，10×MM9盐溶液100 ml，葡萄糖3.6 g，酸水解酪蛋白16.2 g，硫酸镁0.0049 g，氯化钙0.00011 g
PDA 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，自然pH
LB 胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，pH 7.0
供试土壤：试验所用盐碱土一部分为模拟盐碱土，另一部分为实际盐碱土。通过于盆栽土中加入碳酸钠调节土壤盐含量制备得到模拟盐碱土，含盐量为0.10%的模拟盐碱土为模拟轻度盐碱土，含盐量为0.15%的模拟盐碱土为模拟中度盐碱土。盆栽土取自东北农业大学盆栽场，实际盐碱土取自黑龙江省大庆市肇源县，基本理化性质见表2。
表2 供试土壤的基本理化性质
理化性质 盆栽土 实际盐碱土 模拟轻度盐碱土 模拟中度盐碱土
pH 7.45 7.81 7.92 8.47
含盐量 % 0.05 0.12 0.10 0.15
SOM % 1.59 2.02 1.59 1.56
速效钾 mg/kg 127.36 257.43 120.41 106.67
速效磷 mg/kg 21.34 42.29 20.01 15.84
试验所用有机基质为腐熟牛粪堆肥，其理化性质如下：pH 7.38，有机质35.28%，全氮1.80%，全钾3.53%，全磷0.65%，铬（Cr）127.56mg·kg-1，砷（As）3.32mg·kg-1，镉（Cd）0.19mg·kg-1，铅（Pb）11.25mg·kg-1，汞（Hg）0.01mg·kg-1。其中，所述腐熟牛粪堆肥制备包括如下步骤：以干牛粪和水稻秸秆为原料，调节碳氮比30:1，含水量60%，进行曝气式好氧堆肥，通风率为每千克干重0.2L/min，发酵30天。
供试水稻：水稻品种为五优稻4号（Oryza sativa L.）。
1耐盐碱根际促生菌的分离、筛选与鉴定
1.1耐盐碱根际促生菌的分离、筛选
根际土壤取自黑龙江省大庆市林甸县盐碱地水稻田，选取生长情况基本一致且生长健壮、无病虫害的水稻，整根挖出，完整采集根系，装入无菌采样袋中低温保存运输。称取10g土样混于装有100mL无菌水的锥形瓶中，在摇床上振荡30min，静置5min后进行梯度稀释，将100µL不同梯度土壤悬液浇注于分别含有0%、0.05%、0.1%、0.15%及0.2% Na2CO3的LB及PDA平板上培养，挑取长势较好的细菌及真菌菌落进行分离纯化。
1.2菌株显微形态及生理生化特征
观察记录菌落形态。将分离纯化后的细菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌株形态，并对其进行生理生化特征测定；对真菌采用插片法进行培养，培养3d后将插片取出，在显微镜下观察真菌孢子形态。
采用平板涂布法，待涂布后培养基长出单菌落后，进一步挑取单菌落多次划线进行纯化。将分离的菌株进行一系列促生能力测定，最终筛选出2株促生能力较强的细菌菌株特基拉芽孢杆菌CSJS-1、贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1，以及2株促生能力较强的真菌菌株塔宾曲霉RGPF-1、产黄青霉RGPF-2，其菌落形态、光学显微镜下的细胞及分生孢子形态见图1。特基拉芽孢杆菌CSJS-1为长杆状、产芽孢的革兰氏阳性菌，菌落呈白色，光滑，凸起状；贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1为短杆状、产芽孢的革兰氏阳性菌，菌落呈白色、圆形，边缘不规整；塔宾曲霉RGPF-1菌丛呈黑褐色，分生孢子为球形，呈黑色；产黄青霉RGPF-2菌丛呈灰绿色，分生孢子为球形，呈灰绿色；
细菌特基拉芽孢杆菌CSJS-1的生理生化特性如下：接触酶（+）、明胶液化（－）、吲哚试验（+）、甲基红（－）、V-P试验（－）、葡萄糖水解（+）、淀粉水解（－）、产氨试验（+）、硝酸盐还原试验（+）、柠檬酸盐试验（+）、纤维素分解试验（+）、亚硝酸还原试验（－）；细菌贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1的生理生化特性如下：接触酶（+）、明胶液化（+）、吲哚试验（+）、甲基红（+）、V-P试验（－）、葡萄糖水解（+）、淀粉水解（+）、产氨试验（+）、硝酸盐还原试验（+）、柠檬酸盐试验（－）、纤维素分解试验（－）、亚硝酸还原试验（－）。
1.3分子生物学鉴定
将筛选到的4株促生菌送至上海美吉生物公司进行测序。利用BLAST软件对测序结果进行比对分析，并利用MEGA构建***发育树。
利用BLAST软件在GenBank中将4株菌PCR扩增后的16S rDNA序列与已知序列进行对比分析，结合其生理生化鉴定，初步确定细菌特基拉芽孢杆菌CSJS-1与贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1同属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；真菌塔宾曲霉RGPF-1属于曲霉属（Aspergillussp.）；真菌产黄青霉RGPF-2属于青霉菌属（Penicillium sp.）。利用MEGA对4株菌构建***发育树，其结果如图2所示。
2耐盐碱根际促生菌的促生特性分析
2.1溶磷特性
将纯化分离出的耐盐碱菌株点接种于PKO固体培养基上，于28℃下倒置培养，于第5d观察是否有透明圈出现，对菌株的溶磷能力进行初步定性测定。再将明显具有解磷透明圈的菌株接种到PDA液体培养基中，通过对不同取样时期培养基pH的测量来反映菌株解磷能力大小。
本发明研究结果表明，经过72h培养后，菌株塔宾曲霉RGPF-1在PKO固体培养基上的菌落周围形成了明显的透明水解圈，表明其有一定的溶磷特性（图3）。在后续对其培养基pH测定中发现，培养1d后培养基pH下降了2.17个单位，且随着培养时间的延长还在不断降低，到第3d时，pH下降了2.33个单位（表3）。
表3 菌株塔宾曲霉RGPF-1培养基pH的变化
天数 CK 塔宾曲霉RGPF-1
1d 6.29 4.12
2d 6.28 4.10
3d 6.30 3.97
2.2固氮特性
将纯化分离出的菌株点接种于Ashby固体培养基上，于28℃下倒置培养3d，观察菌株生长情况。
如图4所示，菌株特基拉芽孢杆菌CSJS-1及塔宾曲霉RGPF-1在平板上生长旺盛，说明这两个菌株具有良好的固氮能力。
2.3产铁载体特性
将菌株点接在CAS的固体平板上，30℃培养72h，如菌株产生橙黄色晕圈，则说明其具有产生铁载体的能力，然后再进行定量测定。将具有分泌铁载体的能力接种于LB液体培养基中置于恒温摇床中30℃，150r·min-1震荡培养48h。将培养液转移到离心管中离心，取适量上清液与等量的CAS检测液混合，常温反应1h，测定630nm下的OD值。
如图5所示，菌株贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1及产黄青霉RGPF-2在CAS检测平板上均能形成显著的橙黄色晕圈，说明两个菌株具有产铁载体的能力。为了更为准确的了解两个菌株分泌嗜铁素的能力，进一步对贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1及产黄青霉RGPF-2进行了定量测定，结果显示贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1产量可达24.32%，产黄青霉RGPF-2产量可达63.5%。
2.4产吲哚乙酸（IAA）特性
将筛选出的菌种接种于含有100mg·L-1 L-色氨酸的5mL LB液体培养基中，置于恒温摇床中30℃，150r·min-1震荡培养48h，然后将培养液离心，取25mL上清液，加入2mLSalkowski显色液，测定530nm下的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA产量。
试验结果表明，特基拉芽孢杆菌CSJS-1可通过吲哚-3-丙酮酸途径将色氨酸转变为IAA，而在无机酸存在下，合成的吲哚乙酸又能与FeCl3作用，生成红色的螯合物（图6）。为了更好地了解菌株的产IAA能力，又对菌株其进行了定量检测，产量可达27.02mg·L-1。
3耐盐碱根际促生菌的生长特性分析
3.1 菌株耐盐性：将筛选到的促生菌分别接种于含0.05%、0.1%、0.15%、0.2%及0.25% Na2CO3的LB及PDA平板上，观察株菌的生长情况。
4株促生菌在不同盐浓度培养基上的生长情况见表4。在盐浓度为0.05%、0.10%及0.15%的培养基中4株促生菌均能正常生长，可见其均具有一定的耐盐能力。
表4 4株促生菌在不同盐浓度培养基上的生长情况
盐浓度 特基拉芽孢杆菌CSJS-1 贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1 塔宾曲霉RGPF-1、 产黄青霉RGPF-2
0.05% + + + +
0.10% + + + +
0.15% + + + +
0.20% - - + +
0.25% - - + -
3.2 菌株耐碱性：将筛选到的促生菌分别接种于pH为8、9、10、11及12的LB及PDA平板上，观察株菌的生长情况。
从表5可见，4株促生菌在不同pH培养基上的生长情况，pH在为8、9、10的培养基中均能正常生长，表明4株促生菌均具有一定的耐碱能力。
表5 4株促生菌在不同pH培养基上的生长情况
pH 特基拉芽孢杆菌CSJS-1 贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1 塔宾曲霉RGPF-1、 产黄青霉RGPF-2
8 + + + +
9 + + + +
10 + + + +
11 + + + -
12 - - + -
3.3 菌株生长相容性
采用平板对峙法，先将促生真菌用打孔器打出菌饼，将菌饼相邻放置在PDA培养基上，再将促生细菌以“井”字形划线到真菌***，恒温培养箱30℃培养48h，观察菌株间有无抑菌圈。
平板对峙情况见图7，从图中各菌株的菌落生长情况可知，4株促生菌间均未出现抑菌圈，即相互间无明显拮抗现象。
实施例3 根际促生菌剂对盐渍化土壤的修复和水稻的促生作用
该实施例所用的试验材料参见实施例2。
1.根际促生菌剂的制备同实施例1。
2.盆栽试验设计：为了精准控制土壤理化指标和水肥条件，试验采用中桶（直径32cm，高28cm）进行盆栽。将供试土壤过筛后分装到桶中，每桶盛装10kg土壤，在距土壤表面10cm深处加入Na2CO3固体，分别配制成浓度为0.1%（轻度盐碱）和0.15%（中度盐碱）的模拟盐碱土壤，淹水平衡3d，同时设置未加Na2CO3的对照组（CK）。插秧前1d将水层高度调整为1cm，将秧苗每盆3穴，每穴3株，插在盆栽桶中，插秧深度控制在2cm。整个生育过程在自然状态下按常规水稻生产方式管理。共设置6个处理组，每个处理3次重复，分别为：无肥处理组（W）、化肥处理组（HF）、灭菌有机堆肥（所述腐熟牛粪堆肥）处理组（MY），灭菌有机堆肥+促生菌剂处理组（MYM），未灭菌有机堆肥处理组（WY）及未灭菌有机堆肥+促生菌剂处理组（WYM）。此外，其中氮肥为尿素，分基肥（50%）、蘖肥（30%）和穗肥（20%），3次施用；磷肥为磷酸二铵（(NH4)2HPO4），作为基肥1次施用；钾肥为硫酸钾（K2SO4），分基肥（50%）和穗肥（50%），2次施用。在促生菌剂处理组（MY组、MYM组、WY组、WYM组）中，有机堆肥按照氮素含量替代50%化肥施入。具体施加用量见表6，其中基肥为尿素、磷酸二铵、硫酸钾、堆肥、促生菌剂，蘖肥为尿素、堆肥、促生菌剂，穗肥为尿素、硫酸钾、堆肥、促生菌剂。
表6 不同处理组化肥及促生菌剂施用量
施肥种类 W组 HF组 MY组 MYM组 WY组 WYM组
尿素g / 2.43 1.22 1.22 1.22 1.22
磷酸二铵g / 1.43 0.72 0.72 0.72 0.72
硫酸钾g / 1.58 0.79 0.79 0.79 0.79
堆肥g / / 31.18 31.18 31.18 31.18
促生菌剂ml / / / 1.56 / 1.56
尿素g / 1.46 0.73 0.73 0.73 0.73
堆肥g / / 18.66 18.66 18.66 18.66
促生菌剂ml / / / 0.93 / 0.93
尿素g / 0.97 0.49 0.49 0.49 0.49
硫酸钾g / 1.58 0.79 0.79 0.79 0.79
堆肥g / / 12.52 12.52 12.52 12.52
促生菌剂ml / / / 0.63 / 0.63
按照水稻不同生育期（具体取样时间见表7）对其进行整株取样，用蒸馏水清洗干净，立即测量水稻株高、根长和叶绿素含量，并将完成的植株样品保存在-80℃冰箱中，用于后续的指标测定。同时收集根际土壤样品，并将其平均分成两部分。一部分放在室内风干，粉碎过筛后用于理化性质及酶活的测定；另一部分新鲜土壤样品保存在-80℃冰箱中，用于微生物群落结构测定。
表7 供试水稻及土壤样品取样时间
时期 分蘖期 抽穗期 灌浆期 成熟期
取样时间 6月17日 8月5日 9月5日 9月27日
3.土壤基本理化性质分析
土壤pH（水土比1:5）采用pH计进行测量，可溶性盐含量采用电导法进行测定，有机质含量采用K2CrO7-H2SO4法进行测定，土壤速效磷及速效钾含量采用NaHCO3-钼锑抗比色和NH4OAc浸提-火焰光度法进行测定，交换性钠离子含量采用NH4OAc-NH4OH火焰光度法进行测定。在水稻不同生长期取样，各处理组的土壤理化性质如表8-11所示。
3.1 对pH、有机质含量、速效钾含量、速效磷含量的影响
如表8所示，苏打盐碱土以碱性碳酸盐为主要成分，高pH是其影响植物生长的主要因素之一。轻度及中度盐碱胁迫均导致水稻不同生长时期的土壤pH有不同程度升高，在分蘖期，轻度及中度盐碱胁迫下pH分别上升0.28和0.62个单位。在分蘖期时各处理组对土壤pH的影响并不明显，但随着种植时间的增加，各处理组对pH的影响逐渐显现，且在同一时期中，各处理组在中度盐碱胁迫下降低效果更为明显。在灌浆期轻度盐碱胁迫下，HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使pH分别下降0.06、0.08、0.19、0.08、0.23个单位，在成熟期中度盐碱胁迫下HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使pH分别下降0.13、0.25、0.51、0.23和0.48个单位。在同一时期同一盐浓度下，两个根际促生菌剂处理组（MYM和WYM组）效果相近，降低效果均高于其它组。
如表8所示，轻度及中度盐碱胁迫均导致水稻不同生长时期的土壤有机质含量下降，在分蘖期，轻度及中度盐碱胁迫下有机质分别下降8.04%和13.39%。除HF处理组外，各剂处理组（MY组、MYM组、WY组、WYM组）对土壤有机质含量均有显著提升作用，且随着种植时间的增加，提升效果先增加后下降，在灌浆期提升效果达到最大。在灌浆期轻度盐碱胁迫下，MY组、MYM组、WY组、WYM组使有机质含量分别提升0.47、1.29、1.21和1.44 g·kg-1，在灌浆期中度盐碱胁迫下MY组、MYM组、WY组、WYM组使有机质含量分别提升1.03、1.55、1.42和1.76g·kg-1。在同一时期同一盐浓度下，HF组对有机质含量无显著影响，WYM组的提升效果最为显著，MY组、MYM组、WY组的提升效果之间并无显著区别。
表8各水稻生长期不同处理组的土壤pH和有机质
时期/处理组 pH/CK pH/轻度 pH/中度 有机质（g·kg-1）/CK 有机质（g·kg-1）/轻度 有机质（g·kg-1）/中度
分蘖期/W 7.49±0.04ab 7.87±0.08b 8.31±0.04ab 1.12±0.01b 1.03±0.04c 0.97±0.02d
分蘖期/HF 7.49±0.08ab 7.96±0.04ab 8.30±0.06abc 1.12±0.02b 1.03±0.16c 0.98±0.02cd
分蘖期/MY 7.62±0.01a 8.07±0.03a 8.37±0.08a 1.16±0.04ab 1.20±0.02bc 1.13±0.01bcd
分蘖期/MYM 7.52±0.01ab 7.95±0.01ab 8.27±0.01bc 1.58±0.23a 1.26±0.11ab 1.39±0.31b
分蘖期/WY 7.47±0.03b 7.96±0.02b 8.20±0.05abc 1.36±0.21ab 1.22±0.02bc 1.33±0.13bc
分蘖期/WYM 7.52±0.08ab 7.80±0.05ab 8.16±0.04c 1.48±0.21ab 1.41±0.09a 1.86±0.05a
抽穗期/W 7.49±0.11a 7.83±0.07bc 8.31±0.06a 1.00±0.03c 0.96±0.02b 0.96±0.01b
抽穗期/HF 7.50±0.03a 7.97±0.04a 8.14±0.05b 1.03±0.05c 0.97±0.04b 0.98±0.04b
抽穗期/MY 7.39±0.08ab 7.96±0.05a 8.08±0.05b 1.25±0.18ab 1.21±0.06ab 1.12±0.03a
抽穗期/MYM 7.21±0.01c 7.80±0.04bc 7.94±0.03c 1.36±0.18a 1.26±0.1ab 1.22±0.06a
抽穗期/WY 7.43±0.06ab 7.90±0.04ab 8.06±0.3b 1.23±0.10ab 1.27±0.08ab 1.19±0.07a
抽穗期/WYM 7.20±0.01c 7.72±0.04c 7.90±0.04c 1.49±0.09a 1.45±0.34a 1.24±0.09a
灌浆期/W 7.48±0.01a 7.84±0.07a 8.17±0.06a 0.90±0.04d 0.99±0.1c 0.86±0.04c
灌浆期/HF 7.44±0.04ab 7.78±0.06ab 8.07±0.01b 1.13±0.01d 1.07±0.27c 0.96±0.02c
灌浆期/MY 7.38±0.03b 7.76±0.03ab 7.98±0.02c 1.89±0.21c 1.46±0.2bc 1.89±0.03b
灌浆期/MYM 7.20±0.03c 7.65±0.06bc 7.88±0.01de 2.44±0.17b 2.28±0.13ab 2.41±0.63ab
灌浆期/WY 7.44±0.01ab 7.76±0.03ab 7.96±0.03cd 1.98±0.01c 2.20±0.04ab 2.28±0.23ab
灌浆期/WYM 7.17±0.01c 7.61±0.05c 7.83±0.04e 2.92±0.11a 2.43±0.56a 2.62±0.06a
成熟期/W 7.32±0.01b 7.76±0.09a 8.22±0.01a 0.84±0.01d 0.84±0.06c 0.79±0.06c
成熟期/HF 7.42±0.07ab 7.72±0ab 8.09±0.13ab 0.97±0.03cd 0.9±0.1b 0.93±0.03c
成熟期/MY 7.45±0.04a 7.74±0.06ab 7.97±0.04b 1.98±0.07ab 1.51±0.06b 1.39±0.27b
成熟期/MYM 7.03±0.04c 7.60±0.04bc 7.71±0.03c 2.38±0.3ab 1.65±0.17b 2.46±0.17a
成熟期/WY 7.42±0.01ab 7.66±0.06abc 7.99±0.08b 1.86±0.3bc 1.45±0.09bc 1.46±0.08b
成熟期/WYM 7.00±0.07c 7.54±0.03c 7.74±0.04c 2.81±0.77a 2.24±0.07a 2.52±0.08a
注：所有数据均以3个重复的平均值±标准差来表示，不同字母表示数据间显著性差异水平（即P<0.05），下同。
如表9所示，与CK相比，轻度及中度盐碱胁迫均导致水稻不同生长时期的土壤速效钾含量下降，在分蘖时期，轻度及中度盐碱胁迫导致速效钾含量分别下降5.11%和18.19%。在不同时期，各处理组均可以使速效钾含量提升，且提升效果先增加后下降，在灌浆期提升效果达到最大。在灌浆期轻度盐碱胁迫下，HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使速效钾含量分别提升43.85、81.44、196.71、176.66和264.37 mg·kg-1，在灌浆期中度盐碱胁迫下下HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使速效钾含量分别提升67.66、130.31、293.19、165.39和320.76mg·kg-1。在同一时期同一盐浓度下，有促生菌剂添加的MYM组及WYM组的提升效果要高于无促生菌剂添加的有机基质处理组（MY组、WY组）。
从表9可以看出，盐碱胁迫均导致水稻不同生长时期的土壤速效磷含量下降，在分蘖时期，轻度及中度盐碱胁迫下速效钾含量分别下降10.12%和42.86%。在不同时期，各处理组均可以使速效磷含量提升，且各盐浓度下提升效果不同，在轻度胁迫下灌浆期提升效果达到最大，在中度胁迫下成熟期提升效果达到最大。在轻度胁迫下，灌浆期HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使速效磷含量分别提升3.95、12.5、43.46、12.82和74.71 mg·kg-1，在中度胁迫下，成熟期HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使速效磷含量分别提升3.43、9.77、43.75、16.06和70.98 mg·kg-1。在同一时期同一盐浓度下，WYM组的提升效果从始至终都最为显著，而其他处理组则在种植后期提升效果才逐渐显著，且有促生菌剂添加的MYM组及WYM组的提升效果要显著高于无促生菌剂添加的有机基质处理组（MY组、WY组）。
表9各水稻生长期不同处理组的土壤速效钾和速效磷
时期/处理组 速效钾（mg·kg-1）/CK 速效钾（mg·kg-1）/轻度 速效钾（mg·kg-1）/中度 速效磷（mg·kg-1）/CK 速效磷（mg·kg-1）/轻度 速效磷（mg·kg-1）/中度
分蘖期/W 75.76±1.77d 71.89±3.54b 61.98±3.54c 12.95±3.14c 11.76±1.54c 7.40±0.67c
分蘖期/HF 159.71±14.18a 89.54±14.18b 75.76±5.32ab 19.22±1.92bc 17.88±6.74ab 7.80±0.48bc
分蘖期/MY 130.89±8.86c 77.01±3.54b 69.49±7.09c 12.59±0.76c 12.06±2.62ab 9.03±1.28bc
分蘖期/MYM 147.18±3.54ab 102.07±3.54b 79.52±7.09ab 23.11±4.31ab 21.88±3.21ab 11.06±2.63ab
分蘖期/WY 135.15±0.71ab 79.52±21.26b 64.48±7.09c 18.87±4.08bc 16.40±2.33ab 10.15±1.29abc
分蘖期/WYM 147.18±17.72ab 147.18±17.72a 114.60±35.44a 28.33±0.77a 24.77±7.93a 13.2±0.01a
抽穗期/W 75.76±1.77d 72.00±10.63d 59.47±7.09d 10.94±1.28b 9.82±1.62b 7.39±0.95b
抽穗期/HF 157.20±24.81ab 149.68±14.18ab 82.02±24.81cd 20.86±1.34ab 13.69±1.02ab 9.42±3.48b
抽穗期/MY 127.13±17.72c 124.62±14.18c 100.82±12.40bc 17.94±2.08ab 20.25±0.68ab 10.22±4.4b
抽穗期/MYM 144.67±21.26ab 148.43±1.77ab 120.11±13.47ab 20.56±7.91ab 22.87±7.43ab 17.54±3.58ab
抽穗期/WY 132.14±10.63c 125.12±6.38c 105.83±5.32abc 18.27±1.38ab 20.02±2.42ab 11.03±2.76b
抽穗期/WYM 179.75±7.09a 167.22±24.81a 134.65±1.77a 29.32±10.38a 28.28±12.76a 22.76±6.85a
灌浆期/W 74.51±7.09d 70.75±1.77d 56.96±3.54c 9.58±0.47b 9.64±2.2d 7.04±0.32d
灌浆期/HF 119.61±7.09bd 114.60±35.44cd 124.62±21.26bc 11.62±0.18b 13.59±2.52c 9.60±2.85d
灌浆期/MY 142.16±31.89bc 152.19±3.54c 187.27±67.33b 20.45±4.87b 22.14±10.01c 43.47±1.52c
灌浆期/MYM 290.01±21.26a 267.46±3.54b 350.15±21.26a 42.86±15.51a 53.10±2.68b 56.61±0.10b
灌浆期/WY 194.79±7.09b 247.41±24.81b 222.35±74.42b 25.36±4.16ab 22.46±3.46c 44.83±6.15c
灌浆期/WYM 302.54±38.98a 335.12±28.35a 377.72±17.72a 44.10±7.06a 84.35±8.88a 68.62±4.91a
成熟期/W 64.48±7.09b 61.98±10.63b 54.46±7.09d 9.85±0.56d 8.95±0.65c 6.85±0.19c
成熟期/HF 97.06±3.54ab 157.2±38.98a 114.6±14.18c 16.75±2.48cd 16.34±3.36bc 10.28±2.21c
成熟期/MY 247.41±10.86a 151.69±53.87a 139.66±7.09c 29.37±5.19bc 10.16±0.07bc 16.62±6.55c
成熟期/MYM 269.96±16.32a 177.25±3.54a 237.39±17.72b 45.89±14.29ab 52.06±14.42a 50.6±15.98b
成熟期/WY 227.36±46.07ab 164.72±0a 134.65±7.09c 33.03±8.4bc 33.95±1.76ab 22.91±4.36c
成熟期/WYM 267.46±10.63a 212.33±31.89a 277.48±24.81a 60.9±6.5a 53.81±17.2a 77.83±14a
另外，在实际盐碱土的试验（方法同本实施例盆栽试验）中，应用未灭菌有机基质+促生菌剂（WYM组），也出现相似同的结果（表10），即随着种植时间的延长，W组pH变化不大，但WYM组pH明显下降，在成熟期可使pH下降0.23个单位。W组有机质含量随着种植时间的延长而不断下降，促生菌剂的添加提升了土壤有机质含量，且在灌浆期提升效果最为明显，可达1.05 g·kg-1。对照组中速效钾及速效磷含量也随着种植时间的延长而不断下降，WYM组也可提升速效钾及速效磷含量，在灌浆期分别提升80.19和36.19 mg·kg-1。
表10 根际促生菌剂对实际盐碱土理化性质的影响
处理 pH 有机质（%） 速效钾（mg·kg-1） 速效磷（mg·kg-1） 可溶性盐含量（%） 交换性钠（cmol·kg-1） 过氧化氢酶（mL·0.1mol·L-1·KMnO4·g-1） 脲酶（mgNH3-N24h-1·g-1） 蔗糖酶（mg·glucose·24h-1·g-1）
分蘖期/W 7.83±0.06 1.13±0.02 249.92±35.44 44.78±0.93 0.05±0.01 0.61±0.01 0.63±0.02 3.76±0.13 10.1±0.04
分蘖期/WYM 7.78±0.06 1.88±0.21 237.39±17.72 51.19±0.96 0.04±0.01 0.49±0.01 0.74±0.02 5.72±0.73 14.63±0.72
抽穗期/W 7.87±0.01 1.10±0.01 189.78±35.44 41.57±0.05 0.06±0.01 0.34±0.07 0.98±0.04 3.44±0.14 11.79±0.13
抽穗期/WYM 7.72±0.02 1.93±0.14 277.48±12.40 56.70±21.48 0.05±0.01 0.27±0.21 1.39±0.07 11.00±0.21 15.06±0.43
灌浆期/W 7.87±0.03 1.02±0.01 119.61±14.18 34.28±12.47 0.08±0.01 0.43±0.07 1.32±0.03 3.56±0.31 12.83±0.70
灌浆期/WYM 7.71±0.01 2.07±0.09 199.8±42.53 70.47±29.95 0.05±0.01 0.28±0.14 1.95±0.02 10.47±0.76 19.87±1.01
成熟期/W 7.85±0.03 0.94±0.02 100.82±8.86 30.42±6.52 0.07±0.01 0.55±0.21 1.12±0.12 3.18±0.16 10.20±0.41
成熟期/WYM 7.62±0.09 1.97±0.02 159.71±14.18 53.53±17.05 0.04±0.01 0.31±0.07 1.40±0.15 8.65±0.34 17.56±0.63
综上所述，根际促生菌剂无论是对于模拟盐碱土还是实际盐碱土均具有明显修复作用，可显著降低盐碱化土壤pH，提高土壤有机质、速效钾及速效磷含量（P<0.05）。
3.2 对不同水稻生长时期土壤可溶性盐及交换性钠含量的影响
盐碱化土壤可溶性盐含量高，会对植物造成渗透胁迫和离子胁迫，是盐碱土限制作物生长的又一个重要因素。从图8a可见，模拟盐碱化土壤中可溶性盐含量随着种植时间的延长而不断增加，轻度胁迫下，W组土壤可溶性盐含量上升了20.83%；中度胁迫下，W组土壤可溶性盐含量上升了7.79%。在无盐添加条件下，相较于无肥对照组（W组），各处理组均会提升土壤中可溶性盐的含量；而在轻度及中度盐碱胁迫下，与W组相比，只有化肥会导致可溶性盐含量上升，其他处理组则会使可溶性盐含量显著降低（P<0.05），且在中度胁迫下效果好于轻度胁迫。在同一时期同一盐浓度下，根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）的降低效果显著（P<0.05）高于有机基质处理组（MY组、WY组）。
苏打盐碱土以碳酸钠为主要成分，土壤钠离子含量高，其含量可用来反应土壤的碱化程度。如图8b所示，土壤中交换性钠离子含量随着种植时间的延长而不断下降，轻度胁迫下，W组土壤可溶性盐含量下降19.26%；中度胁迫下，W组交换性钠离子含量下降12.05%。在无盐添加条件下，相较于无肥对照组，各处理组对交换性钠离子含量影响较小；而在轻度及中度盐碱胁迫下，各处理组则会使可溶性盐含量显著降低（P<0.05），且在中度胁迫下效果好于轻度胁迫。在灌浆期中度盐碱胁迫下，HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使可溶性盐含量分别下降9.71%、48.00%、56.86%、51.26%和71.58%，在成熟期中度盐碱胁迫下HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使可溶性盐含量分别下降14.49%、46.38%、58.24%、50.59%和68.51%。在同一时期同一盐浓度下，根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）的降低效果显著（P<0.05）高于有机基质处理组（MY组、WY组），且在高盐浓度下，WYM组效果最好，降低效果显著高于其他处理组（P<0.05）。
在实际盐碱土中结果相似（表10），W组可溶性盐含量呈现先上升后下降的趋势，相较于分蘖期，灌浆期土壤可溶性盐含量上升了79.17%，但在WYM组中可溶性盐含量明显下降，灌浆期时下降了41.86%。交换性钠离子含量则呈现先下降后上升的趋势，在抽穗期含量相对较低，分蘖期含量最高，WYM组中交换性钠离子含量也呈现明显下降，在最后成熟期使其含量下降43.63%。以上结果证明，根际促生菌剂在模拟盐碱土及实际盐碱土中均可显著降低土壤中可溶性盐及交换性钠离子的含量，具有修复盐碱土的潜力。
4.土壤酶活分析
土壤样品中过氧化氢酶、蔗糖酶及脲酶活性分别采用KMnO4滴定法、3，5-二硝基水杨酸比色法和苯酚钠-NaClO比色法进行测定。
4.1 对过氧化氢酶活性的影响
土壤过氧化氢酶可促进过氧化氢的分解，其活性与土壤有机质含量及微生物数量均相关，常用来表征土壤总的生物学活性和肥力状况。如图9a所示，土壤过氧化氢酶活性在盐碱胁迫下明显降低，相较于无盐添加，分蘖期中度胁迫下土壤脲酶活性下降23.65%。在分蘖期，各处理组对过氧化氢酶活性的提升效果并不明显，但从抽穗期起开始，根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）对过氧化氢酶活性有了显著提升（P<0.05），且在中度盐碱胁迫下提升效果更好。在抽穗期中度胁迫下MYM组及WYM组使土壤过氧化氢酶活性分别提升74.02%和96.16%，在灌浆期分别提升54.82%和60.36%，在成熟期分别提升68.65%和100.43%。
4.2 对脲酶活性的影响
土壤脲酶常用于表征土壤的氮素状况。从图9b可见，土壤脲酶活性在盐碱胁迫下明显降低，相较于CK组，分蘖期中度盐碱胁迫下土壤脲酶活性下降37.14%。在无盐添加条件下，相较于无肥对照组，仅WYM组在不同时期均对脲酶活性有显著提升（P<0.05）；而在轻度及中度盐碱胁迫下，各处理组对脲酶活性的影响较为明显，且在灌浆期时提升效果最为明显。在灌浆期轻度胁迫下，HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使土壤脲酶活性分别上升2.55%、50.98%、146.69%、63.89%和182.26%，在灌浆期中度胁迫下HF组、MY组、MYM组、WY组、WYM组使土壤脲酶活性分别上升5.82%、64.20%、230.64%、121.48%和234.74%。在同一时期同一盐浓度下，WYM组提升效果显著高于其他处理组（P<0.05）。
4.3 对蔗糖酶活性的影响
土壤蔗糖酶能够催化土壤中的蔗糖水解为单糖，也是评价土壤肥力的重要指标之一。图9c显示土壤蔗糖酶活性在盐碱胁迫下明显降低，分蘖期中度胁迫下土壤蔗糖酶活性下降15.92%。相较于无盐添加，除HF组对蔗糖酶无明显作用外，其他各处理组对蔗糖酶活性的提升效果随着种植时间先增加后降低，在分蘖期及抽穗期无明显提升效果，而在灌浆期效果最好。在灌浆期轻度胁迫下MY组、MYM组、WY组和WYM组使蔗糖酶活性活性分别上升10.40%、109.50%、35.54%和187.28%，在灌浆期中度胁迫下MY组、MYM组、WY组、WYM组、使蔗糖酶活性分别上升124.82%、217.42%、167.78%和251.08%。在同一时期同一盐浓度下，根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）的提升效果显著（P<0.05）高于有机基质处理组（MY组、WY组），且以WYM组效果最好。
同时如表10所示，在实际盐碱土中，3种酶的活性均随着种植时间的延长而呈现先上升后下降的趋势，在灌浆期各酶酶活力达到最高。WYM组中3种酶的活力均有不同程度的提高，过氧化氢酶在灌浆期提升效果最高，达47.73%；脲酶在抽穗期提升效果最高，达194.10%；蔗糖酶则在成熟期提升效果最高，达72.16%%。
以上结果证明，根际促生菌剂在实际盐碱土及模拟盐碱土中对于土壤过氧化氢酶活性、脲酶活性及蔗糖酶活性均具有显著提升作用（P<0.05）。
5.土壤微生物群落结构分析
将收集到的土壤样品（每个处理3次重复，每个重复0.5g）送至上海美吉生物公司进行DNA提取、PCR扩增及Illumina测序，具体过程如下：使用FastDNA® Spin Kit forSoil试剂盒（MP Biomedicals，CA，USA）提取土壤样品总DNA，并在提取后利用NanoDrop2000（Wilmington，DE，USA）对样品进行DNA的浓度和纯度检测。利用ABI GenAmp® R 9700 PCR热循环仪（ABI，CA，USA），以上述DNA为模板，使用携带Barcode序列的特异引物分别对细菌16S rRNA基因V4~V5区域、真菌ITS rRNA基因ITS区域进行PCR扩增。PCR扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，27个循环；72℃稳定延伸10min，每个样本3个重复。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行回收产物纯化，并用Quantus™ Fluorometer（Promega，USA）对回收产物进行检测定量。之后按照测序量要求，将纯化后的扩增子以等分子量混合。使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit对纯化后的PCR产物进行Miseq文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，借助Illumina公司的Miseq PE300平台分别对土壤细菌、真菌群落进行测序分析。使用Trimmomatic、fastp和FLASH软件对原始测序序列进行质控和优化。使用Mothur软件（http://www.mothur.org/wiki）进行Alpha多样性分析。
微生物Alpha多样性分析：本试验中水稻抽穗期不同处理组对根际土壤细菌群落Alpha多样性的影响采用ACE、Chao、Sobs和Shannon指数表征。其中ACE指数、Chao指数及Sobs指数主要反映根际细菌群落的丰富度，其结果如表11所示，在无盐添加的土壤中，与无肥处理组相比，各处理组ACE指数、Chao指数及Sobs指数均显著升高（P<0.05），其指数大小均为WYM组>MYM组>MY组>WY组>HF组；在轻度盐碱胁迫下，与无肥处理组相比，HF处理组ACE指数、Chao指数及Sobs指数显著降低（P<0.05），WY处理组及WYM处理组ACE指数、Chao指数及Sobs指数显著升高（P<0.05），MY组及MYM组对三指数无明显作用；在中度盐碱胁迫下，与无肥处理组相比，HF组及MY组ACE指数、Chao指数及Sobs指数均显著降低（P<0.05），仅WYM组ACE指数、Chao指数及Sobs指数显著升高（P<0.05），MYM组及WY组及对三指数无明显作用。
Shannon指数主要反映微生物群落的多样性，分析表11可知，在无盐添加的土壤中，与W组相比，除HF组对Shannon指数无明显作用外，其他各有机肥处理组Shannon指数均显著升高（P<0.05），其指数大小为WYM组>MYM组>MY组>WY组；在轻度盐碱胁迫下，与W组相比，除HF处理组Shannon指数显著降低（P<0.05），WYM组对Shannon指数有部分不显著提高外，其他各处理组对Shannon指数均无明显作用；在中度盐碱胁迫下，与无肥处理组相比，HF组Shannon指数均显著降低（P<0.05），仅WYM组Shannon指数显著升高（P<0.05），MY组、MYM组及WY组Shannon指数均无明显变化。
表11 不同处理对根际细菌群落Alpha多样性的影响
不同处理组对根际土壤真菌群落Alpha多样性的影响同样采用ACE、Chao、Sobs和Shannon指数进行表征，其结果如表12所示，在无盐添加的土壤中，与W组相比，仅HF组ACE指数、Chao指数及Sobs指数显著升高（P<0.05），WY组中三指数无明显变化，MY组、MYM组及WYM组ACE指数、Chao指数及Sobs指数显著降低（P<0.05）；在轻度盐碱化土壤中，与无肥处理组相比，HF组及MY组ACE指数、Chao指数及Sobs指数显著降低（P<0.05），其他各处理组ACE指数、Chao指数及Sobs指数均显著升高（P<0.05），其中又以WYM组提升效果最为明显；在中度盐碱化土壤中，与W组相比，除HF组ACE指数、Chao指数及Sobs指数无显著变化，其他各有机肥处理组ACE指数、Chao指数及Sobs指数均显著升高（P<0.05），其指数大小均为WYM组>WY组>MYM组>MY组。
在无盐添加的土壤中，与W组相比，各处理组Shannon指数显著升高（P<0.05），且以添加了促生菌的MYM及WYM组提升效果最为显著；在轻度盐碱化土壤中，与无肥处理组相比，各处理组Shannon指数显著升高（P<0.05），其指数大小为WYM组>MYM组>WY组>MY组>HF组；在中度盐碱化土壤中，各处理组均可使Shannon指数升高，且WYM组提升效果最明显，使Shannon指数增加21.52%。
表12 不同处理对根际真菌群落Alpha多样性的影响
6.根际促生菌剂对水稻的促生作用研究
水稻生长指标分析：分别在分蘖期、抽穗期、灌浆期及成熟期取样，将水稻样品用自来水冲洗干净，测定株高、根长及分蘖数。另外，成熟期取样后还需测定水稻总穗数、有效穗数、穗长、每穗粒数、结实率及千粒重。
6.1 对水稻株高的影响
如表13所示，水稻株高从分蘖期到灌浆期不断升高，到成熟期时趋于稳定，且株高随着盐碱化程度的增加而逐渐降低。在无盐添加时，化肥处理组提升效果显著高于其他处理组（P<0.05）。但随着盐碱化程度的增加，添加了促生菌剂的4个处理组对于株高的提升效果显著高于化肥处理组（P<0.05）。在灌浆期轻度盐碱胁迫下HF组、MY组、MYM组、WY组和WYM组使水稻株高分别提高19.54、27.67、36.43、29.07和40.5cm，在成熟期中度盐碱胁迫下HF组、MY组、MYM组、WY组和WYM组使水稻株高分别提升25.19、38.43、29.95和41.13cm。在轻度及中度盐碱胁迫下均以WYM组提升效果最为明显。
6.2 对水稻根长的影响
如表13所示，水稻根长从分蘖期到灌浆期不断增加，到成熟期时趋于稳定，且根长随着盐碱化程度的增加而逐渐降低。在无盐添加时，各时期的化肥处理组提升效果均高于其他处理组。但随着盐碱化程度的增加，添加了促生菌剂的4个处理组对于株高的提升效果增加，在灌浆期后显著高于化肥处理组（P<0.05）。在成熟期轻度盐碱胁迫下HF组、MY组、MYM组、WY组和WYM组使水稻株高分别提高4.56、9.18、10.95、7.98和11.97 cm；在成熟期中度盐碱胁迫下HF组、MY组、MYM组、WY组和WYM组使水稻株高分别提升2.98、7.98、12.33、9.14和14.18 cm。在轻度及中度盐碱胁迫下均以WYM组提升效果最为明显。
6.3 对水稻分孽数的影响
如表13所示，水稻秧苗在田间经过返青期的恢复之后，将会进入水稻生长发育的关键阶段-分蘖阶段，水稻进入分蘖期之后，在水稻基部会不断***出新的小枝，这就是分蘖，分蘖数的增加可扩大水稻光合作用的叶面积，有利于水稻本身生物量的累积。在本实验中水稻分蘖数随着盐碱化程度的增加而降低，在无盐添加时，在不同时期中添加了基质及促生菌剂的4个处理组提升效果均低于化肥处理。但随着土壤盐碱化程度的增加，4个处理组对于株高的提升效果逐渐增加，在种植后期明显优于化肥处理组。但在模拟盐碱土中，4个处理组之间差异并不显著。
表13不同处理对水稻根茎及分蘖数的影响
时期/处理组 株高（cm）/CK 株高（cm）/轻度 株高（cm）/中度 根长（cm）/CK 根长（cm）/轻度 根长（cm）/中度 分蘖数（个）/CK 分蘖数（个）/轻度 分蘖数（个）/中度
分蘖期/W 33.10±1.15c 28.37±1.04c 25.40±3.08b 25.61±2.90b 22.70±4.73c 17.66±0.95d 2.00±1.00c 1.67±0.58b 1.00±1.00c
分蘖期/HF 50.57±0.68a 37.97±1.62b 35.93±3.59a 34.57±3.61a 24.57±3.53bc 21.84±5.09cd 10.67±1.15a 6.00±1.00a 4.67±0.58b
分蘖期/MY 42.93±2.40b 49.27±7.20a 42.23±2.40a 28.20±0.50ab 27.84±3.82bc 25.02±1.38bc 7.67±2.08ab 6.00±1.00a 6.33±1.15ab
分蘖期/MYM 45.27±1.38b 43.97±4.80ab 44.80±5.72a 30.53±4.48ab 29.61±2.80ab 29.90±2.12ab 6.33±1.53b 6.33±2.31a 6.67±1.53a
分蘖期/WY 43.57±2.55b 39.67±3.83b 46.23±4.97a 29.20±2.29ab 26.96±0.31bc 26.93±1.98bc 10.67±2.52a 6.67±2.08a 7.67±0.58a
分蘖期/WYM 46.77±2.75ab 49.00±0.75a 50.10±4.61a 30.93±5.60ab 31.28±1.33a 31.29±3.84a 9.33±2.52ab 7.33±0.58a 7.67±0.58a
抽穗期/W 48.13±2.65c 38.40±1.45d 35.40±2.25e 29.42±1.28c 27.52±1.04d 20.45±1.30d 2.00±1.00d 1.67±0.58b 1.33±1.15c
抽穗期/HF 71.81±4.99a 51.61±0.17c 45.50±3.44d 41.29±2.87a 31.06±0.10c 25.85±1.96c 14.33±2.52a 7.67±0.58a 6.33±1.53b
抽穗期/MY 61.18±1.65b 64.28±5.56b 61.23±0.92c 32.66±1.17bc 33.00±2.60bc 28.55±1.72bc 9.33±0.58c 8.67±2.08a 10.33±2.89a
抽穗期/MYM 65.25±1.73b 69.40±2.76ab 68.11±2.13ab 36.60±4.33ab 35.55±1.42ab 31.93±1.00ab 13.00±1.00abc 10.33±2.08a 10.67±1.53a
抽穗期/WY 63.18±3.14b 65.63±0.77b 64.23±6.12ab 33.34±3.98bc 33.67±0.40bc 29.61±2.45ab 10.00±2.00bc 9.33±0.58a 11.00±1.73a
抽穗期/WYM 65.70±2.05b 71.87±2.04a 70.32±4.07a 38.37±4.10ab 37.15±1.53a 32.96±1.91a 11.00±2.65abc 10.33±2.52a 10.67±2.08a
灌浆期/W 58.70±1.59c 47.80±0.43e 42.79±2.06d 33.03±5.86c 29.29±3.90c 23.93±0.64d 2.33±0.58c 1.33±1.15c 0.33±0.58c
灌浆期/HF 91.17±1.74a 67.34±0.66d 56.14±1.33c 46.36±4.34a 32.32±0.74c 26.84±1.01d 13.33±2.52a 7.00±1.00b 6.67±1.53b
灌浆期/MY 83.77±1.29b 75.47±2.09c 70.11±3.35b 37.23±0.90bc 37.27±1.55b 32.53±1.72c 9.33±1.53b 8.00±0.58b 9.00±1.00ab
灌浆期/MYM 87.33±2.51ab 84.23±1.85b 81.47±0.06a 42.17±1.15ab 39.71±1.23ab 37.47±1.49ab 11.00±1.00ab 11.00±1.00a 10.33±2.52ab
灌浆期/WY 85.50±3.64b 76.87±1.74c 73.25±2.62b 37.78±3.05bc 37.80±1.57ab 34.58±3.29bc 9.67±2.52b 8.33±1.15b 7.33±3.51b
灌浆期/WYM 87.67±2.11ab 88.33±1.72a 85.47±3.27a 42.30±5.46ab 41.60±0.75a 39.43±2.93a 9.67±1.15b 12.33±2.08a 11.67±0.58a
成熟期/W 56.93±2.37c 46.68±1.13d 43.10±2.77e 33.21±2.01d 28.32±4.06c 23.83±3.19d 2.67±1.53c 1.33±0.58c 0.33±0.58d
成熟期/HF 92.63±2.28a 66.84±2.85c 56.54±0.15d 47.07±3.42a 32.88±1.05bc 26.81±1.74cd 13.33±3.21a 6.67±0.58b 6.67±1.15c
成熟期/MY 84.73±2.28b 76.12±2.12b 68.29±2.78c 36.27±0.98cd 37.52±2.12b 31.81±2.42bc 10.00±1.73ab 8.33±2.08ab 9.33±1.15ab
成熟期/MYM 86.23±1.79ab 85.37±1.88a 81.53±0.42a 42.47±1.37b 39.27±3.01a 36.16±4.47ab 10.33±0.58ab 10.67±1.15a 9.67±0.58a
成熟期/WY 84.67±2.50b 76.07±2.59b 73.05±0.56b 37.70±1.83c 36.30±2.32b 32.97±1.49ab 7.67±2.52b 8.00±2.00ab 7.67±1.15bc
成熟期/WYM 87.20±1.80ab 87.73±2.81a 84.23±2.15a 43.77±2.37ab 40.29±1.66a 38.01±2.72a 10.33±1.53ab 10.67±2.08a 9.67±0.58a
6.4 对实际盐碱土水稻生理生化指标的影响
如表14所示，在实际盐碱土中，根长和株高也随着种植时间的延长而不断增加，并在成熟期趋于稳定，在WYM组中，根长和株高增长明显，在成熟期时使株高增加了17.20cm，根长增加了18.40cm。分蘖数则不断减少，但WYM组中分蘖数依旧明显增加。由此可见，根际促生菌剂在实际盐碱土中也可有效促进水稻生长。
表14 根际促生菌剂对实际盐碱土水稻生理生化指标的影响
处理组 株高（cm） 根长（cm） 分蘖数（个） 叶绿素（mg·kg-1） 丙二醛（mmol·g-1·FW） CAT（U·mg-1·FW） POD（U·mg-1·FW） 可溶性蛋白（mg·g-1·FW） 可溶性糖（mg·g-1·FW）
分蘖期/W 20.30+2.00 12.70+1.48 2.00+0.00 1.03+0.02 2.08±0.08 332.45±0.46 9.33±0.09 4.16±0.06 0.99±0.01
分蘖期/WYM 29.80+3.83 21.40+0.64 7.00+1.67 1.52+0.05 1.72±0.17 589.16±0.36 16.43±0.23 12.46±0.18 1.06±0.02
抽穗期/W 44.50+2.55 17.8+1.33 0.70+1.33 1.05+0.04 3.08±0.06 452.46±0.62 18.27±0.23 6.13±0.06 1.15±0.02
抽穗期/WYM 65.10+4.65 32.60+2.35 11+2.66 1.65+0.01 1.88±0.05 642.54±0.51 27.00±0.38 18.65±0.04 1.54±0.01
灌浆期/W 53.40+3.84 22.50+1.96 0.60+0.67 1.05+0.03 3.27±0.02 312.46±0.62 18.09±0.91 5.01±0.04 1±0.01
灌浆期/WYM 81.40+5.88 38.70+2.96 11.7+1.33 1.47+0.04 1.32±0.04 642.54±0.51 25.55±0.36 12.09±0.01 1.31±0.01
成熟期/W 52.90+5.28 22.30+1.69 0.6+0.33 / / / / / /
成熟期/WYM 80.10+4.31 40.70+2.93 12.3+1.33 / / / / / /
6.5 对成熟期水稻产量的影响
如表15所示，随着土壤盐碱化程度的增加，水稻各项农艺性状均呈现下降趋势。就总穗数而言，在无盐添加时，HF组提升效果明显，但随着土壤盐碱化程度的增加HF组提升效果逐渐变弱，添加了促生菌剂的4个处理组提升效果变强，但除WMY组外，其他处理组与HF组无明显区别。就有效穗数而言，与W组相比，其他处理组可显著提升水稻有效穗数（P<0.05），但HF组与其他处理组间无明显区别。就穗长和每穗粒数而言，在无盐添加时，HF组提升效果明显，但随着土壤盐碱化程度的增加，添加了促生菌剂的四个处理组提升效果逐渐变强，以MYM组及WYM组促生效果最佳。就结实率及千粒重而言，与W组相比，其他处理组均对水稻结实率有显著提升作用（P<0.05），但各处理组间差异并不显著。在实际盐碱土中（表16），WYM组也对水稻农艺性状有明显提升。
表15不同处理对水稻成熟期产量的影响
处理 总穗数（个） 有效穗数（个） 穗长（cm） 每穗粒数（个） 结实率（%） 千粒重（g）
CK/W 3.33±1.53d 1.67±1.15c 11.98±0.56b 55.33±2.31c 84.44±1.38c 3.85±0.32b
CK/HF 13.00±1.00a 11.67±2.08a 17.24±0.91a 90.00±2.65a 90.00±0.57b 4.49±0.15a
CK/MY 7.33±1.53c 8.67±2.52ab 15.64±0.79a 77.50±4.77b 91.20±0.29b 4.52±0.17a
CK/MYM 10.33±0.58abc 9.67±1.15ab 16.30±1.41a 78.17±2.08b 92.19±3.08ab 4.48±0.07a
CK/WY 9.00±3.00bc 7.67±1.15b 16.63±0.83a 77.83±6.21b 91.62±0.50ab 4.45±0.13a
CK/WYM 11.67±1.15ab 10.33±0.58ab 16.70±0.79a 75.33±0.29b 94.78±1.92a 4.52±0.1a
轻度/W 2.00±1.41c 2.00±1.00b 10.72±0.39d 44.17±2.25c 83.62±0.51d 3.44±0.33c
轻度/HF 8.33±0.58b 7.67±0.58a 13.93±0.79c 69.83±2.57b 88.58±1.72c 3.89±0.51bc
轻度/MY 8.33±1.53b 9.00±1.00a 15.57±0.87bc 70.67±2.52b 90.61±1.40bc 4.4±0.25ab
轻度/MYM 10.00±2.00ab 10.33±3.06a 19.23±1.10a 82.17±7.77a 94.63±0.21a 4.55±0.08a
轻度/WY 8.00±1.00b 9.67±1.53a 16.12±0.77b 69.33±1.15b 92.81±0.45ab 4.42±0.05ab
轻度/WYM 12.00±2.00a 11.00±2.65a 18.46±1.29a 91.67±8.52a 95.12±1.76a 4.48±0.11a
中度/W 1.67±0.58c 1.67±1.15c 8.91±0.71d 39.00±2.65c 83.02±1.82c 2.79±0.22c
中度/HF 7.00±1.00b 6.00±1.00b 11.26±0.93c 64.33±2.08b 86.58±0.44b 3.35±0.1b
中度/MY 8.00±1.00ab 7.67±1.53ab 13.54±0.87b 56.17±4.93b 90.59±1.07a 4.32±0.31a
中度/MYM 9.00±1.00ab 9.00±2.65ab 16.56±0.68a 80.00±8.05a 91.06±0.38a 4.38±0.21a
中度/WY 8.33±0.58ab 7.67±1.53ab 14.57±1.26b 63.67±5.69b 89.64±1.53a 4.37±0.03a
中度/WYM 10.33±2.52a 10.00±2.00a 17.05±0.97a 78.50±5.63a 91.27±1.23a 4.53±0.03a
表16 根际促生菌剂对实际盐碱土水稻产量的影响
处理 总穗数（个） 有效穗数（个） 穗长（cm） 每穗粒数（个） 结实率（%） 千粒重（g）
W 1.33+0.58 1.00+0.01 8.23+0.79 39.67±4.93 0.81±0.06 3.02+0.02
WYM 8.00+1.00 7.67+1.53 16.32+0.56 72.00±1.80 0.88±0.08 4.23+0.14
6.6水稻生理指标分析
叶绿素含量的测定采用丙酮-乙醇直接浸提法；丙二醛含量采用硫代巴比妥算（TBA）比色法测定；CAT（过氧化氢酶）和POD（过氧化物酶）活性分别采用紫外吸收法和愈创木酚法进行测定，可溶性糖和可溶性蛋白含量采用蒽酮比色法和考马斯亮蓝法进行测定。
6.6.1 对水稻叶绿素含量的影响
如图10a所示，在整个种植过程中，叶片叶绿素含量随着盐碱化程度的增加而不断降低，且在分蘖期和抽穗期相对稳定，在灌浆期大幅下降。在无盐添加时，相较于促生菌剂处理组，化肥处理组对叶绿素含量提升效果显著（P<0.05），但随着土壤盐碱化程度的增加，添加了促生菌剂的4个处理组对于叶绿素含量的提升效果逐渐增加，显著高于化肥处理组（P<0.05）。在抽穗期轻度盐碱胁迫下，MY组、MYM组、WY组和WYM组的叶绿素含量分别提升40.87%、55.22%、42.03%和67.15%，在成熟期中度盐碱胁迫下，MY组、MYM组、WY组、WYM组使叶绿素含量分别提升74.39%、107.16%、76.41%和113.56%。在同一时期同一盐浓度添加下，根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）的提升效果普遍高于有机基质处理组（MY组、WY组）。
6.6.2 对水稻丙二醛含量的影响
丙二醛是植物过氧化产生的副产物，过多积累会破坏植物结构甚至引起植物死。如图10b所示，叶片内丙二醛的含量随着盐碱化程度的增加而不断升高，且随着种植时间的延长而不断积累，在分蘖期轻度及中度盐碱胁迫下，丙二醛含量分别上升31.23%和41.38%；在灌浆期轻度及中度盐碱胁迫下，丙二醛含量分别上升37.87%和67.96%。在无盐添加时，各处理组丙二醛含量相差不大，但随着盐碱化程度的增加，添加了促生菌剂的四个处理组对于丙二醛的降低效果逐渐增加，显著高于化肥处理组（P<0.05）。在成熟期轻度盐碱胁迫下，MY组、MYM组、WY组、WYM组使丙二醛含量分别下降17.34%、31.63%、18.73%和37.99%，在成熟期中度盐碱胁迫下，MY组、MYM组、WY组、WYM组使丙二醛含量分别下降26.79%、37.48%、28.08%和45.72%。在同一时期同一盐浓度添加下，根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）的降低效果显著（P<0.05）高于有机基质处理组（MY组、WY组），且以WYM组效果最好。
在实际盐碱土中（表16），不同时期叶绿素含量变化不大，相较于W组，WYM组使叶绿素分别提升了40.00%-57.14%。丙二醛随着种植时间的延长而不断积累，相较于W组，WYM组使丙二醛含量分别下降了17.31%-59.63%。
6.6.3 对不同时期水稻CAT和POD活性的影响
CAT和POD等抗氧化酶可以帮助植物缓解氧化胁迫，降低盐碱胁迫对其的影响。如图11a所示，各处理组中叶片CAT活性随着土壤盐碱化程度的增加而呈现先上升后下降的趋势。在无盐添加时，除WYM组外，其他各处理组之间并无明显差异。在轻度及中度盐碱胁迫下，与W组相比，HF组对CAT活性并无明显提升，但其他促生菌剂处理组均能显著提升叶片中CAT活性。在抽穗期轻度盐碱胁迫下，MY组、MYM组、WY组、WYM组使CAT活性分别提升35.68%、37.47%、35.96%、41.35%；在抽穗期中度盐碱胁迫下，MY组、MYM组、WY组和WYM组使CAT活性分别提升14.25%、27.86%、17.66%和34.28%。对在同一时期同一盐浓度添加下，根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）的提升效果显著（P<0.05）高于有机基质处理组（MY组、WY组），且以WYM组效果最好。
如图11b所示，在整个种植过程中，各处理组中叶片POD活性也随着土壤盐碱化程度的增加而呈现先上升后下降的趋势。在无盐添加时，除WYM组外，其他各处理组之间并无明显差异。在轻度盐碱胁迫下，各处理组均可显著提升POD活性（P<0.05）；但在高浓度盐添加下，HF组对POD活性并无明显提升作用，仅添加了促生菌剂的处理组可显著提升叶片POD活性（P<0.05）。对在同一时期同一盐浓度添加下，提升效果大小均为WYM组> MYM组> WY组>MY组>HF组。
在实际盐碱土的试验（方法同本实施例盆栽试验）中，应用未灭菌有机基质+促生菌剂（WYM组），也出现相似同的结果如表16所示。在实际盐碱土中，叶片CAT活性及POD活性随着种植时间的延长而呈现出先上升后下降的趋势，WYM组促生效果也依旧明显，使CAT活性提升了77.22%-105.64%，使POD活性提升了35.71%-76.10%。
6.6.4 对不同时期水稻可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响
可溶性糖和可溶性蛋白是植物在盐碱胁迫下积累的有机渗透性物质，有助于植物平衡渗透压，降低损伤。如图12a所示，W组叶片可溶性蛋白含量随着盐碱化程度的增加而不断下降，相较于无盐添加时，轻度盐碱胁迫下W组叶片可溶性蛋白含量降低25.75%-28.91%，中度盐碱胁迫下降低38.01%-52.35%。在无盐添加时，与W组相比，化肥处理组可以显著提升水稻可溶性蛋白含量（P<0.05），但随着种植时间的增加，两个根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）对于可溶性蛋白含量的提升效果逐渐增加，分蘖期后显著高于化肥处理组（P<0.05）。在轻度盐碱胁迫下，各处理组在灌浆期提升效果差异较小，分蘖期及抽穗期差异明显。在中度盐碱胁迫下，各时期提升效果均较为明显。在同一时期同一盐浓度下，WYM组对可溶性蛋白含量提升效果的提升效显著高于其他处理组（P<0.05），且在中度盐碱胁迫下效果高于中度盐碱胁迫，相较于W组最高可提升11.33 mg·g-1·FW。
如图12b所示，W组叶片可溶性糖含量也随着盐碱化程度的增加而不断下降。在无盐添加时，与W组相比，化肥处理组可以显著提升水稻叶片可溶性蛋白含量（P<0.05），但随着种植时间的增加，两个根际促生菌剂处理组（MYM组、WYM组）对于可溶性蛋白含量的提升效果逐渐增加，分蘖期后开始高于化肥处理组。在轻度盐碱胁迫下，各处理组在灌浆期提升效果差异较小，抽穗期差异明显。在中度盐碱胁迫下，各时期均差异明显。在同一时期同一盐浓度下，WYM组对可溶性糖含量提升效果的提升效显著高于其他处理组（P<0.05），且在中度盐碱胁迫下效果高于轻度盐碱胁迫，相较于W组可提升20.89%-27.28%。
在实际盐碱土的试验（方法同本实施例盆栽试验）中，应用未灭菌有机基质+促生菌剂（WYM组），也出现相似同的结果（表16）。叶片可溶性糖及可溶性盐含量随着种植时间的延长而呈现出先上升后下降的趋势，WYM组促生效果明显，使可溶性蛋白含量提升了141.32%-204.24%，使可溶性糖含量提升了7.07%-33.91%。
7.数据分析：使利用SPSS 26.0软件进行单因素方差（ANOVA）分析及Pearson相关性分析，并用Origin 2021软件绘制相关图形。
综上所述，在对水稻盆栽土壤理化性质及土壤酶活性的分析中发现，不同生长时期，相较于化肥处理组和有机堆肥处理组，添加了促生菌剂的MYM处理组和WYM处理组作用效果明显，在盐碱胁迫下显著降低了土壤pH，可溶性盐及交换性钠离子含量，提高了有机质、速效磷、速效钾含量及土壤酶活性，有效改善了水稻土壤微环境，提升土壤中微生物丰富度及多样性。在对水稻农艺性状及生理生化指标的分析中发现，不同生长时期，相较于化肥处理组和有机堆肥处理组，添加了促生菌剂的MYM处理组和WYM处理组显著提升了水稻农艺性状及叶绿素含量，并有效提高了水稻叶片中抗氧化酶（CAT、POD）活性以及渗透性物质（可溶性糖和可溶性蛋白）含量，减少了丙二醛的积累，减轻了盐碱胁迫，促进了水稻生长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种耐盐碱根际促生菌剂，其特征在于，所述菌剂包括如下菌株：特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）CSJS-1、塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）RGPF-1、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）RGPF-2和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）RGPB-1；
所述特基拉芽孢杆菌CSJS-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27150，保藏时间为2023年07月05日；
所述塔宾曲霉RGPF-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40731，保藏时间为2023年07月13日；
所述产黄青霉RGPF-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40732，保藏时间为2023年07月13日；
所述贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27879，保藏时间为2023年07月13日。
2.如权利要求1所述的耐盐碱根际促生菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将特基拉芽孢杆菌CSJS-1和贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1分别接种到LB液体培养基中培养，分别制成菌悬液；将塔宾曲霉RGPF-1和产黄青霉RGPF-2分别接种到PDA固体培养基培养，待培养产孢后，分别制成孢子悬液；将所述菌悬液及孢子悬液混合，得混合悬液，接种到腐熟牛粪堆肥中，培养，即得根际促生复合菌剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，于LB液体培养基中培养的温度为25~33℃，培养的时间为12~36h。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述菌悬液的OD值为0.5~1.5。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，于PDA固体培养基中培养的温度为25~30℃，培养的时间为3~6d。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述孢子悬液的孢子个数为0.5~1.5×109个·mL-1。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述混合悬液中特基拉芽孢杆菌CSJS-1、贝莱斯芽孢杆菌RGPB-1、塔宾曲霉RGPF-1和产黄青霉RGPF-2的体积比为0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，于腐熟牛粪堆肥中培养的时间为3~8天，培养的温度为25~30℃。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将混合悬液按体积质量百分比为3~8%的接种量接种于腐熟牛粪堆肥中，所述腐熟牛粪堆肥的质量以腐熟牛粪堆肥干重计。
10.如权利要求1所述的耐盐碱根际促生菌剂在改良盐碱地或盐碱胁迫下水稻促生中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117143762A (zh) * 2023-07-25 2023-12-01 上海原本生物科技有限公司 具有钝化重金属镉及促生长双重特性的芽孢杆菌及其应用
CN117586925A (zh) * 2024-01-18 2024-02-23 哈尔滨长升吉时农业发展有限公司 特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂、生物肥料与应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104726378A (zh) * 2015-03-30 2015-06-24 天津师范大学 采用强化耐盐微生物菌剂提高盐胁迫草坪草保护酶活性的方法
CN106635903A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合
CN106754515A (zh) * 2016-12-23 2017-05-31 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种提高作物耐盐能力促生菌株的筛选方法
CN110904001A (zh) * 2019-11-18 2020-03-24 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用
CN113416675A (zh) * 2021-06-27 2021-09-21 山东农业大学 一种耐盐碱的根际促生菌及其应用
CN113564083A (zh) * 2021-08-12 2021-10-29 甘肃省科学院生物研究所 一种极端生境生物有机肥菌株筛选方法及菌剂复配工艺
CN114196563A (zh) * 2021-08-25 2022-03-18 广西民族大学 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN116121105A (zh) * 2022-09-23 2023-05-16 中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心 一株兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌ys-at-ds1及其应用
WO2023138678A1 (zh) * 2022-01-21 2023-07-27 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN116814459A (zh) * 2023-01-02 2023-09-29 西北农林科技大学 一种兼具诱导黄瓜促生和耐盐碱功能的微生物菌株及其施用配方
CN117025446A (zh) * 2023-07-05 2023-11-10 江汉大学 一种特基拉芽孢杆菌Sys76及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104726378A (zh) * 2015-03-30 2015-06-24 天津师范大学 采用强化耐盐微生物菌剂提高盐胁迫草坪草保护酶活性的方法
CN106635903A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合
CN106754515A (zh) * 2016-12-23 2017-05-31 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种提高作物耐盐能力促生菌株的筛选方法
CN110904001A (zh) * 2019-11-18 2020-03-24 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用
CN113416675A (zh) * 2021-06-27 2021-09-21 山东农业大学 一种耐盐碱的根际促生菌及其应用
CN113564083A (zh) * 2021-08-12 2021-10-29 甘肃省科学院生物研究所 一种极端生境生物有机肥菌株筛选方法及菌剂复配工艺
CN114196563A (zh) * 2021-08-25 2022-03-18 广西民族大学 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
WO2023138678A1 (zh) * 2022-01-21 2023-07-27 慕恩（广州）生物科技有限公司 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN116121105A (zh) * 2022-09-23 2023-05-16 中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心 一株兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌ys-at-ds1及其应用
CN116814459A (zh) * 2023-01-02 2023-09-29 西北农林科技大学 一种兼具诱导黄瓜促生和耐盐碱功能的微生物菌株及其施用配方
CN117025446A (zh) * 2023-07-05 2023-11-10 江汉大学 一种特基拉芽孢杆菌Sys76及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAKIBA SHULTANA ET AL.: ""Characterization of salt-tolerant plant growthpromoting rhizobacteria and the effect on growth and yield of saline-affected rice"", 《PLOS ONE》, vol. 15, no. 9, 4 September 2020 (2020-09-04), pages 1 - 16 *
王宏燕 等: ""耐盐解磷菌筛选鉴定及生理特性研究"", 《东北农业大学学报》, vol. 54, no. 5, 31 May 2023 (2023-05-31), pages 28 - 37 *
荣子惠 等: ""2株耐盐碱芽孢杆菌对盐胁迫下葡萄的促生作用研究"", 《植物医学》, vol. 2, no. 6, 31 December 2023 (2023-12-31), pages 43 - 53 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117143762A (zh) * 2023-07-25 2023-12-01 上海原本生物科技有限公司 具有钝化重金属镉及促生长双重特性的芽孢杆菌及其应用
CN117143762B (zh) * 2023-07-25 2024-06-04 上海原本生物科技有限公司 具有钝化重金属镉及促生长双重特性的芽孢杆菌及其应用
CN117586925A (zh) * 2024-01-18 2024-02-23 哈尔滨长升吉时农业发展有限公司 特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂、生物肥料与应用
CN117586925B (zh) * 2024-01-18 2024-04-12 哈尔滨长升吉时农业发展有限公司 特基拉芽孢杆菌、菌剂、植物促生长剂、生物肥料与应用

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