CN117598950B - 一种含卡瓦胡椒根的提取物、制备方法和在舒缓修护功效化妆品中的应用 - Google Patents
一种含卡瓦胡椒根的提取物、制备方法和在舒缓修护功效化妆品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种含卡瓦胡椒根的提取物、制备方法和在舒缓修护功效化妆品中的应用。本申请的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法包括：(1)将巴斯德毕赤酵母种子液接种至发酵基质中发酵，得到粗发酵液；(2)对粗发酵液进行灭菌、裂解和过滤，得到含卡瓦胡椒根的提取物；其中，发酵基质包括卡瓦胡椒根和绿豆籽。本申请采用巴斯德毕赤酵母同时对卡瓦胡椒根和绿豆籽同时进行发酵提取，发酵过程中卡瓦胡椒根和绿豆籽协同发挥作用，最终得到的提取物具有很好的舒缓修护功效，且提取物安全无刺激，适合应用在制备化妆品中。
Description
技术领域
本申请属于植物提取技术领域，具体涉及一种含卡瓦胡椒根的提取物、制备方法和在舒缓修护功效化妆品中的应用。
背景技术
随着人类社会的不断发展，生活节奏变快、压力也随之增大，人们出现皮肤敏感的问题也越来越频繁。皮肤敏感问题在男女中、不同年龄段之间均逐年增多。气候因数、生活方式等问题是引起皮肤敏感的重要因素。另一方面，随着生活水平的提升，消费者开始关注自身皮肤问题，开始对自身皮肤的问题针对性使用一些功效高、起效快的护肤产品或医美产品。然而，这些产品使用不当会加剧了皮肤的敏感问题，导致人们的皮肤屏障越来越脆弱，肌肤防御能力下降引发泛红、刺痛等一系列问题。
目前，化妆品市场推出一些具有舒缓和修护功效的护肤品以减缓消费者皮肤的泛红、刺痛问题。一些效果较好的护肤品通常加入了抗组胺药物、肾上腺皮质类固醇外用剂、非甾体类抗炎药物等激素作为起效物，长期使用容易引起肾上腺皮质功能低下和反弹现象之类的缺陷和不良反应，如何提供一种安全高效、具有很好的舒缓和修护功效的化妆品原料，成为目前亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本申请的首要目的在于提供一种含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法。
本申请含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法通过以下方案实现：
一种含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法，包括：
(1)将巴斯德毕赤酵母种子液接种至发酵基质中发酵，得到粗发酵液；
(2)对所述粗发酵液进行灭菌、裂解和过滤，得到含卡瓦胡椒根的提取物；其中，所述发酵基质包括卡瓦胡椒根和绿豆籽。
进一步地，在步骤(1)中，所述巴斯德毕赤酵母种子液的接种量为所述发酵基质的3-5％(v/v)。
进一步地，在步骤(1)中，所述巴斯德毕赤酵母种子液的制备方法为：
B1、将巴斯德毕赤酵母菌落接种至液体培养基中一次培养，得到悬浮液；
B2、将所述悬浮液接种至所述液体培养基中二次培养，得到所述巴斯德毕赤酵母种子液。
更进一步地，在步骤B1或步骤B2中，所述液体培养基包括麦芽汁培养基、PDB培养基、YPD培养基、孟加拉红培养基中至少一种。
更进一步地，在步骤B1中，所述一次培养的温度为28-33℃，所述一次培养的时间为20-28h。
更近一步地，在步骤B2中，所述悬浮液的接种量为所述液体培养基的0.8-2％(v/v)。
更进一步地，在步骤B2中，所述二次培养的温度为28-33℃，所述二次培养的时间为36-60h。
进一步地，在步骤(1)中，所述卡瓦胡椒根和绿豆籽的总质量为所述发酵基质质量的0.8-2％。
进一步地，在步骤(1)中，所述卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为(3-9):1。
更近一步地，所述卡瓦胡椒根为干燥的卡瓦胡椒根粉。
更近一步地，所述卡瓦胡椒根粉的制备方法为：将干燥的卡瓦胡椒根粉碎，过筛后取下层粉末备用。
更近一步地，所述绿豆籽为干燥的绿豆籽粉。
更近一步地，所述绿豆籽粉的制备方法为：将干燥的绿豆籽粉碎，过筛后取下层粉末备用。
进一步地，在步骤(1)中，所述发酵基质还包括营养物和水。
更进一步地，所述营养物的加入量为所述发酵基质质量的1.5-5％，水的加入量为补足至所述发酵基质总质量的100％。
更进一步地，所述营养物包括啤酒糟、鱼粉、玉米浆中至少一种。
进一步地，在步骤(1)中，所述发酵的温度为28-33℃，所述发酵的时间为50-70h。
进一步地，步骤(2)中所述灭菌为将步骤(1)所述粗发酵液于80-95℃下保温15-30min。
进一步地，步骤(2)中所述裂解为高压均质处理，所述高压均质处理的压力为20-50Mpa，所述高压均质处理的时间为15-50min。
卡瓦胡椒是胡椒科多年生直立灌木类药用植物，其根、茎、叶可入药。卡瓦胡椒含有卡瓦内酯、麻醉椒碱、醉椒素等活性成分。现代药理研究表明，卡瓦胡椒提取物具有抗焦虑、镇静催眠、局部麻醉、抑菌、松弛肌肉、改善精神状态等多种作用。
绿豆籽即常说的绿豆，又名青小豆。绿豆属高蛋白、低脂肪、中淀粉作物，营养丰富，经济利用价值高。此外，绿豆含有大量的生物活性物质，如氨基酸、黄酮类化合物、酚类化合物、低聚糖等，现在医学认为绿豆在抗炎、抑菌、降脂、抗肿瘤和解毒方面具有很好的功效。
本申请采用巴斯德毕赤酵母作为发酵菌种，同时对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵提取物。发酵过程中，巴斯德毕赤酵母利用发酵基质中卡瓦胡椒根、绿豆籽以及其他营养物完成自身生长和繁殖，发酵过程中巴斯德毕赤酵母的生长和繁殖促使卡瓦胡椒根和绿豆籽细胞壁破碎，使得瓦胡椒根和绿豆籽细胞内有效成分得以暴露，有利于活性物质的流出。此外，巴斯德毕赤酵母在生长过程中产生次级代谢产物，使得最终的提取物具有很好的舒缓、修护、镇静和减少刺痛的功效。
本申请的另一目的在于提供上述方法制备得到的含有卡瓦胡椒根的提取物。
本申请的再一目的在于提供上述含卡瓦胡椒根的提取物在制备舒缓修护功效化妆品中的应用。
进一步地，以质量百分比计，本申请的含卡瓦胡椒根的提取物在舒缓修护功效化妆品的添加量为0.01-30％。
与现有技术比较，本申请的有益效果：
(1)本申请使用巴斯德毕赤酵母同时对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵提取，避免了卡瓦胡椒根、绿豆籽单独提取，简化了发酵提取的工艺，减少生产成本和发酵时间。
(2)本申请通过发酵工艺同时对卡瓦胡椒根和绿豆籽植物内的活性物质进行提取，巴斯德毕赤酵母在发酵基质中利用营养物完成自身生长和繁殖的同时，巴斯德毕赤酵母代谢过程中的各种酶的作用有利于卡瓦胡椒根和绿豆籽的细胞壁碎裂，促使卡瓦胡椒根和绿豆籽细胞内的活性物质溶出至粗发酵液中，提高了卡瓦胡椒根和绿豆籽的提取效率。
(3)本申请通过对菌种、对卡瓦胡椒植物的部位、豆的种类、绿豆的最佳发酵状态进行了大量的筛选，最终发现选用卡瓦胡椒的根部、不发芽处理的绿豆籽作为发酵原料、以巴斯德毕赤酵母作为发酵菌种，以合适质量比卡瓦胡椒根与绿豆籽进行发酵，最终得到的提取物具有很好的舒缓、修护效果。且在人体功效评价中，提取物还具有镇静皮肤、减轻皮肤瘙痒的作用。
(4)本申请在发酵提取过程不使用有机溶剂，生产过程绿色环保，得到的提取物安全高效，具有很好的舒缓、修护、镇静皮肤、减轻皮肤瘙痒的效果，适合应用在制备具有舒缓修护功效的化妆品中。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步详细的描述，但本申请的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从商业途径购得。
除特殊说明外，本申请所提及的百分比均为质量百分比。
本申请所用的巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母BNCC225716，该菌种均购于北京北纳创联生物技术研究院。
本申请所用的酿酒酵母为酿酒酵母BNCC337309，该菌种均购于北京北纳创联生物技术研究院。
本申请所用的米曲霉为米曲霉BNCC336549，该菌种均购于北京北纳创联生物技术研究院。
本申请所用的德氏乳杆菌保加利亚亚种为德氏乳杆菌保加利亚亚种BNCC187941，该菌种均购于北京北纳创联生物技术研究院。
本申请所用的麦芽汁培养基、PDB培养基、YPD培养基、孟加拉红培养基、MRS培养基可以通过商业途径获得，也可以通过以下方式制备得到：
麦芽汁培养基的配制方法为(以制备1L的麦芽汁培养基为例)：取1份麦芽粉加4份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全；糖化液用4-6层纱布过滤，用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6.4,于115-130℃灭菌20-30min后贮存备用。
PDB培养基的配制方法为(以制备1L的PDB培养基为例)：将马铃薯去皮，切成小块(共200g)，加入水，煮沸30ml，用双层纱布过滤，取其滤液加入20g葡萄糖，用水补足至1L，于115-130℃灭菌20-30min后贮存备用。
YPD培养基的配制方法为(以制备1L的YPD培养基为例)：将10g酵母膏、20g蛋白胨、20g葡萄糖溶于1L水中，混合均匀，于115-130℃灭菌20-30min后贮存备用。
孟加拉红培养基的配制方法为(以制备1L的孟加拉红培养基为例)：蛋白胨5-10g、葡萄糖10-20g、KH2PO4 1-3g、MgSO4·7H2O 0.5-3g、氯霉素0.1-0.5g、1/3000孟加拉红溶液100-200mL，蒸馏水加至1L，于115-130℃灭菌20-30min后贮存备用。
MRS培养基的配制方法为(以制备1L的MRS培养基为例)：蛋白胨10g,牛肉浸粉8g，酵母粉4g，葡萄糖20g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1g，蒸馏水加至1L，于115-130℃灭菌20-30min后贮存备用。
本申请实施例和对比例中的发酵基质的制备方法为：将植物粉末(卡瓦胡椒根粉、绿豆籽粉、卡瓦胡椒叶粉、卡瓦胡椒茎粉、黄豆粉、红豆粉中至少一种，根据各实施例或对比例中的要求加入)、营养物和水混合均匀，于115-130℃灭菌20-30min后贮存备用。
实施例1
一种含卡瓦胡椒根的提取物，其制备方法为：
(1)将巴斯德毕赤酵母种子液以4％(v/v)的接种量接种至发酵基质中，于30℃下发酵60h，得到粗发酵液；
(2)对步骤(1)制备得到的粗发酵液于90℃下保温20min，得到灭菌后的粗发酵液；将灭菌后的粗发酵液在35Mpa下高压均质30min，得到裂解后的粗发酵液，对裂解后的粗发酵液进行过滤处理，所得滤液为含卡瓦胡椒根的提取物。
其中，巴斯德毕赤酵母种子液的制备方法为：
B1、用接种环挑取巴斯德毕赤酵母菌落接种至YPD培养基中，于30℃下一次培养24h，得到悬浮液；
B2、将步骤B1的悬浮液以1.3％(v/v)的接种量接种至YPD培养基中，于30℃下二次培养48h，得到巴斯德毕赤酵母种子液。
以质量百分比计，发酵基质包括1.0％卡瓦胡椒根粉、0.2％绿豆籽粉、3％啤酒糟和95.8％去离子水。
在本实施例中，卡瓦胡椒根粉和绿豆籽粉的总质量百分比为1.2％，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为5:1。
实施例2
一种含卡瓦胡椒根的提取物，其制备方法为：
(1)将巴斯德毕赤酵母种子液以3％(v/v)的接种量接种至发酵基质中，于28℃下发酵50h，得到粗发酵液；
(2)对步骤(1)制备得到的粗发酵液于80℃下保温30min，得到灭菌后的粗发酵液；将灭菌后的粗发酵液在50Mpa下高压均质15min，得到裂解后的粗发酵液，对裂解后的粗发酵液进行过滤处理，所得滤液为含卡瓦胡椒根的提取物。
其中，巴斯德毕赤酵母种子液的制备方法为：
B1、用接种环挑取巴斯德毕赤酵母菌落接种至PDB培养基中，于28℃下一次培养28h，得到悬浮液；
B2、将步骤B1的悬浮液以0.8％(v/v)的接种量接种至PDB培养基中，于33℃下二次培养60h，得到巴斯德毕赤酵母种子液。
以质量百分比计，发酵基质包括1.75％卡瓦胡椒根粉、0.25％绿豆籽粉、3.5％玉米浆和94.5％去离子水。
在本实施例中，卡瓦胡椒根粉和绿豆籽粉的总质量百分比为2.0％，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为7:1。
实施例3
一种含卡瓦胡椒根的提取物，其制备方法为：
(1)将巴斯德毕赤酵母种子液以5％(v/v)的接种量接种至发酵基质中，于33℃下发酵70h，得到粗发酵液；
(2)对步骤(1)制备得到的粗发酵液于95℃下保温15min，得到灭菌后的粗发酵液；将灭菌后的粗发酵液在30Mpa下高压均质50min，得到裂解后的粗发酵液，对裂解后的粗发酵液进行过滤处理，所得滤液为含卡瓦胡椒根的提取物。
其中，巴斯德毕赤酵母种子液的制备方法为：
B1、用接种环挑取巴斯德毕赤酵母菌落接种至孟加拉红培养基中，于33℃下一次培养20h，得到悬浮液；
B2、将步骤B1的悬浮液以2％(v/v)的接种量接种至孟加拉红培养基中，于28℃下二次培养36h，得到巴斯德毕赤酵母种子液。
以质量百分比计，发酵基质包括0.64％卡瓦胡椒根粉、0.16％绿豆籽粉、4％鱼粉和95.2％去离子水。
在本实施例中，卡瓦胡椒根粉和绿豆籽粉的总质量百分比为0.8％，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为4:1。
实施例4
与实施例1相比，本实施例的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法区别在于：发酵基质包括0.9％卡瓦胡椒根粉和0.3％绿豆籽粉，其余的步骤和参数同实施例1。
在本实施例中，卡瓦胡椒根粉和绿豆籽粉的总质量百分比为1.2％，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为3:1。
实施例5
与实施例1相比，本实施例的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法区别在于：发酵基质包括1.08％卡瓦胡椒根粉和0.12％绿豆籽粉，其余的步骤和参数同实施例1。
在本实施例中，卡瓦胡椒根粉和绿豆籽粉的总质量百分比为1.2％，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为9:1。
实施例6
与实施例1相比，本实施例的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法区别在于：发酵基质中的3％啤酒糟改为3％的鱼粉，其余的步骤和参数同实施例1。
实施例7
与实施例1相比，本实施例的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法区别在于：发酵基质中的3％啤酒糟改为3％的玉米浆，其余的步骤和参数同实施例1。
实施例8
与实施例1相比，本实施例的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法区别在于：发酵基质中的3％啤酒糟改为1.5％的啤酒糟，调整离子水用量至发酵基质总质量100％，其余的步骤和参数同实施例1。
实施例9
与实施例1相比，本实施例的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法区别在于：发酵基质中的3％啤酒糟改为5％的啤酒糟，调整离子水用量至发酵基质总质量100％，其余的步骤和参数同实施例1。
实施例10
与实施例1相比，本实施例的含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法区别在于：步骤(2)中高压均质处理的压力改为20Mpa，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例1
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例采用酿酒酵母对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵提取，其余的步骤和参数同实施例1。
其中，酿酒酵母种子液的制备方法为：
B1、用接种环提取酿酒酵母菌落接种至YPD培养基中，于30℃下一次培养24h，得到悬浮液；
B2、将步骤B1的悬浮液以1.3％(v/v)的接种量接种至YPD培养基中，于30℃下二次培养48h，得到酿酒酵母种子液。
对比例2
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例采用米曲霉对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵提取，其余的步骤和参数同实施例1。
其中，米曲霉种子液的制备方法为：
B1、用接种环提取米曲霉菌落接种至PDB培养基中，于30℃下一次培养24h，得到悬浮液；
B2、将步骤B1的悬浮液以1.3％(v/v)的接种量接种至PDB培养基中，于30℃下二次培养48h，得到米曲霉种子液。
对比例3
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例采用德氏乳杆菌保加利亚亚种对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵提取，制备方法为：
(1)将德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液以4％(v/v)的接种量接种至发酵基质中，于37℃下发酵60h，得到粗发酵液；
(2)对步骤(1)制备得到的粗发酵液于90℃下保温20min，得到灭菌后的粗发酵液；将灭菌后的粗发酵液在35Mpa下高压均质30min，得到裂解后的粗发酵液，对裂解后的粗发酵液进行过滤处理，所得滤液为提取物。
其中，德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液的制备方法为：
B1、用接种环提取德氏乳杆菌保加利亚亚种菌落接种至MRS培养基中，于37℃下一次培养24h，得到悬浮液；
B2、将步骤B1的悬浮液以1.3％(v/v)的接种量接种至MRS培养基中，于37℃下二次培养48h，得到德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液。
对比例3的发酵基质与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中1.0％卡瓦胡椒根粉和0.2％绿豆籽粉改为1.2％卡瓦胡椒根粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例5
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中1.0％卡瓦胡椒根粉和0.2％绿豆籽粉改为1.2％绿豆籽粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例6
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中1.0％卡瓦胡椒根粉和0.2％绿豆籽粉改为0.6％卡瓦胡椒根粉和0.6％绿豆籽粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例7
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中1.0％卡瓦胡椒根粉改为1.0％卡瓦胡椒叶粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例8
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中1.0％卡瓦胡椒根粉改为1.0％卡瓦胡椒茎粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例9
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中0.2％绿豆籽粉改为0.2％黄豆粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例10
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中0.2％绿豆籽粉改为0.2％红豆粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例11
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中0.2％绿豆籽进行发芽后，再加入至发酵基质中进行发酵(发酵基质中去离子水的质量可以进行调整，以使发酵基质的总质量为100％)。
其中，绿豆籽的发酵方法为：在托盘平铺一湿润毛巾作为铺底，将绿豆籽平铺在毛巾上，在托盘中加入绿豆籽重量3倍的水将绿豆籽浸润，再在绿豆籽表面覆盖湿润的毛巾，在温度40℃、相对湿度为90％的条件下为进行发芽，得到发芽绿豆。发芽绿豆粉碎后再加入至发酵基质中。
对比例12
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例在对粗发酵液灭菌后，不进行裂解，直接将灭菌后的的粗发酵液进行过滤处理，所得滤液为本对比例的提取物，具体制备方法如下：
(1)将巴斯德毕赤酵母种子液以3％(v/v)的接种量接种至发酵基质中，于28℃下发酵50h，得到粗发酵液；
(2)对步骤(1)制备得到的粗发酵液于90℃下保温20min，得到灭菌后的粗发酵液；将灭菌后的粗发酵液进行过滤处理，所得滤液为本对比例提取物。
巴斯德毕赤酵母种子液的制备方法和发酵基质均与实施例1相同。
对比例13
与实施例1相比，本对比例的提取物的制备方法区别在于：本对比例将发酵基质中3％啤酒糟改为3％脱脂奶粉，其余的步骤和参数同实施例1。
对比例14
一种提取物，其制备方法为：
将1.0％卡瓦胡椒根粉、0.2％绿豆籽粉和余量水混合均匀，在60℃、30KHz的频率下超声提取3h，过滤后所得滤液为提取物。
与实施例1相比，本对比例的提取物的区别在于：本对比例采用超声提取的方法对卡瓦胡椒根粉和绿豆籽粉进行提取。
试验例1：舒缓性能测试
测试样品：实施例1-10、对比例1-14的提取物，制备成样品精华液备用；基质精华液。
样品精华液的配方为：去离子水补足至100％；3％实施例1-10或对比例1-14的提取物；3％甘油；0.2％尿囊素；0.5％甜菜碱；5％丁二醇；1％生育酚乙酸酯；0.03％卡波姆；0.2％三乙醇胺；0.5％苯氧乙醇。
样品精华液的制备方法为：在制备容器中加入去离子水、实施例1-10或对比例1-14的提取物、甘油、尿囊素、甜菜碱、丁二醇和生育酚乙酸酯，升温至70℃，搅拌均匀，保温30分钟，得到混合物；将混合物降温至45℃时，加入卡波姆、三乙醇胺和苯氧乙醇，搅拌均匀，降温至室温后得到样品精华液。
基质精华液中不加入实施例1-10或对比例1-14的提取物，以等质量的去离子水代替，基质精华液的制备方法同样品精华液。
测试方法：选取敏感肌皮肤、面部皮肤处于泛红状态、面部皮肤的经皮水分散失值(TEWL值)大于20的志愿者250名(随机分成25组、每10人使用一款精华液，测试结果取平均值。)志愿者自行使用样品精华液或基质精华液，早晚各使用一次，一天共2次。在进行测试期间，志愿者不得使用类似功效护肤品。在使用样品精华液或基质精华液前或使用5天后，测试志愿者的面部皮肤经皮水分散失值(TEWL值)，计算志愿者面部皮肤经皮水分散失值的变化率。
皮肤经皮水分散失值的变化率(％)＝(T5d-T0d)/T0d×100％
T5d指使用5天后志愿者面部皮肤经皮水分散失值；
T0d指使用前志愿者面部皮肤经皮水分散失值。
测试仪器：经表皮水分流失仪Vapometer。
皮肤经皮水分散失值指皮肤水分的蒸发值(单位：g/m2h)，适当的皮肤水分蒸发是正常的皮肤新陈代谢。皮肤经皮水分散失值过大，则表明测试者皮肤屏障受损。在使用测试样品后，皮肤经皮水分散失值变小，则表明测试者皮肤屏障得到恢复，皮肤状态得到舒缓，皮肤水分的蒸发值变少。皮肤经皮水分散失值的变化率绝对值越大，则表明皮肤屏障恢复越好，测试样品的舒缓效果越好。
测试结果如表1所示。
表1
测试结果表明，与基质精华液相比，含有本申请实施例和对比例的提取物的精华液皮肤经皮水分散失值的变化率的绝对值更大，说明本申请实施例和对比例的提取物可以在一定程度上减少皮肤表面的水分蒸发，具有一定的舒缓效果。其中，实施例1-10的提取物的精华液的经皮水分散失值的变化率的绝对值大于对比例1-14的提取物的精华液，说明实施例1-10的舒缓效果优于对比例1-14。更进一步地，实施例1-10舒缓效果优于对比例1-3，说明与采用酿酒酵母菌、米曲酶和乳杆菌发酵提取相比，采用巴斯德毕赤酵母对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵提取，得到的提取物的舒缓效果更好，而采用乳杆菌发酵得到的提取物的舒缓效果最差。实施例1-10舒缓效果优于对比例4、5，说明发酵过程中卡瓦胡椒根和绿豆籽之间存在协同作用，两者共同发酵得到的提取物的舒缓效果最好，仅对卡瓦胡椒根或绿豆籽进行发酵，得到的提取物的舒缓效果较差。进一步地，实施例1、4、5的舒缓效果优于对比例6，说明在发酵过程中，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比对最终提取物的舒缓效果有影响，在质量一定的条件下，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为5:1时，舒缓效果最好，当卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为1:1，提取物的舒缓效果变差。在本申请中，卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为应控制在(3-9):1。实施例1-10舒缓效果优于对比例7-11，说明卡瓦胡椒根和绿豆籽共同发酵的效果较好，将卡瓦胡椒根换成卡瓦胡椒叶、卡瓦胡椒茎或者将绿豆籽换成黄豆或红豆，或者提前将绿豆籽进行发芽处理，得到的提取物的舒缓效果均较差，对比例9中用黄豆代替绿豆籽发酵得到提取物，得到的提取物的舒缓效果甚至差于单独使用卡瓦胡椒根发酵得到的提取物。实施例1-10舒缓效果优于对比例12，说明在得到发酵液中，对粗发酵液进行裂解，得到的提取物的舒缓效果较好；若发酵结束后，不进行裂解的步骤，直接对粗发酵液进行灭菌和过滤，得到的仅为巴斯德毕赤酵母细胞外的培养液，巴斯德毕赤酵母细胞内的活性物质不能有效溶出至发酵液，导致发酵液的活性成分大大减少，最终产品的舒缓效果较差。对比例实施例1、6-10、对比例13的结果可知，在制备提取物的过程中，发酵培养基中营养物的种类和含量、高压均质处理的压力的方面对最终得到的提取物的舒缓效果有影响，因此，本申请中营养物的加入量为1.5-5％、营养物选自啤酒糟、鱼粉、玉米浆中至少一种、高压均质处理的压力应设置为20-50Mpa。
试验例2：修护性能测试
测试样品：实施例1-10、对比例1-14的提取物，用去离子水配置成质量分数为2％的水溶液；空白对照组为去离子水。
测试步骤：选取双臂无损伤、遮挡、皮肤光滑的志愿者125人，以志愿者的左右双臂的内侧作为测试部位，每一志愿者各有2个测试部位。在志愿者的手臂内侧标记2cm×2cm的方形区域作为测试区域，每一测试样品随机安排10个测试区域，测试结果取平均值。在测试阶段，用质量分数为50％的辣椒素水溶液对测试区域进行刺激，刺激时间为30min，刺激采集测试区域的皮肤血红素值；在测试区域涂抹测试样品，等待20min后再次采集皮肤的皮肤血红素值，计算涂抹测试样品前后皮肤血红素值变化率。
皮肤血红素值变化率(％)＝(T20min-T0min)/T0min×100％
T20min指使用20min后皮肤血红素值；
T0min指使用前皮肤血红素值(即50％的辣椒素水溶液刺激后的皮肤血红素值)。
测试仪器：皮肤颜色测试仪CL400。
皮肤血红素值反映皮肤的泛红状态，在受到辣椒素水溶液刺激后，测试区域的皮肤迅速泛红，皮肤血红素值升高，若测试区域皮肤血红素值降低得越多，皮肤血红素值变化率的绝对值越大，则表明测试样品的刺激修护效果越好、消红效果越好。
测试结果如表2所示。
表2
| 测试样品 | 皮肤血红素值变化率(％) |
| 空白对照 | -8.6 |
| 实施例1 | -35.2 |
| 实施例2 | -35.0 |
| 实施例3 | -27.3 |
| 实施例4 | -32.5 |
| 实施例5 | -33.8 |
| 实施例6 | -32.0 |
| 实施例7 | -29.7 |
| 实施例8 | -28.5 |
| 实施例9 | -34.8 |
| 实施例10 | -31.1 |
| 对比例1 | -15.4 |
| 对比例2 | -10.5 |
| 对比例3 | -12.3 |
| 对比例4 | -21.8 |
| 对比例5 | -14.2 |
| 对比例6 | -25.2 |
| 对比例7 | -16.9 |
| 对比例8 | -20.6 |
| 对比例9 | -18.3 |
| 对比例10 | -22.1 |
| 对比例11 | -20.8 |
| 对比例12 | -15.4 |
| 对比例13 | -21.0 |
| 对比例14 | -13.6 |
测试结果表明，与空白对照组相比，在受到刺激后使用本申请实施例或对比例的提取物，皮肤血红素值明显降低。本申请实施例和对比例的提取物皮肤血红素值变化率的绝对值大于空白对照组，说明本申请实施例和对比例的提取物均具有一定的刺激修护效果。其中，本申请实施例1-10的提取物的修护效果优于对比例1-14。实施例1-10的修护效果优于对比例1-3，说明本申请中，采用巴斯德毕赤酵母对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵提取，得到的提取物的修护效果最好，酿酒酵母菌的发酵提取效果次之，米曲霉的发酵提取效果最差。实施例1-10的修护效果优于对比例4、5、7-11，说明在发酵过程中，卡瓦胡椒根和绿豆籽之间存在协同作用，两者共同发酵的效果优于单独卡瓦胡椒根或单独绿豆籽的发酵效果，此外，将卡瓦胡椒根替换为卡瓦胡椒的叶、茎部位，对绿豆籽用红豆或黄豆替换，又或者是对绿豆籽发芽后再进行发酵处理，得到的提取物的修护效果变差。实施例1-10的提取物的修护效果优于对比例12,，说明在得到发酵液中，对粗发酵液进行裂解，得到的提取物含有的活性物质更多，修护效果更好。实施例1的修护效果优于实施例4-10、对比例6、13，说明在制备提取物的过程中，发酵培养基中卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比、发酵基质中营养物的种类和含量、高压均质处理的压力对最终得到的提取物的修护效果有影响，因此，本申请中卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比应设置为(3-9):1、营养物的加入量为1.5-5％、营养物选自啤酒糟、鱼粉、玉米浆中至少一种、高压均质处理的压力应设置为20-50Mpa。
试验例3：问卷反馈
测试样品：同试验例1。
测试方法：选取敏感肌皮肤、面部皮肤处于泛红状态、面部皮肤的经皮水分散失值(TEWL值)大于20的志愿者250名(随机分成25组、每10人使用一款精华液，测试结果取平均值。)志愿者自行使用样品精华液或基质精华液，早晚各使用一次，一天共2次。在进行测试期间，志愿者不得使用类似功效护肤品。在使用样品5天后，以测试样品皮肤刺痛改善情况、镇静效果、舒缓效果、修护效果的方面对志愿者进行调查，志愿者采用打分制的方式对测试样品做出评价，满分10分，测试结果去掉最高分和最低分，剩余结果取平均值，分数越高，则表明测试样品的效果越好。
测试结果如表3所示。
表3
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测试结果表明，与基质精华液或者对比例的精华液相比，含有本申请实施例提取物的精华液具有更好的改善皮肤刺痛，舒缓皮肤红肿、镇静皮肤、修护皮肤的作用。实施例1-10的舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果优于对比例1-3，说明本申请中，采用巴斯德毕赤酵母对卡瓦胡椒根和绿豆籽进行发酵，得到的提取物的舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果最好，采用其他菌种发酵提取，得到的提取物的舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果较差。实施例1-10的舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果优于对比例4、5、7-11，说明在发酵过程中，卡瓦胡椒根和绿豆籽之间存在协同作用，两者共同发酵的效果优于单独卡瓦胡椒根或单独绿豆籽的效果，此外，将卡瓦胡椒根替换为卡瓦胡椒的叶、茎部位，对绿豆籽用红豆或黄豆替换，又或者是对绿豆籽发芽后再进行发酵处理，得到的提取物的效果变差。实施例1-10的提取物的舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果优于对比例12,，说明在得到发酵液中，对粗发酵液进行裂解，得到的提取物含有的活性物质更多，舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果更好。实施例1的舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果优于实施例4-10、对比例6、13，说明在制备提取物的过程中，发酵基质中卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比、发酵基质营养物的种类和含量、高压均质处理的压力的方面对最终得到的提取物的舒缓、修护、改善刺痛、镇静皮肤的效果有影响，因此，本申请中卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比应设置为(3-9):1、营养物的加入量为1.5-5％、营养物选自啤酒糟、鱼粉、玉米浆中至少一种、高压均质处理的压力应设置为20-50Mpa。
试验例4：安全性能测试
依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)第六章的皮肤刺激性/腐蚀性试验进行安全性能测试。
实验动物：家兔；实验天数：14天；按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)的皮肤刺激性/腐蚀性试验表2判断家兔的皮肤刺激强度。
测试样品：实施例1-10、对比例1-14制备得到的提取物。
测试结果如表4所示。
表4
测试结果表明，本申请实施例的提取物安全，直接作用于皮肤时，不会对皮肤产生刺激。然而，对比例2、7、10的提取物对皮肤表现出一定的刺激性，说明发酵的菌种、发酵植物部位的选取、豆的品种对最终的提取物的安全性带来一定的影响。
本申请采用巴斯德毕赤酵母对卡瓦胡椒茎和绿豆籽进行发酵提取，最终得到的含卡瓦胡椒根的提取物安全无刺激，适合应用在制备舒缓修护功效的化妆品中。
上述实施例为本申请较佳的实施例，但本申请的实施例并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种含卡瓦胡椒根的提取物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将巴斯德毕赤酵母种子液接种至发酵基质中发酵，得到粗发酵液；
(2)对所述粗发酵液进行灭菌、裂解和过滤，得到含卡瓦胡椒根的提取物；其中，所述发酵基质包括卡瓦胡椒根和绿豆籽；
所述卡瓦胡椒根和绿豆籽的总质量为所述发酵基质质量的0.8-2％；所述卡瓦胡椒根和绿豆籽的质量比为(3-9):1；
所述发酵基质还包括营养物和水；所述营养物的加入量为所述发酵基质质量的1.5-5％，水的加入量为补足至所述发酵基质总质量的100％；
所述营养物包括啤酒糟、鱼粉、玉米浆中至少一种；
在步骤(1)中，所述发酵的温度为28-33℃，所述发酵的时间为50-70h。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述灭菌为将所述粗发酵液于80-95℃下保温15-30min；
步骤(2)中所述裂解为高压均质处理，所述高压均质处理的压力为20-50Mpa，所述高压均质处理的时间为15-50min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述巴斯德毕赤酵母种子液的接种量为所述发酵基质的3-5％(v/v)；
所述巴斯德毕赤酵母种子液的制备方法为：
B1、将巴斯德毕赤酵母菌落接种至液体培养基中一次培养，得到悬浮液；
B2、将所述悬浮液接种至所述液体培养基中二次培养，得到所述巴斯德毕赤酵母种子液。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤B1或步骤B2中，所述液体培养基包括麦芽汁培养基、PDB培养基、YPD培养基、孟加拉红培养基中至少一种；
在步骤B1中，所述一次培养的温度为28-33℃，所述一次培养的时间为20-28h；
在步骤B2中，所述悬浮液的接种量为所述液体培养基的0.8-2％(v/v)；
所述二次培养的温度为28-33℃，所述二次培养的时间为36-60h。
5.一种含卡瓦胡椒根的提取物，其特征在于，采用如权利要求1所述的制备方法制备得到。
6.如权利要求5所述的含卡瓦胡椒根的提取物在制备舒缓修护功效化妆品中的应用。
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