CN117587099A - 一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用 - Google Patents
一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117587099A CN117587099A CN202311546887.XA CN202311546887A CN117587099A CN 117587099 A CN117587099 A CN 117587099A CN 202311546887 A CN202311546887 A CN 202311546887A CN 117587099 A CN117587099 A CN 117587099A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- capture
- primer
- library
- probe
- probes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 24
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 10
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000658 coextraction Methods 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 238000011176 pooling Methods 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 24
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用,属于医学技术领域。本发明实现了探针捕获与多重引物扩增同一流程进行的建库技术:分别利用探针杂交捕获对DNA/RNA模板进行非定向富集和利用引物对目的片段进行特异性富集以构建文库,实现了DNA和RNA共建库,上述方法适用于MRD等需要痕量样本建库和突变信息放大的检测技术,可同时分析DNA层面变异SNV/INDEL/融合Fusion变异和RNA层面的融合Fusion变异,提高了检测灵敏度,同时减少探针法导致的临床生物学背景噪音,提高临床特异性。
Description
技术领域
本发明属于医学技术领域,尤其涉及一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用。
背景技术
微小残留病灶(Minimal Residue Disease,MRD)是指肿瘤患者在接受治疗后处于临床缓解期,无临床症状但在体内仍然存在肿瘤细胞的状态。进行MRD监测可以完善预后检测并为CR后的治疗提供指导,识别复发并进行早期干预。MRD监测目前分为两个主要的技术路线,一个是Tumor-informed,一个是Tumor agnostic;Tumor-informed的技术路线为个性化基因panel的监测,包括利用wes测序进行组织测序,筛选出一定数目突变位点组成个性化基因panel,利用血液进行MRD监测,优势是个性化强,临床灵敏度高;劣势主要是监测panel由于非常个性化,没有经过大量试剂性能验证,需要进行开发,试剂性能验证不充分,另外TAT时间因此比较久。
Tumor agnostic的技术路线为固定化基因panel的监测,利用一组肿瘤患者常见和高频的突变基因和位点组成的固定化panel对患者进行血液监测,优势是试剂性能验证充分,可以减少开发时间,另外可以分析病人随着疾病进展的克隆演化,及时提示新型克隆信息。MRD的监测试剂性能灵敏度通常需要达到0.02%。因此,无论个性化panel还是固定化panel都对建库技术的灵敏度提出了非常高的要求。在此之外,MRD监测技术还需要设定临床决定值,即MRD阳性判断值,错误的突变检出会造成临床特异性的下降,过少的突变检出会造成临床灵敏度的下降。
目前应用于固定化基因panel有两种主流的建库方式:一种是基于捕获探针法的建库方式,由于探针具有15%的不匹配度,其技术特点体现了其有利于发现未知基因突变;另一种是基于多重引物扩增的建库方式,引物是在基因一定长度的范围内进行扩增和富集,其技术特点体现了其可以充分富集目标片段,缩小测序数据量。两种建库应用场景不同,其步骤也差异很大。
捕获法建库主要历经1)末端修复加A;2)接头连接;3)连接产物纯化,4)文库富集以及PCR产物纯化;5)探针杂交;6)链霉亲和素结合;7)文库纯化;8)文库富集预计PCR产物纯化从而获得合格文库。
扩增子建库需要历经1)一轮PCR,2)PCR产物纯化,3)二轮PCR,4)文库纯化。
捕获探针法的建库方式,原理是DNA互补配对原则,探针与DNA模板交联结合,进而可被纯化出来进行下游文库构建和分析;由于探针具有15%的不匹配度,其捕获特异性比较差,常常需要使用价格昂贵制作复杂的COTIDNA进行封闭,但非特异性富集仍会产生较多的生物学噪音和测序冗余序列,对于SNV/INDEL等的特异性判定造成较大影响;而多重引物由于是在特定目标区段进行文库富集,对于特异性片段富集能力强,可以降低生物学背景噪音的产生;同时捕获探针法由于探针的不匹配度会造成相当数量无效和冗余的测序数据产生;而多重引物对目的片段具有富集作用,可以减少冗余数据的产生;不过基于扩增子的建库方式发现未知变异的能力较差,而探针捕获建库法具有发现未知变异的能力。
MRD检测是一种痕量突变检测的技术,测序深度通常都很深,≥50000×,单纯基于捕获法的技术手段,由于探针捕获法的非特异性富集导致基于固定化基因panel的检测时会出现大量的变异信息,测序数据在产生大量冗余序列的同时会产生大量的基因变异,这些变异信息对于患者并没有提示性作用,并且不具有临床意义,会造成MRD临床特异性的下降;单纯基于扩增子的建库方式,通过引物进行特异性目的片段的富集,难以发现有指导意义的未知变异,容易造成真实变异的漏检,造成MRD临床灵敏度的下降。
MRD检测技术对于测序背景噪音非常敏感,背景噪音的产生由两部分组成,一部分是建库试剂和测序试剂以及PCR反应等引入的化学背景噪音,一部分是人体由于环境或年龄等因素导致的生物学背景噪音,生物学背景噪音包括白细胞克隆性造血变异等等,生物学背景噪音由于是人体自发产生的,尤其在低频时,很难通过技术手段区分;现行部分技术手段会通过健康人白细胞测序建立数据基线或者测序数据黑名单进行过滤,不过仍不能够有效解决。MRD的临床阳性判断值,目前主流的技术方式如signatera是≥2SNVs,并不包含fusion;并且由于目前的技术限制,融合fusion在DNA层面的检出能力劣于RNA层面的检出能力。然而,很多融合变异也是驱动突变,对于MRD的临床检测也具有相当的指导价值,尤其血液肿瘤患者体内存在大量fusion融合变异。因此利用有限的血液样本准确全面地检测肿瘤患者包括fusion融合在内的真实的变异是目前MRD监测技术亟需解决的技术难点。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基于捕获探针的扩增子建库方法,所述建库方法包括DNA/RNA共提取后逆转录和片段化,利用一组捕获探针对片段化DNA/RNA进行捕获,捕获文库孵育延伸人造序列(人造序列为非人源序列),利用一组多重引物组对目的基因区域进行非特异性和特异性扩增,文库纯化,Index通用引物扩增和文库纯化。
优选地,所述共提取物逆转录是通过M-MLV逆转录酶和随机引物完成的。
优选地,所述捕获探针是一组100-145nt长度的探针,其中20nt为人造序列,剩余为目的区域探针,所述捕获探针人造序列一端具有生物素标记,所述捕获探针分为正义链捕获探针和反义链捕获探针;所述多重引物组为一组35~50nt长度的引物组;所述引物包括引物扩增区域和接头连接区域,所述接头连接区域包含一段20nt的接头核酸序列,所述引物扩增区域包括特异性序列和非特异性序列;所述引物包括上游引物与下游引物;所述上游引物含一段20nt的接头核酸序列以及与目的基因相互补的特异性序列,长度为15~30nt;所述下游引物包括两种:一种含一段20nt的接头核酸序列以及与目的基因相互补的15~30nt的特异性序列,另一种含一段20nt的接头核酸序列以及与人造序列相互补的非特异性序列。
更优选地,所述片段化DNA/cDNA的制备方法为机械法或酶法。
更优选地,所述DNA/cDNA片段化长度主峰为80~100nt。
更优选地,所述探针捕获过程包括反义链捕获探针捕获DNA/cDNA混合物,链霉亲和素磁珠孵育结合,磁性分离移除上清液;上清液进行正义链捕获探针捕获,链霉亲和素磁珠孵育结合,磁性分离弃掉上清液;正/反义链探针捕获的携带链霉亲和素磁珠的文库混合,在商品化Klenow酶混合液加入的情况下,实现捕获探针上被捕获片段的人造序列延伸,补齐缺刻。
更优选地,所述正/反义链的捕获温度为65℃,所述孵育延伸需使用的酶为Klenow酶,孵育延伸的温度为37℃。
本发明的目的之二在于提供上述扩增子建库方法构建获得的文库。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)实现了探针捕获与多重引物扩增同时进行的建库技术流程,既避免了探针捕获法特异性差,又保留了探针捕获法可发现未知序列的能力;既避免了panel扩增子均一性差,又具有多重扩增建库目的区域灵敏度高的能力。
(2)实现了DNA和RNA共建库,MRD panel可以同时检测DNA层面的SNV/INDEL/fusion和RNA层面的fusion变异;通过DNA和RNA层面融合变异双检测,既提高了fusion检测能力,同时提高了MRD临床检测灵敏度。
(3)降低了捕获法非特异性富集导致的测序数据冗余和生物学背景噪音,简化了生物信息学分析流程,提高了临床检测特异性,减少假阳性出现;同时避免使用传统捕获法必须的价格贵制作复杂的COT IDNA封闭冗余序列。
附图说明
图1为本发明的建库流程图。
图2为实施例1中的正义链/反义链捕获探针结构示意图。
图3为实施例1中的引物结构示意图。
图4为本发明的原理图。
具体实施方式
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的可进行扩增的探针设计方法,建库流程和文库质控标准以及测序分析。
(1)探针panel设计和引物panel设计:
探针包括正义链捕获探针和反义链捕获探针,其为ssDNA,探针长度100~145nt,含20nt固定人造序列,具体结构参见图2,在纳昂达科技有限公司进行合成;引物包括特异性引物和非特异性引物,特异性引物和非特异性引物均含20nt的P5或P7接头序列,具体结构参见图3,在生工生物有限公司进行合成。
(2)DNA和RNA共提取
DNA和RNA经共提取试剂盒提取后同时进行nanodrop测定,OD260/230测定;浓度之和需要≥500ng;
(3)共提取物逆转录
DNA和RNA共提取物中的RNA经随机引物在M-MLV类型逆转录酶的作用下,逆转录为cDNA;
(4)DNA和cDNA片段化:
片段化可以选择打断仪进行打断,也可以采用酶打断试剂盒进行打断;片段大小主峰范围在80~100bp,确保探针完全覆盖片段化片段,提高结合效率。
(5)探针捕获阶段:
分为三个主要过程:1)反义链捕获探针杂交捕获过程:反义链捕获探针杂交片段化DNA和cDNA,链霉亲和素磁珠与生物素探针结合,磁性分离移除上清液,收集携带反义链捕获产物的链霉亲和素磁珠;2)上清液正义链捕获探针杂交捕获过程:正义链捕获探针杂交1)步骤产生的上清液和其中的片段化DNA,链霉亲和素磁珠与生物素探针结合,磁性分离弃掉上清液,收集携带正义链捕获探针捕获产物的链霉亲和素磁珠;3)用TE buffer复溶收集携带正/反义链探针捕获产物的链霉亲和素磁珠并合并为一管,在商品化Klenow酶混合液加入的情况下,37摄氏度孵育30min,实现捕获探针上的人造序列延伸,将人造序列通过延伸加到被捕获DNA序列上。
(6)多重引物扩增阶段:
分为2个主要过程:1)多重引物扩增:多重引物panel与含cDNA和正反义链杂交捕获产物在商品化多重扩增mix加入的情况下,在一定pcr扩增程序条件下进行扩增;2)富集文库洗脱:magbio磁珠结合,乙醇洗涤,文库洗脱,形成的文库含部分P5和P7接头。
(7)接头扩增阶段:
分为2个主要过程:1)index通用引物扩增:index通用引物与正反义链杂交捕获文库在商品化高保真酶加入的情况下,在一定pcr扩增程序条件下进行扩增;2)文库洗脱:magbio磁珠结合,乙醇洗涤,文库洗脱,形成的文库为完整文库。Index通用引物包括Illumina测序平台的双端index通用序列引物。
(8)文库质控和测序:
文库质控采用qsep或琼脂糖凝胶电泳,主峰明显;测序仪可选择illumina平台或华大平台,测序策略可选择PE150或SE150。
应用实施例1
本实施例公开一种髓系血液肿瘤MRD固定化panel基于探针捕获后扩增的建库技术构建文库和文库质控以及上机测序测序数据分析的方法:
(1)髓系血液肿瘤MRD探针panel设计和髓系血液肿瘤MRD引物panel设计:
根据NCCN指南行标和公开数据库COSMIC,CLINVAR等并结合公司自建数据库筛选了17个基因的25个热点区域和3个融合基因区域,panel size约6.6kb;分别设计了64条正义链捕获探针panel 7.7kb,67条反义链捕获探针panel约8.1kb和一组多重引物panel。
表1.20个基因的25热点区域和3个融合基因区域列表
表2探针序列表
/>
/>
/>
/>
/>
表3多重引物序列表
/>
/>
探针panel交给南京纳昂达生物科技有限公司合成,引物panel交给生工生物科技有限公司合成。
(2)DNA和RNA共提取
10例确诊为AML的患者的外周血全血样本进行DNA和RNA共提取,提取试剂盒选择Zymo DNA/RNA共提取试剂盒(Cat:D7005),提取体积为1.5ml外周血,洗脱体积为20μL;提取后经nanodrop分别取1μL测定DNA和RNA浓度。
表4样本信息表
(3)DNA和RNA共提取物逆转录
取500ng(DNA和RNA浓度之和)的DNA和RNA共提取物选择1st StrandSynthesis Kit(货号:12249ES24)逆转录试剂盒进行逆转录,逆转录产物为DNA和cDNA混合液。
逆转录体系为:
表5逆转录体系表
组分 | 用量(μL) |
逆转录酶 | 2 |
随机引物 | 2 |
反应buffer | 2 |
模板 | 500ng |
无核酸酶水 | 补齐至20μL |
逆转录程序为:
表6逆转录程序
序号 | 温度(℃) | 时间 |
1 | 25 | 5min |
2 | 37 | 45min |
3 | 85 | 5s |
4 | 4 | Hold |
(3)DNA和cDNA片段化
取共提取物经逆转录的10ul DNA和cDNA混合液,片段化采用QIAseq FX DNALibrary Kit(Cat.no.180473)里的QIAGEN QIAseq FX,进行无偏倚打断,
片段化体系为:
表7片段化体系
组分 | 用量(μL) |
片段化酶 | 2 |
片段化buffer | 2 |
DNA和cDNA混合液 | 10 |
无核酸酶水 | 补齐至20μL |
片段化程序为:
表8片段化程序
序号 | 温度(℃) | 时间 |
1 | 95 | 10min |
2 | 40 | 60min |
(4)探针捕获和文库孵育
进行片段化DNA/cDNA捕获前,首先利用Eppendorf Concentrator plus真空离心浓缩仪对片段化DNA/cDNA浓缩。
浓缩产物首先进行反义链捕获探针捕获,捕获后用链霉亲和素磁珠抓取捕获片段,捕获体系见表9,捕获程序见表10。反义链捕获探针的工作浓度为10pmol/μL。
链霉亲和素磁珠结合捕获产物过程为:a.待捕获程序结束后,立即取50μL链霉亲和素磁珠加入到反义链捕获探针捕获产物中;b.加入1ml反应buffer,结合30分钟,期间每隔5分钟振荡混匀一次;c.利用磁力架磁性分离,并收集链霉亲和素磁珠。将4.8μL上清液转移用于正义链捕获探针杂交。
上清液进行正义链捕获探针捕获,捕获后用链霉亲和素磁珠抓取捕获片段,捕获体系如表9,捕获程序见表10。正义链捕获探针的工作浓度为10pmol/μL。Hyb#1和Hyb#2缓冲液采购自南京纳昂达生物科技有限公司。
链霉亲和素磁珠结合捕获产物过程为:a.待捕获程序结束后,立即取50μL链霉亲和素磁珠加入到正义链捕获探针捕获产物中;b.加入1ml反应buffer,结合30分钟,期间每隔5分钟振荡混匀一次;c.利用磁力架磁性分离,弃上清液,并收集链霉亲和素磁珠。
表9捕获体系
正/反义链杂交捕获程序为:
表10捕获程序
序号 | 温度(℃) | 时间 |
1 | 95 | 30s |
2 | 65 | 60min |
3 | 65 | hold |
将两管含捕获产物的链霉亲和素磁珠分别用10μL TE buffer重悬,并合并为一管总体积为20μL的捕获产物。
捕获产物孵育:
表11扩增体系
序号 | 组分 | 用量(μL) |
1 | 捕获产物 | 20 |
2 | 10×ERAbuffer(含Klenow酶) | 3 |
3 | RNasefreeH2O | 7 |
孵育程序为37℃30min。
10×ERA buffer(含Klenow酶)购自天根生化科技有限公司,货号:NG302。
(5)多重引物扩增
取30μL孵育产物,进行扩增,多重引物panel中每种引物的工作浓度均为5nM,扩增总体积为50μL;Ringcap酶和Ringcap缓冲液购自厦门飞朔生物技术有限公司。
扩增体系如下:
表12扩增体系
序号 | 组分 | 用量(μL) |
1 | Ringcap酶 | 5 |
2 | Ringcap缓冲液 | 5 |
3 | 多重引物panel | 2 |
4 | 孵育产物 | 30 |
5 | 无核酸酶水 | 8 |
扩增程序如表13所示。
表13扩增程序
扩增产物进行纯化操作magbio磁珠为1.2×用量为60μL,70%乙醇进行洗涤两次,22μL TE buffer进行洗脱,获得富集文库。magbio磁珠购自南京纳昂达生物科技有限公司。
(6)接头扩增
取20μL富集文库进行扩增,扩增总体积为40μL;
扩增体系如下:
表14扩增体系
序号 | 组分 | 用量(μL) |
1 | Ringcap酶 | 5 |
2 | Ringcap缓冲液 | 5 |
3 | Index通用引物 | 2 |
4 | 富集文库 | 20 |
5 | 无核酸酶水 | 8 |
扩增程序如表15所示。
表15扩增程序
扩增产物进行纯化操作magbio磁珠为1.2×用量60μL,70%乙醇进行洗涤两次,22μLTE buffer进行洗脱。
(7)文库质控和测序
取1μL文库进行qubit检测,浓度应大于1ng/μL,取1μL采用qsep仪器进行琼脂糖凝胶电泳检测,主峰应位于200bp附近为文库质检合格。
文库质控结果如表16所示。
表16文库质控结果
/>
测序平台选择illumina测序仪Nexstseq550,测序策略选择为PE150。10例髓系血液肿瘤病人的本次MRD监测结果如表17所示。
表17髓系血液肿瘤患者MRD监测结果
/>
表17中预期融合变异检测结果是经荧光原位杂交技术(FISH)验证过的。
对表17的数据分析可知,本申请的基于捕获探针的多重扩增子建库流程可以使超低频率的突变以及超低拷贝的融合全部稳定检出,且RNA层面的融合检测增加了融合的检测能力。
综上所述,本申请设计的捕获探针和多重扩增子文库构建方法适用于下一代高通量测序,能够对DNA和RNA同时进行准确检测,融合检出效果优于单独DNA融合检出效果,有效利用血液样本,血液样本DNA和RNA不必单独进行提取和/或建库,可操作性强,适用范围广,提高了MRD检出阳性率,具有较好的应用性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于捕获探针的扩增子建库方法,其特征在于,所述建库方法包括DNA/RNA共提取后逆转录和片段化,利用一组捕获探针对片段化DNA/cDNA进行捕获,捕获文库合并,利用一组多重引物组对目的基因区域进行非特异性和特异性扩增,文库纯化,Index通用引物扩增和文库纯化。
2.根据权利要求1所述的扩增子建库方法,其特征在于,所述共提取物逆转录是通过M-MLV逆转录酶和随机引物完成的。
3.根据权利要求1所述的扩增子建库方法,其特征在于,所述捕获探针是一组100-145nt长度的探针,其中20nt为人造序列,剩余为目的区域探针,所述捕获探针人造序列一端具有生物素标记,所述捕获探针分为正义链探针和反义链探针;所述多重引物组为一组35~50nt长度的引物组;所述引物包括引物扩增区域和接头连接区域,所述接头连接区域包含一段20nt的接头核酸序列,所述引物扩增区域包括特异性序列和非特异性序列;所述引物包括上游引物与下游引物;所述上游引物含一段20nt的接头核酸序列以及与目的基因相互补的特异性序列,长度为15~30nt;所述下游引物包括两种:一种含一段20nt的接头核酸序列以及与目的基因相互补的15~30nt的特异性序列,另一种含一段20nt的接头核酸序列以及与人造序列相互补的非特异性序列。
4.根据权利要求3所述的扩增子建库方法,其特征在于,所述片段化DNA/cDNA的制备方法为机械法或酶法。
5.根据权利要求4所述的扩增子建库方法,其特征在于,所述DNA/cDNA片段化长度主峰为80~100nt。
6.根据权利要求5所述的扩增子建库方法,其特征在于,所述探针捕获过程包括反义链捕获探针捕获,链霉亲和素磁珠孵育结合,磁性分离移除上清液;上清液正义链捕获探针捕获,链霉亲和素磁珠孵育结合,磁性分离弃掉上清液;复溶携带正/反义链探针捕获产物的链霉亲和素磁珠并合并为一管,正/反义链探针捕获文库混合孵育延伸。
7.根据权利要求6所述的扩增子建库方法,其特征在于,所述正/反义链的捕获温度为65℃,所述孵育延伸需使用的酶为Klenow酶,孵育延伸的温度为37℃。
8.根据权利要求7所述的扩增子建库方法,其特征在于,所述正/反义链的捕获程序如下表所示:
9.由权利要求1-8所述的扩增子建库方法构建获得的文库。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311546887.XA CN117587099A (zh) | 2023-11-20 | 2023-11-20 | 一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311546887.XA CN117587099A (zh) | 2023-11-20 | 2023-11-20 | 一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117587099A true CN117587099A (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=89910828
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311546887.XA Pending CN117587099A (zh) | 2023-11-20 | 2023-11-20 | 一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117587099A (zh) |
-
2023
- 2023-11-20 CN CN202311546887.XA patent/CN117587099A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107475375B (zh) | 一种用于与微卫星不稳定性相关微卫星位点进行杂交的dna探针库、检测方法和试剂盒 | |
CN105861710A (zh) | 测序接头、其制备方法及其在超低频变异检测中的应用 | |
CN107541791A (zh) | 血浆游离dna甲基化检测文库的构建方法、试剂盒及应用 | |
CN112195521A (zh) | 一种基于转座酶的dna/rna共建库方法、试剂盒及应用 | |
CN110079594B (zh) | 基于dna和rna基因突变检测的高通量方法 | |
CN115786459B (zh) | 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法 | |
CN105734679A (zh) | 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法 | |
CN113462763A (zh) | 靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒 | |
CN109652525A (zh) | 肺血栓栓塞症基因面板试剂盒及其应用 | |
CN110527714B (zh) | 用于检测hpv在宿主基因组的整合位点的方法 | |
CN111705135A (zh) | 一种检测mgmt启动子区甲基化的方法 | |
CN109295500B (zh) | 一种单细胞甲基化测序技术及其应用 | |
CN114182022A (zh) | 一种基于cfDNA碱基突变频率分布检测肝癌特异突变的方法 | |
CN111748628B (zh) | 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒 | |
CN110468211B (zh) | 膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法 | |
CN112662771A (zh) | 一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用 | |
CN116083423B (zh) | 一种靶向富集核酸的探针 | |
CN113215663B (zh) | 一种基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法及引物 | |
CN117587099A (zh) | 一种基于捕获探针的扩增子建库方法及其应用 | |
CN114196740A (zh) | 用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒 | |
CN113667714A (zh) | 一种目标区域捕获方法、试剂盒及测序方法 | |
CN114250269A (zh) | 一种探针组合物、基于该探针组合物的二代测序文库及其应用 | |
CN113234822A (zh) | 一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法 | |
CN110777194A (zh) | 一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴pcr方法 | |
CN110564818A (zh) | 针对含有indel区域的dna样本的捕获探针、试剂盒及文库构建方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |