CN117586892A - 一种生产纽莫康定b0的基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用。其中，该所述基因工程菌过表达编码非核糖体肽合成酶的基因；所述非核糖体肽合成酶的NCBI登录号为XP_008078276.1。本发明提供的基因工程菌克服了现有技术中纽莫康定B0合成产量较低、生产成本高的缺陷。利用本发明基因工程菌生产纽莫康定B0具有产量高且整体成本低的优势。

Description

一种生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
纽莫康定B0(pneumocandin B0)是棘白菌素类抗真菌药物卡泊芬净(caspofungin)的前体。棘白菌素类化合物可以通过非竞争性抑制真菌细胞壁中的β-1,3-D-葡聚糖合成酶活性而抑制真菌细胞壁的合成。
纽莫康定B0是由苏氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、3,4-二羟基高酪氨酸、3-羟基谷氨酰胺、反式-3-羟基脯氨酸、4,5-二羟基鸟氨酸这6个氨基酸组成的肽环，通过肽环上的4,5-二羟基鸟氨酸的氨基酸残基N-末端连接一个10,12-二甲基肉豆蔻酸组成的酯肽。
目前，丝状真菌Glarea lozoyensis是生产纽莫康定B0的重要的工业生产菌。
2013年，刘杏忠课题组和安志强课题组在完成了G.lozoyensis ATCC 20868(纽莫康定A0高产菌株)基因组测序的基础上，发现了合成纽莫康定B0的基因簇，确定了纽莫康定B0的生物合成途径为I型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)-非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)杂合途径。纽莫康定B0生物合成基因簇全长约116kb，包含聚酮合酶(GLPKS4)、非核糖体肽合成酶(GLNRPS4)、高酪氨酸合成酶系(GLAREA37-40)、多个加氧酶P450、一个锌指转录因子(GLAREA10050)和一个ABC转运体(GLAREA10036)。
纽莫康定B0的生物合成以8种前体分子为基础，经由PKS-NRPS***所调节、组装和修饰，最终合成纽莫康定B0。纽莫康定B0起始合成单元来源于乙酰辅酶A，在PKS(GLPKS4)催化下，按照I型PKS合成机制，在第一个酰基CoA基础上共完成7次聚酮链的延伸循环。PKS包含的甲基转移酶，会在延伸过程中将来自甲硫氨酸的甲基转移至聚酮化合物中间体上，形成10,12-二甲基肉豆蔻酸的两个甲基侧链。因为GLPKS4没有硫酯酶(thioesterase，TE)结构域，所以定位在PKS的酰基载体蛋白(ACP)上的10,12-二甲基肉豆蔻酰在包含有II型TE的GLHYD作用下生成10,12-二甲基肉豆蔻酸，并以游离羧酸的形式从PKS上释放。游离的10,12-二甲基肉豆蔻酸通过酰基AMP连接酶(GLligase，GLAREA10043)转变成辅酶A硫酯形式并定位到GLNRPS4的第一个模块中的硫醇化(T)结构域，T结构域接受由腺苷化(A)结构域腺苷化的鸟氨酸，启动了六肽延伸。继而以核糖体多肽合成机制依次连接苏氨酸，4-羟基脯氨酸，3-羟基高酪氨酸，3-羟基谷氨酰胺和3-羟基脯氨酸形成肽链，NRPS的缩合(condensation，C)结构域对形成的六肽链进行环化。再由GLP450-1对高酪氨酸的4位进行羟基化以及GLP450-2对鸟氨酸的4、5位进行羟基化，最终得到纽莫康定B0。
纽莫康定B0的生产涉及到杂质纽莫康定C0的去除，文献《CRISPR/Cas9-BasedGenome Editing in the Filamentous Fungus Glarea lozoyensis and ItsApplication in Manipulating gloF》公开了采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对菌株G.lozoyensis SIPI1208进行改造的方法，敲除GloF基因，替换为Ap-HtyE基因，进而得到一个新的菌株，新的菌株用于生产纽莫康定B0可以很好的避免杂质纽莫康定C0的产生。然而，对于纽莫康定B0生产菌株中其它关键基因如GloA、GloD、GloL并未做研究。其中G.lozoyensis SIPI1208基因簇中GloA、GloD和GloL分别对应G.lozoyensis ATCC 20868中的GLNRPS4(非核糖体肽合成酶，nonribosomal peptide synthetase)、GLligase(酰基AMP连接酶，acetyl-CoA synthetase)和GLPKS4(聚酮合酶，polyketide synthase)。
因此，对于纽莫康定B0生产菌株中其它关键基因的研究对于纽莫康定B0的产量提升也特别重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中纽莫康定B0合成产量较低、生产成本高的缺陷，提供一种基因工程菌、其制备方法，及其在制备纽莫康定B0中的应用。利用本发明基因工程菌生产纽莫康定B0具有产量高且整体成本低的优势。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因工程菌，其出发菌株为丝状真菌Glarea lozoyensis，所述基因工程菌过表达编码非核糖体肽合成酶的基因；所述非核糖体肽合成酶的NCBI登录号为XP_008078276.1。
在某些实施例中，编码所述非核糖体肽合成酶的基因的NCBI登录号为XM_008080085.1；和/或，所述丝状真菌Glarea lozoyensis为G.lozoyensis ATCC 20868。
优选地，所述过表达是利用强启动子使丝状真菌Glarea lozoyensis的基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因过表达；
所述强启动子选自gpd启动子或Tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如SEQID NO:4所示；所述Tef1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在某些实施例中，所述强启动子整合于G.lozoyensis ATCC 20868的基因组上，并使编码所述非核糖体肽合成酶的基因过表达。
较佳地，所述整合是将所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子替换为所述强启动子。
本发明第二方面提供一种制备如本发明第一方面所述的基因工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：将含有强启动子的质粒或线性片段转化入丝状真菌Glarealozoyensis细胞内，使所述强启动子替换所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子，获得过表达编码非核糖体肽合成酶的基因的基因工程菌；所述强启动子选自gpd启动子或Tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述Tef1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
较佳地，所述替换使用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行。
在某些实施例中，所述丝状真菌Glarea lozoyensis在所述转化前通过溶解细胞壁的酶液酶解其细胞壁。
较佳地，所述酶液包括丝状真菌细胞壁溶解酶(Yatalase)、溶壁酶(Lyticase)、纤维素酶(Cellulase)中的一种或多种。
更佳地，所述酶液包括：2％丝状真菌细胞壁溶解酶、3％溶壁酶、1％纤维素酶，所述％为g/100mL。
本发明第三方面提供一种纽莫康定B0的制备方法，其包括：在适合培养如本发明第一方面所述的基因工程菌的条件下发酵即得。优选地，所述的制备方法为在种子培养基中培养后，转至发酵培养基中进行发酵。
更优选地，所述种子培养基包括棉籽饼粉、甘露醇、KH2PO4、葡萄糖、MgSO4·7H2O、氯霉素，所述发酵培养基包括豆油、葡萄糖、甘露醇、棉籽饼粉、大豆浓缩蛋白、复合氮源、脯氨酸、磷酸二氢钾、氯霉素，和/或，
所述培养和发酵的温度为21-28℃，例如为24℃，和/或，
所述培养在震荡中进行，所述震荡的转速为200-250rpm，例如为220rpm，和/或，
所述培养的时长为5-10天，例如为5-7天，和/或，
所述发酵的时长为15-25天，例如为20天。
进一步更优选地，所述种子培养基包括棉籽饼粉25g/L、甘露醇50g/L、KH2PO4 4g/L、葡萄糖10g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、氯霉素0.1g/L，所述发酵培养基包括豆油8g/L、葡萄糖9g/L、甘露醇110g/L、棉籽饼粉9g/L、大豆浓缩蛋白9g/L、复合氮源3.5g/L、脯氨酸10g/L、磷酸二氢钾8.5g/L、氯霉素0.1g/L。
本发明第四方面提供一种表达盒，所述表达盒包括启动子，编码非核糖体肽合成酶的基因和终止子；
所述启动子选自gpd启动子或Tef1启动子；例如gpd启动子；
所述gpd启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述Tef1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
编码所述非核糖体肽合成酶的基因的NCBI登录号为XM_008080085.1。
其中，所述终止子为G.lozoyensis ATCC 20868的基因组中编码所述非核糖体肽合成酶的基因的原终止子。
本发明第五方面提供一种重组质粒，所述重组质粒包括如本发明第四方面所述的表达盒；优选所述的重组质粒的骨架质粒为pUC57质粒。
本发明第六方面提供一种重组质粒组合，其包括Cas9表达质粒、sgRNA质粒，以及如本发明第五方面所述的重组质粒；所述Cas9表达质粒和sgRNA质粒的线性片段用于将如本发明第四方面所述的表达盒同源重组至纽莫康定B0的生产菌的基因组中；
优选地，所述Cas9表达质粒的骨架质粒为pFC333质粒，和/或，所述sgRNA质粒的骨架质粒为pUC57质粒；和/或，所述表达盒在如本发明第五方面所述的重组质粒中，并在同源重组前所述的重组质粒发生了线性化。
本发明第七方面提供如本发明第一方面所述的基因工程菌或如本发明第四方面所述的表达盒或如本发明第五方面所述的重组质粒或如本发明第六方面所述的重组质粒组合在制备纽莫康定B0中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
通过启动子调控提高GloA的表达量有利于B0产量的提升。本发明提供的基因工程菌的纽莫康定B0发酵产量比野生型菌株提高16-37.4％，在优选实施例中提高了37.4％。
附图说明
图1为质粒pUC57-gpd-GloA图谱。
图2为质粒pUC57-gpd-GloD图谱。
图3为质粒pUC57-gpd-GloL图谱。
图4为质粒pUC57-5sRNA-GloA图谱。
图5为质粒pUC57-5sRNA-GloD图谱。
图6为质粒pUC57-5sRNA-GloL图谱。
图7为质粒pUC57-Tef1-GloA图谱。
图8为质粒pUC57-Tef1-GloD图谱。
图9为质粒pUC57-Tef1-GloL图谱。
图10为质粒pAncas9-02图谱。
图11为质粒GLSg1.0图谱。
图12为新霉素抗性基因Neo质粒图谱。
图13为质粒NeoR Frame图谱。
图14为质粒GLSg2.0图谱。
图15为质粒pSg-GloA-01图谱。
图16为质粒pSg-GloD-01图谱。
图17为质粒pSg-GloL-01图谱。
图18为纽莫康定B0标准品检测图谱，出峰时间为28.363min。
图19为实施例2中gpd启动子调控GloA表达时发酵液中纽莫康定B0 HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图和本发明的优选实施例进行详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
表1
纽莫康定B0的HPLC检测方法：
色谱柱：YMC J’sphere ODS-M80(4μm，250×4.6mm)；流动相A：0.1％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：1.5ml/min；梯度洗脱程序：60％A+40％B(0.00min)，60％A+40％B(20.00min)，50％A+50％B(35.00min)，1％A+99％B(45.00min)，60％A+40％B(46.00min)，60％A+40％B(56.00min)；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：210nm。
实施例1关键基因GloA、GloD、GloL的表达强化
1.1启动子优化载体构建
为了强化关键基因GloA、GloD、GloL表达，本发明选用gpd、5sRNA、Tef1 3种启动子对GloA、GloD、GloL分别进行表达调控，构建了pInsert系列序列：pUC57-gpd-GloA/pUC57-gpd-GloD/pUC57-gpd-GloL、pUC57-5sRNA-GloA/pUC57-5sRNA-GloD/pUC57-5sRNA-GloL、pUC57-Tef1-GloA/pUC57-Tef1-GloD/pUC57-Tef1-GloL 9个质粒。
其中，非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase)的NCBI登录号为XP_008078276.1、编码GloA基因的NCBI登录号为XM_008080085.1；
酰基AMP连接酶(acetyl-CoA synthetase)的NCBI登录号为S3DB78.1、编码GloD基因的NCBI登录号为XM_008080093.1；
聚酮合酶(polyketide synthase)酶的NCBI登录号为S3D9F1.1，编码GloL基因的NCBI登录号为XM_008080084.1。
gpd启动子序列如下所示：
tgtcacttcgcgtctttgtctgttacacgatacagcaaactttaagaatgaacctttctggcggctcctaaatcaatgaaagacggactcggacccaatgaggccaacaacggaagttggtacgtttcagggccccaaagtatccttcgctccatgatatgaatgtctagatttagcgactctctaaccaagaatatctacggtctgacctagtgcagaacaatgtattcgtgaaaggaaagattgaaacattctgcggcagcaataaggcagctagttctactaacgttaaactgaaagcgaagggatttgaaagttgatgaacagttgtaagtgacacagtaaatccttaagagcctaagatatgatattgtggtttgaaagaagttatttttctatgtaagcacgtaaaacagcgaaagatcaaagactattgtggcattagatctttgttagaaagaagtacattttgtttggcgaagagatgtgagcataaaagggtgaatgaaagatgtatgaatggttgtccggcagaatcagatgtggatttctgctggtgaacccgtaagagaaagcctcacgtgtctcccgatcataaatccataacagttccaaaaaattcatgagcgcgagcgcgagcggcaataaatcagcttttttcaagattgtcacgagttatgaagccatgcaggtttccgagttttcaacacattctgttgtataatcatcgatgcatagcacgtgatttctggctcgaaagcaaacaagattgggaggctttgggcagctctttatctggcgagaaatctgaatgagaatgcttctcgtgcgaaagaataacgctgttggcaattagagggcgaattcagccacctgcaatgacaataggagcttagcttcaagtcagataaaaggcgtggggcgttatcgagaataagaaaagcccgaagatttggccggctgccgttaaatatttgtcaagcaaaaggcagggaatgagtgttactcatatggattgagggaataacactttgcaagaaggatgccatgcaatgagaaaagtctgaactacacgtggcggcgcaacgcaacgctccgcagttaggaggaggtttagctgacagcgcagtctggagacaccgagaggaaatgttcctgttgacgatggagcttccattttgaatcttcaaggggggttggtgttctggagtttgatattggtatggtcaggaccacgagaaacagattacctaggtaaagaataatagcttcgccgttcgaacgatagctcggttaaagaattacttccattctatccgaattatcgtggagtatctagttcctcatagcaccgtatctccccggcggctcggagcgagtcgcctgctcttaaagtgtgacgtgatggtgactctgctcactctgctcactctgctcactcctccagcctcatcgactgcaggtggtggtgagactgtattattgagagatttaaatctccgtcagcttttcctgatcatctggagcgaaaggaataaataaaaacttcgtaaagcgtaacgggaacacgattgcgcaggggcgcgaccggatgcacgataagatgagtgaggaagccaattgaggactcatccactccacgtcgagaaaaatcatcatctagtctgtggtgtttccagctggttggttgccagacagccttgtcgcagtgattgcttgcttggtttcggtggtcgtggtcgtggcttgcccctcttttccgtagcgtagcgcatcttcccatctcaacaacaccccaccacgagcacaaactctctcattttcgtctcgattcttcttccttcgacatcgtacgaaacaaccaacctaagaaaaacaatcaacgaaacatgtatgtatatccttccccatctgttcactctgccagtcgcccatcctctacatcgagaattcttgtcgctccttcgtcatcgcggggctaatcttcaccagaaaacaat(SEQ ID NO:4)
5sRNA启动子序列如下所示：
gcttcatttgatcgatgttccaacacaaatgacactcgcctacgtattacaaccaactctctagcaactaactgccaaacactctatcgaacttagtcgagcagtccgtctgaagttgattcattaagagtaacagactgccttgaatctctcaactcagcatttaccaagaaagcgttctaaaatccgtaccacacgccgtcatttctgacataacttgaatcggcctcccatcacgtgacgcaccccgactcccttaacaaccgcacaagtcctcacacaccacaaccccctcaaccacacaaccacccttcttccaccaaaacacaatttccctacaaactcatatagctgtgtttgtgtttctctcatcacacccccccgctcttttttcagccctccagcgtcaactatataaatctaaaaccacccacctttgtcacatacgatcatagactgatgagaattgggcatcccgtccgctctgccacacacaagcatcagatcggtagattagtagttgggtgggtgaccaccagcgaatacctactgtcgtatg(SEQ ID NO:5)
Tef1启动子序列如下所示：
cgagacagcagaatcaccgcccaagttaagcctttgtgctgatcatgctctcgaacgggccaagttcgggaaaagcaaaggagcgtttagtgaggggcaatttgactcacctcccaggcaacagatgaggggggcaaaaagaaagaaattttcgtgagtcaatatggattccgagcatcattttcttgcggtctatcttgctacgtatgttgatcttgacgctgtggatcaagcaacgccactcgctcgctccatcgcaggctggtcgcagacaaattaaaaggcggcaaactcgtacagccgcggggttgtccgctgcaaagtacagagtgataaaagccgccatgcgaccatcaacgcgttgatgcccagctttttcgatccgagaatccaccgtagaggcgatagcaagtaaagaaaagctaaacaaaaaaaaatttctgcccctaagccatgaaaacgagatggggtggagcagaaccaaggaaagagtcgcgctgggctgccgttccggaaggtgttgtaaaggctcgacgcccaaggtgggagtctaggagaagaatttgcatcgggagtggggcgggttacccctccatatccaatgacagatatctaccagccaagggtttgagcccgcccgcttagtcgtcgtcctcgcttgcccctccataaaaggatttcccctccccctcccacaaaattttctttcccttcctctccttgtccgcttcagtacgtatatcttcccttccctcgcttctctcctccatccttctttcatccatctcctgctaacttctctgctcagcacctctacgcattactagccgtagtatctgagcacttctcccttttatattccacaaaacataacacaaccttcacc(SEQ ID NO:6)
设计引物，使用KOD OneTM PCR Master Mix，按照表2、表3PCR体系和条件进行各片段(左同源臂、gpd/5sRNA/Tef1启动子、右同源臂、pUC质粒骨架)扩增。构建后的质粒图谱见图1-图9。
表2普通PCR反应体系(50μL)
组分 用量
KOD OneTM PCR Master Mix 25μL
10μM引物F 2μL
10μM引物R 2μL
模板 1-3μL(30-100ng)
dd H2O Add To 50μL
表3普通PCR反应程序
检测及回收：琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带大小后，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行正确片段回收，并检测其回收产物浓度。
重组：使用高保真DNA组装预混液进行各个质粒的构建，重组体系如表4所示，50℃水浴15min，反应结束后放置冰上。
表4重组体系
转化：将重组产物加入感受态BL21中，放置于冰上30min，42℃热激90s。热激结束后，放置于冰上静置3-5min，加入800μL LB培养基，37℃复苏45-60min。复苏结束，5000rpm离心3min，弃去上清，留100-200μL重悬菌体，涂布氨苄抗性平板(100μg/mL)，37℃培养过夜(16h)。
测序：挑取单菌落于LB试管(A+)，37℃培养6-7h，取300μL菌液送擎科生物测序，保菌。分析测序结果，并提取测序正确质粒，-80℃保存。
1.2 pAncas9-02质粒、sgRNA质粒构建，sgRNA、pInsert-DNA线性化片段扩增与获 取
Cas9表达质粒pAncas9-02的构建：构建过程中引物及模板等如表6所示，各片段扩增和多片段重组按照方法同实施例1.1，经测序验证后获得构建正确质粒。构建后的质粒图谱见图10。
sgRNA、NeoR Frame质粒构建：通过基因合成公司合成质粒GLSg1.0(图11)、新霉素抗性基因Neo质粒(图12)。在Neo质粒基础上构建NeoR Frame质粒，见图13。在GLSg1.0质粒和NeoR Frame质粒基础上构建含有N20序列的sgRNA质粒GLSg2.0，见图14。再在GLSg2.0质粒基础上针对GloA、GloD、GloL构建含有不同N20序列(表5)的sgRNA质粒pSg-GloA-01、pSg-GloD-01、pSg-GloL-01，分别见图15，图16，图17。各片段扩增和多片段重组按照方法同实施例1.1，经测序验证后获得构建正确的sgRNA质粒。
表5针对GloA、GloD、GloL构建含有不同N20序列
基因 N20序列 SEQ ID NO:
GloA AAGACCAAGCGGTACATGGC 1
GloD AACCACGCGTATAGTGGGCA 2
GloL TCTGCGTTCTCTGCAAGGAG 3
表6 pAncas9-02、sgRNA质粒构建
sgRNA/pInsert片段线性化：使用对应表7引物及模板进行各线性化片段的扩增，片段准备及检测回收同实施例1.1。
沉淀回收：将回收后溶液加入1/10体积的3M乙酸钠，混合均匀，再加入等体积异丙醇混匀后-80℃放置1h，当出现白色絮状物后，冰上融化，4℃低温13000rpm离心5min，在管底/管壁出现白色沉淀。弃去上清，用75％乙醇洗涤2遍。最后一次弃上清后，需短暂离心，用10μL枪头尽可能吸干乙醇，后超净台内吹干，少量70℃无菌水复溶，测浓度，备用。
表7 sgRNA、pInsert-DNA线性化扩增引物
1.3原生质体制备及转化
(1)培养基及试剂：
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA培养基)：40.1g/L，250mL锥形瓶。
YPG培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油20g/L，150mL圆底锥形瓶。一级摇瓶不含有玻璃珠，二级摇瓶中加入6-8颗大玻璃珠。
KST Buffer：0.7M氯化钾，0.8M山梨醇，20mM Tris-HCl(pH6.8)，pH调至5.8-6.4，121℃灭菌15min。
STC Buffer：1.2M山梨醇，5.5g/L CaCl2·H2O，10mL 1M Tris-HCl(pH7.5)，121℃灭菌15min。
原生质体再生培养基：称取PDA培养基粉末10.25g、0.8M蔗糖于250mL锥形瓶，加入250mL去离子水，121℃高压灭菌15min。
(2)相关抗生素及母液配制：
氨苄抗生素(Amp+)：配制母液100mg/mL，过滤除菌。
潮霉素抗生素(Hyg+)：配制母液100mg/mL，过滤除菌。
G418抗生素(G418+)：配制母液100mg/mL，过滤除菌。
肝素：配制10X母液10mg/mL，过滤除菌。
60％PEG4000：60g PEG4000溶于20-40mL水，微波炉加热溶解，再加入1mL 1MTris-HCl(pH7.5)，5mL1M氯化钙溶液。趁热，去离子水定容至100mL，121℃灭菌15min。室温放置，以避免沉淀生成。
(3)原生质体制备：
将产纽莫康定B0菌种ATCC20868的甘油菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA培养基)斜面，24℃、60％湿度培养7-10d后，并按1％接种量转接于YPG培养基培养，24℃，220rpm培养7-10d后，再按2％接种量转接于YPG培养基培养，24℃，220rpm培养6-10d，培养结束后，获得液体培养物，室温、4000rpm离心20min收集菌丝体，将菌丝体重悬于40mL KST Buffer，混匀，室温、4000rpm离心20min，两次，收集菌丝体。
上述收集的菌丝体重悬于70-100mL STC Buffer，定容至菌浓0.5g/10mL。用溶壁酶液(Yatalase：2％、Lyticase：3％、Cellulase：1％，％表示g/100ml)，120rpm，30℃，酶解3.5h。将原生质体液过滤，滤液4℃，4000rpm离心10min，弃去上清，用STC Buffer清洗1遍，再4℃，4000rpm离心10min，去上清。采用STC Buffer重悬原生质体细胞，浓缩原生质体浓度至1.0ⅹ107个/mL，获得产纽莫康定B0菌种ATCC20868原生质体悬液。
(4)转化：
将pAncas9-02质粒和线性化的sgRNA/pInsert片段(10μg：15μg：15μg)、10×肝素(除菌)按用量混合均匀，室温放置10min；将G.lozoyensis原生质体感受态与线性片段和肝素混合物均匀混合，室温放置15～20min；加入1mL 60％PEG4000(灭菌)，混合，室温放置20～25min；加入10mL 1M山梨醇(灭菌)，混匀，4000rpm离心10min，弃上清，留适量体积(200-400μL)涂布。涂布双抗原生质体再生平板潮霉素150μg/mL+G41820μg/mL，24℃、60％湿度培养7-15d。获得成功再生的转化子。
经验证获得含有gpd启动子的菌株：GLIS0501(GloA)、GLIS0502(GloD)、GLIS0503(GloL)；含有5sRNA启动子的菌株：GLIS0601(GloA)、GLIS0602(GloD)、GLIS0603(GloL)；含有Tef1启动子的菌株：GLIS0701(GloA)、GLIS0702(GloD)、GLIS0703(GloL)。
实施例2利用菌株进行纽莫康定B0的生产
2.1斜面制备及一级种子培养基制备
取部分菌体于菌种管中，加入1.5mL 20％甘油，大玻璃珠2-3颗，涡旋振荡，使菌丝体分散后，吸取250μL于PDA斜面，使液体覆盖表面，24℃、60％湿度，培养8-10d。
配制一级种子培养基，配方如表8，调节pH至6.0，121℃灭菌30min。培养条件24℃、220rpm，培养5-7d。
表8发酵一级种子培养基
组分 终浓度g/L
棉籽饼粉 25
甘露醇 50
KH2PO4 4
葡萄糖 10
MgSO4·7H2O 0.1
氯霉素 0.1
2.2发酵培养基制备
按照表9配制发酵培养基，调pH约6.0,121℃灭菌30min。发酵接种量10％。24℃培养20d，取样。
表9发酵培养基
组分 终浓度g/L
豆油 8
葡萄糖 9
甘露醇 110
棉籽饼粉 9
大豆浓缩蛋白 9
复合氮源 3.5
脯氨酸 10
磷酸二氢钾 8.5
氯霉素 0.1
2.3纽莫康定B0产量测定
取10mL色谱级甲醇至50mL离心管中，取1mL混合均匀的发酵液至上述离心管中，用超声清洗仪超声波破碎1小时(超声前控温10℃左右，超声结束温度在20℃左右)，在超声30min后取出用涡旋混合仪混合均匀后再超声30min。超声结束，取2mL萃取液12000rpm离心2min，用0.22μm有机相滤头过滤1次，即可用于HPLC测定。纽莫康定B0标准品检测图谱，出峰时间为28.363min如图18所示。gpd启动子调控GloA表达时发酵液中纽莫康定B0 HPLC检测图谱如图19所示。
发酵数据见表10可知，GLIS05系列GloA基因引入gpd启动子，其菌种发酵产量比野生型菌株提高37.4％；其次，GLIS07系列GloA基因引入tef1启动子，其菌种发酵产量比野生型菌株提高16％，说明通过启动子调控提高GloA的表达量有利于B0产量的提升。
表10发酵数据
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Claims (10)

1.一种基因工程菌，其出发菌株为丝状真菌Glarea lozoyensis，其特征在于，所述基因工程菌过表达编码非核糖体肽合成酶的基因；所述非核糖体肽合成酶的NCBI登录号为XP_008078276.1。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述非核糖体肽合成酶的基因的NCBI登录号为XM_008080085.1；和/或，所述丝状真菌Glarea lozoyensis为G.lozoyensisATCC 20868；
优选地，所述过表达是利用强启动子使丝状真菌Glarea lozoyensis的基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因过表达；
所述强启动子选自gpd启动子或Tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述Tef1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述强启动子整合于G.lozoyensisATCC 20868的基因组上，并使编码所述非核糖体肽合成酶的基因过表达；
较佳地，所述整合是将所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子替换为所述强启动子。
4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将含有强启动子的质粒或线性片段转化入丝状真菌Glarea lozoyensis细胞内，使所述强启动子替换所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子，获得过表达编码非核糖体肽合成酶的基因的基因工程菌；所述强启动子选自gpd启动子或Tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述Tef1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
较佳地，所述替换使用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述丝状真菌Glarea lozoyensis在所述转化前通过溶解细胞壁的酶液酶解其细胞壁；
较佳地，所述酶液包括丝状真菌细胞壁溶解酶、溶壁酶、纤维素酶中的一种或多种；
更佳地，所述酶液包括：2％丝状真菌细胞壁溶解酶、3％溶壁酶、1％纤维素酶，所述％为g/100mL。
6.一种纽莫康定B0的制备方法，其特征在于，其包括：在适合培养如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌的条件下发酵即得；
优选地，所述的制备方法为在种子培养基中培养后，转至发酵培养基中进行发酵；
更优选地，所述种子培养基包括棉籽饼粉、甘露醇、KH2PO4、葡萄糖、MgSO4·7H2O、氯霉素，所述发酵培养基包括豆油、葡萄糖、甘露醇、棉籽饼粉、大豆浓缩蛋白、复合氮源、脯氨酸、磷酸二氢钾、氯霉素，和/或，
所述培养和发酵的温度为21-28℃，例如为24℃，和/或，
所述培养在震荡中进行，所述震荡的转速为200-250rpm，例如为220rpm，和/或，
所述培养的时长为5-10天，例如为5-7天，和/或，
所述发酵的时长为15-25天，例如为20天；
进一步更优选地，所述种子培养基包括棉籽饼粉25g/L、甘露醇50g/L、KH2PO4 4g/L、葡萄糖10g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、氯霉素0.1g/L，所述发酵培养基包括豆油8g/L、葡萄糖9g/L、甘露醇110g/L、棉籽饼粉9g/L、大豆浓缩蛋白9g/L、复合氮源3.5g/L、脯氨酸10g/L、磷酸二氢钾8.5g/L、氯霉素0.1g/L。
7.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括启动子，编码非核糖体肽合成酶的基因和终止子；
所述启动子选自gpd启动子或Tef1启动子；例如gpd启动子；
所述gpd启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述Tef1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
编码所述非核糖体肽合成酶的基因的NCBI登录号为XM_008080085.1。
8.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括如权利要求7所述的表达盒；优选所述的重组质粒的骨架质粒为pUC57质粒。
9.一种重组质粒组合，其特征在于，其包括Cas9表达质粒、sgRNA质粒，以及如权利要求8所述的重组质粒；所述Cas9表达质粒和sgRNA质粒的线性片段用于将如权利要求7所述的表达盒同源重组至纽莫康定B0的生产菌的基因组中；
优选地，所述Cas9表达质粒的骨架质粒为pFC333质粒，和/或，所述sgRNA质粒的骨架质粒为pUC57质粒；和/或，所述表达盒在如权利要求8所述的重组质粒中，并在同源重组前所述的重组质粒发生了线性化。
10.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌或如权利要求7所述的表达盒或如权利要求8所述的重组质粒或如权利要求9所述的重组质粒组合在制备纽莫康定B0中的应用。
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