CN117586413A - 异多聚体蛋白质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种异多聚体蛋白质及其制备方法。具体地，其包含第一抗体重链相对于Knob‑into‑Hole的Knob单链的S354C、T366W突变引入T394K的突变，和第二抗体重链相对于Knob‑into‑Hole的Hole单链的Y349C、T366S、L368A、Y407V突变增加V397D突变。还提供了利用该产生异多聚体蛋白质的方法制备同时靶向肿瘤细胞表面分子HER‑2和CD47双特异性抗体或靶向肿瘤细胞和免疫细胞表面分子TROP‑2和CD3双特异性抗体的方法，包括可变片段scFv和免疫球蛋白抗体IgG通过肽接头连接，或具有抗原活性的Fab片段和免疫球蛋白抗体IgG通过肽接头连接产生的双特异抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物抗体领域。具体地，涉及异多聚体蛋白质及其制备方法。
背景技术
异多聚体蛋白质(Heteromultimeric protein)是至少包括2个异源多肽链二聚化或多聚化后得到的蛋白产物，非对称结构的双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)就属于异多聚体蛋白质其中的一类。为了促进抗体Fc段的异源二聚化，可通过基因工程技术使不同的抗体组合在一起，如通过对野生型抗体恒定区CH3或铰链区的氨基酸位点进行突变，使CH3-CH3界面上的空间位阻或非共价作用力(静电或疏水作用)发生改变，从而使得异源重链比同源重链更容易发生二聚化。
目前成熟的Fc段异源二聚化的技术为杵臼结构(Knobs-into-holes，KIH)。将一个抗体重链CH3区366位较小的苏氨酸(T)替换为较大的色氨酸(W)形成Knobs结构(T366W)，将另一个抗体重链CH3区407位较大的酪氨酸(Y)突变成较小的苏氨酸(T)形成holes结构(Y407T)，依靠突变后空间位阻效应的下降以及铰链区形成的共价二硫键，促进异源重链二聚化，即为KIH结构。后续研究发现重链hole的CH3区的T366和L368位也对重链Knob的T366W位突变存在位阻效应，利用噬菌体展示技术，最终将重链hole的Y407T单点突变改进为3点突变(T366S、L368A和Y407V)，获得了更稳定的“1+3”杵臼结构。后续又在重链Knob上加入S354C位点突变，重链hole上加入S349C位点突变，形成了目前Fc段特异性结合较为常用的杵臼结构。然而异多聚体蛋白质的杵臼结构中，会产生部分Hole-Hole同二聚体，增加了后续纯化工艺的难度。
因此，本领域亟待开发一种新型的异多聚体蛋白质及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异多聚体蛋白质及其制备方法。具体地，提供一种含有抗体Fc段的异多聚体蛋白质，以抗HER-2和CD47的双特异性抗体为研究基础，开发异多聚体蛋白质的制备方法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种异多聚体蛋白质，包括含有第一重链恒定结构域3(CH3)结构域的第一多肽和含有第二重链恒定结构域3(CH3)结构域的第二多肽，其中所述第一CH3结构域包括相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置394处利用带正电荷的氨基酸进行的取代，和/或所述第二CH3结构域包括相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置397处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，所述氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域中，氨基酸位置394处所述带正电荷的氨基酸与所述第二CH3结构域中的氨基酸残基形成离子和/或电荷相互作用。
在另一优选例中，所述第二CH3结构域中，氨基酸位置397处所述带负电荷的氨基酸与所述第一CH3结构域中的氨基酸残基形成离子和/或电荷相互作用。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域中包括杵臼结构的残基。
在另一优选例中，所述第一多肽和第二多肽形成杵臼结构配对。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域在氨基酸位置394处包含赖氨酸(K)取代。
在另一优选例中，所述第二CH3结构域在氨基酸位置397处包含天冬氨酸(D)取代。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域中，还包括一个或多个氨基酸取代，所述取代促进所述第一多肽和所述第二多肽之间形成杵-臼结构配对。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域还包括选自下组的氨基酸取代：S354C、T366W；并且所述第二CH3结构域还包括选自下组的氨基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V、或其组合。
在另一优选例中，在第一CH3结构域中，所述杵臼结构的残基包括选自下组的氨基酸取代：S354C、T366W；在第二CH3结构域中，所述杵臼结构的残基包括选自下组的氨基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V、或其组合。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域包含选自下组的取代：T394K、S354C和T366W、或其组合。
在另一优选例中，所述第二CH3结构域包含选自下组的取代：V397D、Y349C、T366S，L368A、Y407V、或其组合。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域是人CH3结构域。
在另一优选例中，其中所述异多聚体蛋白质包含IgG Fc区。
在另一优选例中，所述IgG Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在另一优选例中，所述IgG是IgG1。
在另一优选例中，所述IgG Fc是源自人IgG1的Fc。
在另一优选例中，所述第一多肽和/或所述第二多肽源自IgG分子。
在另一优选例中，所述第一多肽和/或所述第二多肽包含重链恒定结构域2(CH2结构域)。
在另一优选例中，所述第一多肽是抗体重链，和/或所述第二多肽是抗体重链。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质包含一个或多个抗体轻链。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质包含
(a)异二聚化的Fc片段；和
(b)抗原结合片段。
在另一优选例中，所述异二聚化的Fc元件包括含有第一重链恒定结构域3(CH3)结构域的第一多肽和含有第二重链恒定结构域3(CH3)结构域的第二多肽，其中相对于野生型CH3结构域，所述第一CH3结构域包括选自下组的氨基酸取代：T394K、S354C和T366W、或其组合；和所述第二CH3结构域包括选自下组的氨基酸取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其组合，所述氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在另一优选例中，所述异二聚化的Fc元件还包括重链恒定结构域2(CH2结构域)。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质为多特异性抗体。
在另一优选例中，所述多特异性抗体包括双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
在另一优选例中，所述多特异性抗体包括一个或多个抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗原结合片段靶向相同或不同的抗原。
在另一优选例中，所述抗原结合片段分别靶向相同抗原的不同表位。
在另一优选例中，所述抗原结合片段选自下组：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；或(vi)单域抗体dAb片段。
在另一优选例中，所述抗原选自下组：EGFR、HER-2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、TROP-2、CD52、CD133、CD3、CEA、TAG-72、CIX、PSMA、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL和FAP。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质包含第一重链、第二重链、第一轻链、第二轻链和第三轻链；其中，
所述第一重链从N端到C端包含：针对第一靶标的抗体重链可变结构域Z1、抗体重链恒定区Z4、针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2、第一CH1、第一CH2和第一CH3结构域；所述的第一轻链和第二轻链分别与所述第一重链配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第一靶标和第二靶标；
所述第二重链从N端到C端包含：针对第三靶标的抗原结合片段Z3，针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2、第二CH1、第二CH2和第二CH3结构域，所述的第三轻链分别与所述第二重链配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第二靶标；和针对第三靶标的抗原结合片段Z3特异性结合于第三靶标。
在另一优选例中，所述第一轻链从N端到C端包括串联的针对第一靶标的抗体轻链可变结构域Y1和第一CL。
在另一优选例中，所述第二轻链从N端到C端包括串联的针对第二靶标的抗体轻链可变结构域Y2和抗体第二CL。
在另一优选例中，所述第三轻链从N端到C端包括串联的针对第二靶标的抗体轻链可变结构域Y2和第三CL。
在另一优选例中，所述针对第三靶标的抗原结合片段Z3选自下组：针对第三靶标的scFv分子、VHH或Fab分子。
在另一优选例中，所述第一靶标与第二靶标为相同或不同的表位。
在另一优选例中，所述第一靶标和第二靶标是不同的抗原。
在另一优选例中，所述第一靶标和第二靶标是相同抗原的不同表位。
在另一优选例中，所述第三靶标是不同于第一靶标、第二靶标的表位。
在另一优选例中，所述第一靶标和所述第二靶标为HER-2，和所述第三靶标为CD47。
在另一优选例中，所述针对第三靶标的抗原结合片段为针对CD47的scFv分子。
在另一优选例中，所述针对第一靶标的抗体重链可变结构域Z1和针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2的序列相同或不同。
在另一优选例中，所述抗体重链恒定区Z4、第一CH1和第二CH1的序列相同或不同。
在另一优选例中，所述第一CL、第二CL和第三CL相同或者不同。
在另一优选例中，所述的第一轻链、第二轻链和第三轻链的序列相同或不同。
在另一优选例中，所述第一重链中，所述针对第一靶点的抗体重链可变结构域Z1、抗体重链恒定区Z4、针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2、第一CH1中相邻的两个元件直接相连或通过接头连接。
在另一优选例中，所述第二重链中，所述针对第三靶标的抗原结合片段与针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2直接相连或通过接头连接。
在另一优选例中，所述的接头包括柔性接头和刚性接头。
在另一优选例中，所述的接头为长度为1-35个氨基酸的肽接头，较佳地6-30个氨基酸的肽接头。
在另一优选例中，所述第一CH3结构域包含选自下组的取代：T394K、S354C和T366W、或其组合。
在另一优选例中，所述第二CH3结构域包含选自下组的取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其组合。
在另一优选例中，所述多特异性抗体为双特异性抗体。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质具有两条重链和三条轻链，其中
第一重链自N端到C端包含：Fab-VH-CH1-铰链区-Fc1；
第二重链自N端到C端包含：scFv-VH-CH1-铰链区-Fc2；
所述轻链自N端到C端包含：VL-CL，其中所述第一重链的Fab的抗原结合结构域结合第一靶标；所述第一重链和第二重链的VH-CH1与所述轻链的VL-CL各自独立地形成结合于第二靶标的第二抗原结合域，所述第二重链的scFv的抗原结合结构域结合第三靶标。
在另一优选例中，所述第一靶标与第二靶标相同或不同。
在另一优选例中，所述Fc1中的CH3结构域包括选自由以下组成的组的取代：T394K、S354C和T366W；所述Fc2中的CH3结构域包括选自由以下组成的组的取代：V397D、Y349C，T366S、L368A和Y407V。
在另一优选例中，所述第一靶标和所述第二靶标为HER-2，所述第三靶标为CD47。
在另一优选例中，所述第一靶标和所述第二靶标为TROP-2，所述第三靶标为CD3。
在另一优选例中，所述第一重链的Fab为抗HER-2的IgG抗体的Fab片段。
在另一优选例中，所述第二重链的scFv为抗CD47抗体的scFv。
在另一优选例中，所述抗CD47抗体的scFv片段包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接。
在另一优选例中，所述第一重链和第二重链中抗HER-2的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述轻链中抗HER-2的轻链可变区的VL的序列如SEQ ID NO.14所示。
在另一优选例中，所述第二重链中抗CD47抗体的scFv片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。
在另一优选例中，所述抗HER-2的IgG抗体的重链可变区如SEQ ID NO.13所示；所述抗HER-2的IgG抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.14所示；和/或所述抗CD47抗体的重链可变区如SEQ ID NO.15所示；所述抗CD47抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.16所示。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质包含第一重链、第二重链、第二轻链和第三轻链；其中，
所述第一重链从N端到C端包含：针对第三靶标的抗原结合片段Z3，针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2、第一CH1、第一CH2和第一CH3结构域；所述的第二轻链与所述第一重链配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第二靶标；针对第三靶标的抗原结合片段Z3特异性结合于第三靶标；
所述第二重链从N端到C端包含：针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2、第二CH1、第二CH2和第二CH3结构域，所述的第三轻链分别与所述第二重链配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第二靶标。
在另一优选例中，所述第二靶标为TROP-2，所述第三靶标为CD3。
在另一优选例中，所述针对第三靶标的抗原结合片段Z3为抗CD3抗体的scFv。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质具有两条重链和两条轻链，其中
第一重链自N端到C端包含：scFv-VH-CH1-铰链区-Fc1；
第二重链自N端到C端包含：VH-CH1-铰链区-Fc2；
所述轻链自N端到C端包含：VL-CL，其中所述第一重链和第二重链的VH-CH1与所述轻链的VL-CL各自独立地形成结合于第二靶标的第二抗原结合域，所述第一重链的scFv的抗原结合结构域结合第三靶标。
在另一优选例中，所述第二靶标为TROP-2，所述第三靶标为CD3。
在另一优选例中，所述第一重链的scFv为抗CD3抗体的scFv。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质，包含含有抗体重链恒定区CH3结构域的第一多肽和含有抗体重链恒定区CH3结构域的第二多肽，第一多肽恒定区CH3结构域包含选自由以下组成的组的取代：S354C、T366W和T394K，第二多肽恒定区CH3结构域包含选自由以下组成的组的取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D。在另一优选例中，第一多肽恒定区CH3结构域包含选自由以下组成的组的取代：S354C、和T366W，第二多肽恒定区CH3结构域包含选自由以下组成的组的取代：Y349C、T366S、L368A、和Y407V。
在另一优选例中，所述异多聚体蛋白质是双特异性抗体或Fc融合蛋白。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含：
第一抗原结合结构域D1；和第二抗原结合结构域D2。
其中，D1特异性结合靶分子HER-2蛋白；D2特异性结合靶分子CD47蛋白；
所述D1为特异性结合HER-2蛋白的抗体或其抗原结合片段；和/或
所述D2为特异性结合CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段；
其中，所述的抗原结合片段的结构选自下组：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；或(vi)单域抗体dAb片段。
在另一优选例中，所述的特异性结合HER-2蛋白的抗体包括：单链抗体、双链抗体、纳米抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、鼠源抗体、人源化抗体和双特异性抗体。
在另一优选例中，所述的特异性结合CD47蛋白的抗体包括：单链抗体、双链抗体、纳米抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、鼠源抗体、人源化抗体和双特异性抗体。
在另一优选例中，所述的D1和/或D2为IgG抗体。
在另一优选例中，所述IgG抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在另一优选例中，所述的D1和/或D2为scFv。
在另一优选例中，所述的D1和/或D2为Fab片段。
在另一优选例中，所述D1为抗HER-2的IgG抗体。
在另一优选例中，所述D1为抗HER-2的Fab片段。
在另一优选例中，所述D1包含一个、两个、三个或多个抗HER-2的IgG抗体。
在另一优选例中，所述D1包含一个、两个、三个或多个抗HER-2的Fab片段。
在另一优选例中，所述D1为抗HER-2的Fab片段；和所述D1为抗HER-2的IgG抗体，其中D1的抗HER-2的Fab片段连接在D1的抗HER-2的IgG抗体重链的可变区N末端。
在另一优选例中，所述D1的Fab和所述D1的IgG通过接头或直接相连。
在另一优选例中，所述接头的序列为(G4S)n，较佳地，n为1-4。
在另一优选例中，所述D1为抗HER-2的IgG抗体。
在另一优选例中，所述D2为抗CD47的scFv。
在另一优选例中，所述D1包含一个、两个、三个或多个抗HER-2的IgG抗体。
在另一优选例中，所述D2包含一个、两个、三个或多个抗CD47的scFv。
在另一优选例中，所述D2连接到所述的抗HER-2抗体的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、轻链恒定区或其组合。
在另一优选例中，所述D2为抗CD47的scFv；和所述D1为抗HER-2的IgG抗体，其中D2连接在D1的重链可变区N末端。
在另一优选例中，所述D1和所述D2通过接头或直接相连。
在另一优选例中，所述接头的序列为(G4S)n，较佳地，n为1-4。
在另一优选例中，所述双特异性抗体为同源或异源二聚体，优选为异源二聚体。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含抗HER-2的IgG抗体，一个抗HER-2的Fab片段和一个抗CD47的scFv，其中每个Fab片段与通过L2与抗HER-2的免疫球蛋白抗体IgG串联；其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过接头L1连接，每个抗CD47的scFv通过接头L2与抗HER-2的免疫球蛋白抗体IgG串联。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含：
第一抗原结合结构域D1；和第二抗原结合结构域D2；
其中，D1特异性结合靶分子TROP-2蛋白；D2特异性结合靶分子CD3蛋白；
所述D1为特异性结合TROP-2蛋白的抗体或其抗原结合片段；和/或
所述D2为特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段；
其中，所述的抗原结合片段的结构选自下组：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；或(vi)单域抗体dAb片段。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含抗TROP-2的IgG抗体和一个抗CD3的scFv，抗CD3的scFv通过接头与抗TROP-2的免疫球蛋白抗体IgG串联。
在另一优选例中，所述双特异性抗体为异源二聚体，其包含第一多肽和第二多肽，从N端到C端分别具有如式Ia和Ib所示的结构：
其中，
VLA代表抗HER-2抗体的轻链可变区；
VHA代表抗HER-2抗体的重链可变区；
VLB代表抗CD47抗体的轻链可变区；
VHB代表抗CD47抗体的重链可变区；
CH代表重链恒定区；
CL代表轻链恒定区；
L1、L2各自独立地为键或接头；
“～”代表二硫键或共价键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合HER-2以及结合CD47的活性。
在另一优选例中，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。
在另一优选例中，所述接头L1的序列如SEQ ID NO.24所示。
在另一优选例中，所述接头L2的序列如SEQ ID NO.25所示。
在另一优选例中，所述抗HER-2的IgG抗体的重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；和
所述抗HER-2的IgG抗体的轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在另一优选例中，所述抗HER-2抗体包含SEQ ID NO.13所示的重链可变区。
在另一优选例中，所述抗HER-2抗体包含SEQ ID NO.14所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗HER-2的Fab片段重链区域的序列如SEQ ID NO.22所示。
在另一优选例中，所述抗CD47抗体的重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；和
所述抗CD47抗体的轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在另一优选例中，所述抗CD47抗体包含SEQ ID NO.15所示的重链可变区。
在另一优选例中，所述抗CD47抗体包含SEQ ID NO.16所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗CD47的scFv的序列如SEQ ID NO.17所示。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体选自下组：
(1)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
(2)将(1)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同时抗HER-2活性和抗CD47活性的由(1)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包括所述双特异性抗体的活性片段和/或衍生物，其中，所述活性片段和/或所述衍生物保留了所述双特异性抗体的70-100％的抗HER-2活性和70-100％的抗CD47活性。
在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少85％的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗体的衍生物是本发明抗体经过一个或几个氨基酸缺失、***和/或取代后并保持至少85％的同一性的序列。
在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述的取代为保守性取代。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO.26所示的重链恒定区或其衍生序列，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：SEQ IDNO.26所示氨基酸序列的第354、366和394位。
在另一优选例中，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：S354C、T366W和T394K。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO.26所示的重链恒定区或其衍生序列，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：SEQ IDNO.26所示氨基酸序列的第349、366、368、407和397位。
在另一优选例中，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO.26所示的重链恒定区或其衍生序列，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：SEQ IDNO.26所示氨基酸序列的第354和366位。
在另一优选例中，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：S354C和T366W。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO.26所示的重链恒定区或其衍生序列，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：SEQ IDNO.26所示氨基酸序列的第349、366、368和407位。
在另一优选例中，所述衍生序列包含一个或多个位点的氨基酸取代：Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码根据本发明的第一方面所述的异多聚体蛋白质。
在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有根据本发明的第二方面所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中，所述表达载体为病毒或质粒，较佳地为噬菌体或者噬菌粒。
在另一优选例中，所述表达载体选自下组：pcDNA3.4，pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pTT5，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0，较佳地为pcDNA3.4。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有根据本发明的第三方面所述的表达载体。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。
在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，优选CHO细胞或293F细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种制备如本发明的第一方面所述的异多聚体蛋白质的方法，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养根据本发明的第四方面所述的宿主细胞，从而表达异多聚体蛋白质；
b)分离并纯化步骤a)所述的异多聚体蛋白质。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的根据本发明的第一方面所述的异多聚体蛋白质和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在本发明的第七方面，提供了根据本发明的第一方面所述的异多聚体蛋白质、或根据本发明的第六方面所述的药物组合物在制备癌症或肿瘤的药物中的用途。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、直肠癌、结肠癌、***区癌、乳腺癌、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、***癌、***癌、胰腺癌、脑癌、睾丸癌、淋巴癌、移行细胞癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、慢性、急性白血病或其组合。
在本发明的第八方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
(a)如本发明的第一方面所述的异多聚体蛋白质；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物包括抗体－药物偶联物(ADC)。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物用于制备治疗癌症或肿瘤的药物组合物。
在本发明的第九方面，提供了一种产生特异性结合第一靶标、第二靶标和第三靶标的异多聚体蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供包含特异性结合至第一靶标的第一结合结构域、特异性结合至第二靶标的第二结合结构域、第一CH2结构域和第一CH3结构域的第一多肽；以及
(b)提供第二多肽，其包含特异性结合至第三靶标的第三结合结构域、第二靶标的第二结合结构域、第二CH2结构域和第二CH3结构域；
其中：所述第一CH3结构域、第二CH3结构域相对于野生型CH3结构域具有以下取代：第一CH3结构域：T394K、S354C、T366W；第二CH3结构域：V397D、Y349C、T366S、L368A、Y407V。
其中，所述氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在另一优选例中，所述第一靶标与第二靶标相同或不同。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(c)提供第一轻链、第二轻链和第三轻链；其中，所述的第一轻链和第二轻链分别与所述第一多肽配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第一靶标和第二靶标；所述的第三轻链与所述第二多肽配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第二靶标。
在本发明的第十方面，提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据在本发明的第一方面所述的异多聚体蛋白质、根据在本发明的第六方面所述的药物组合物、根据本发明的第九方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述方法还包括和其他的抗肿瘤药联合给药。
在本发明的第十一方面，提供了一种异二聚化的Fc元件，包括含有第一重链恒定结构域3(CH3)结构域的第一多肽和含有第二重链恒定结构域3(CH3)结构域的第二多肽，其中相对于野生型CH3结构域，所述第一CH3结构域包括选自下组的氨基酸取代：T394K、S354C和T366W、或其组合；和/或所述第二CH3结构域包括选自下组的氨基酸取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其组合，所述氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在另一优选例中，所述异二聚化的Fc元件还包括重链恒定结构域2(CH2)。
本发明的积极进步效果在于：提供了一种可以运用到含Fc段的异多聚体蛋白质的杵臼结构模式，可促进抗体Fc段的异源二聚化，并提供了一种可以稳定表达的非对称结构的抗HER-2和CD47双特异性抗体，并衍生得到其他的可以稳定表达的双特异性抗体，如抗TROP-2和CD3双特异性抗体(详情见实施例)，进一步证明了该模式的应用广度。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了抗HER-2/CD47双抗结构示意图；其中图1A显示了抗HER-2/CD47双抗a中两条重链CH3-CH3界面晶体结构局部视图；图1B显示了抗HER-2/CD47双抗b中两条重链CH3-CH3界面晶体结构局部视图。
图2A显示了抗HER-2/CD47双抗a的HPLC检测图谱。
图2B显示了抗HER-2/CD47双抗b的HPLC检测图谱。
图3A显示了抗HER-2/CD47双抗a的CE-SDS检测图谱。
图3B显示了抗HER-2/CD47双抗b的CE-SDS检测图谱。
图4A显示了抗HER-2/CD47双抗a的分子量检测图谱。
图4B显示了抗HER-2/CD47双抗b的分子量检测图谱。
图5A显示了抗HER-2/CD47双抗a的等电点检测图谱。
图5B显示了抗HER-2/CD47双抗b的等电点检测图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现了一种异多聚体蛋白质，其包含具有一个或多个氨基酸取代的抗体重链恒定结构域3(CH3)结构域，所述氨基酸取代使所述异多聚体蛋白质的CH3结构域具有新型工程化离子键和/或离子和/或电荷相互作用，进一步与杵臼结构(KIH)残基取代组合，促进异二聚体的形成。进一步地，还提供了制备所述异多聚体蛋白质的方法。本发明的异多聚体蛋白质制备方法可用于增强异二聚体的形成和减少同二聚体的形成。所述方法适用于所有含Fc段的异多聚体蛋白质，诸如双特异性抗体和Fc融合蛋白等。在此基础上完成了本发明。
本申请是在上述杵臼结构的基础上，对重链恒定区CH3的氨基酸进行进一步的突变与筛选，获得更加稳定的异多聚体蛋白质，并将此结构运用到更多通过Fc段结合的异多聚体蛋白质中，如非对称结构的双特异性抗体和Fc融合蛋白等。
具体地，本发明同时提供了一种异多聚体蛋白质，所述异多聚体蛋白质中的Fc段的CH3结构域中包含相对于野生型CH3结构域在在氨基酸位置394处利用带正电荷的氨基酸(例如T394K)进行的取代；和/或所述第二CH3结构域包括相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置397处利用带负电荷的氨基酸(例如V397D)进行的取代。
进一步地还包括杵臼结构(KIH)残基，例如所述第一CH3结构域还包括选自下组的氨基酸取代：S354C和/或T366W；并且所述第二CH3结构域还包括选自下组的氨基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V。所述氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
在一个具体实施方式中，所述异多聚体蛋白质为具有不对称的抗HER-2和CD47双特异性抗体，或具有不对称结构的抗TROP-2和CD3双特异性抗体。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“异多聚体”或“异多聚体蛋白质”是包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽在氨基酸序列上与第一多肽相异于至少一个氨基酸残基。在一些发明中，异多聚体对至少两种不同的配体或结合位点具有结合特异性。异多聚体可包含由第一多肽和第二多肽形成的“异二聚体”，或可形成其中存在除了第一多肽和第二多肽之外的多肽的更高阶的三级结构。
如本文所用，术语“异二聚化(heterodimerization)”通常是指在两个不同成员之间形成或不形成共价键的情况下，诸如通过复合、缔合或聚集在两个不同成员(例如两个不同多肽)之间形成异二聚体的过程。
如本文所用，术语“杵臼结构”或“Knobs-into-Holes”是指CH3结构域中的一对工程化氨基酸残基，工程化氨基酸残基使得CH3结构域的接触表面的获得空间修饰，所述第一CH3结构域通过互补的空间修饰优先附着至第二CH3结构域的相应接触表面。此类空间修饰主要源自不同的氨基酸残基和侧链，例如，以产生“Knobs”或“Holes”结构，它们互补形成“Knobs-into-Holes”二聚体。
如本文所用，“CH3结构域”(也称为“C2”或“H3”结构域)包含Fc区中残基C末端至CH2结构域的延伸(即从抗体序列的大约氨基酸残基341至C末端(通常在IgG的氨基酸残基446或447处))。如本文所用，“第一CH3结构域”、“第一多肽恒定区CH3”、“第一CH3”、“第一CH3域”、“第一重链恒定结构域3”可以互换使用；“第二CH3结构域”、“第二多肽恒定区CH3”、“第二CH3”、第二CH3域”、“第二重链恒定结构域3”可以互换使用。
如本文所用，术语“抗体(Antibody，缩写Ab)”和“免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG，缩写IgG)”是有相同结构特征的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。
如本文所用，术语“结合结构域”包括多肽中的任意区域，其特异性结合目标分子(例如抗原、配体、受体等)。示例性结合结构域包括抗体可变结构域、受体结合结构域、配体结合结构域和酶促结构域。
本发明所述的“免疫球蛋白抗体IgG”是约150kDa的分子，它由四条肽链构成，含有两条相同的约50kDa的γ重链，和两条相同的约25kDa的轻链，从而具有四聚体四级结构。两条重链通过二硫键相互连接，并各自与一条轻链连接。所成的四聚体具有相同的两半，二者形成叉型或者类似Y的形状，叉的每一端含有一个相同的抗原结合位点。IgG抗体可以基于重链的恒定区中氨基酸序列的微小差异而分为多个亚类(例如IgG1、2、3、4)。
本发明中，术语“双特异性抗体(或双抗)”是指能同时特异性结合两种抗原(靶点)或两种表位的抗体分子。根据对称性，双特异性抗体可以分为结构对称的和不对称的分子。根据结合位点的多少，双特异性抗体可以分为二价、三价、四价和多价分子。
本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们可以通过杂交瘤培养来合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fv片段；(iv)单链Fv(scFv)；或(vi)单域抗体(dAb)片段。如本文所用，表述“抗原结合片段”内部也涵盖其他工程化分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米体、双价纳米体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR域。
本发明中，术语“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可将抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。术语“F(ab’)2片段”F(ab')2片段抗体是由胃蛋白酶消化整个IgG抗体，去除大部分Fc区同时完整保留一些铰链区后得到的，具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab)部分。
本发明中，术语“scFv”或“单链可变区片段scFv”为单链抗体(single chainantibody fragment，scFv)，是指包含免疫球蛋白重链VH和轻链VL可变区的融合蛋白，VH与VL通过15～25个氨基酸的接头(linker)相连，其中所述融合蛋白保留了完整免疫球蛋白相同的抗原特异性。
本发明中，术语“Fv片段”或“Fv抗体”含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv片段还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(即形成了抗原结合结构域)(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。
如本文所用，术语“KABAT编号的EU索引”通常是指根据KABAT等人(1971)Ann.NYAcad,Sci.(《纽约科学院年报》)190:382-391和Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteins of Immunological Interest(具有免疫学意义的蛋白质序列)，第五版，美国卫生及公共服务部,NIH第91-3242号出版物的对应于氨基酸序列的EU编号的索引。
如本文所用，术语“框架区”(FR)指***CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，术语“接头”是指***免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。在本发明中，优选的接头是指接头L1和L2，其中L1连接单链抗体(scFv)的VH和VL，而L2用于将scFv或Fab片段与另一抗体的重链进行连接。
合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。
如本文所用，术语“抗”、“结合”、“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10- 8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体特异性结合的多肽决定簇。本发明的表位是抗原中被抗体结合的区域。
HER-2
人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因定位于染色体17q21，属于原癌基因，其编码的HER-2蛋白为185KD的跨膜精蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的家族成员之一。HER-2蛋白在正常机体组织内不表达或低表达，在乳腺癌、卵巢癌和胃癌等多种肿瘤细胞中过表达，是典型的肿瘤治疗靶点和监测标志物。HER-2蛋白与其家族的其他成员组成同源或异源二聚体，启动下游信号通路，目前尚未发现能与HER-2蛋白直接结合的配体。世界上第一个用于临床治疗的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(Herceptin)，就是专门针对HER-2阳性乳腺癌的抗体治疗药物，该抗体可与HER-2的胞外结构域结合，阻断HER-2与非受体酪氨酸激酶的相互作用，从而引起HER-2下调，在临床治疗中效果显著。
CD47
分化簇47(cluster of differentiation 47，CD47)又称为整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，属于免疫球蛋白超家族，目前已知的天然配体有整合素、血小板反应蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)和信号调节蛋白α(signal-regulatoryproteinα，Sirpα)。在免疫应答中，CD47通过与巨噬细胞表面的Sirpα结合，释放“别吃我”信号，从而保证正常细胞不被巨噬细胞“吃掉”，然而一些肿瘤细胞也会利用CD47/Sirpα信号通路，高表达CD47以实现免疫逃逸。抗CD47抗体可针对多种适应症，主要包括非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma，NHL)和急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)等血液***恶性肿瘤，但是由于正常细胞包括红细胞和T淋巴细胞等也表达CD47，所以靶向CD47药物的毒副作用是此类药物开发的难点，目前暂无成功上市的抗CD47抗体药物。
TROP-2
人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,TROP-2)是由TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白。TROP-2为单次跨膜的I型膜蛋白，由323个氨基酸构成，其中信号肽26个氨基酸，胞外区248个氨基酸，跨膜区23个氨基酸，胞内区26个氨基酸。截至目前，TROP-2的配体蛋白还没有鉴定到，因此对其生理生化功能还不是十分明确。但是大量的临床研究和文献报道，TROP-2蛋白在各种人类上皮癌中高表达并且与患者的预后不良和癌细胞转移密切相关，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、***癌和***等。美国FDA已经批准TROP-2抗体偶联药物赛妥珠单抗-格卫替康(sacituzumabgovitecan)用于转移性三阴性乳腺癌的治疗。
CD3
分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)是T细胞表面重要的分化抗原，CD3分子与T细胞受体(T cell recptor，TCR)形成TCR-CD3复合体，TCRαβ亚基识别胞外信号并将胞外信号传递给CD3，CD3分子依靠自身免疫酪氨酸信号模体(immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM)将信号向胞内传递。抗CD3抗体可激发或阻断T细胞活化信号，清除效应T细胞或诱导调节T细胞产生。
异多聚体蛋白质
本发明提供的异多聚体蛋白质，诸如异二聚体蛋白质，其包含含有抗体重链恒定区CH3的第一多肽和含有抗体重链恒定区CH3的第二多肽，其中第一多肽恒定区CH3和第二多肽恒定区CH3包含工程化离子和/或电荷相互作用和静电相互作用。应理解，所述异多聚体蛋白质包含改造的Fc区段，所述改造的Fc区段包含第一多肽恒定区CH3和第二多肽恒定区CH3。
在一些优选例中，第一多肽恒定区CH3和第二多肽恒定区CH3包含“Knobs-into-Holes”残基。异多聚体蛋白质的示例性结构包括异二聚体(例如Fc融合蛋白)、异三聚体(例如抗体-免疫粘附素嵌合体)、异四聚体(例如双特异性抗体)和其它寡聚体结构。在一些优选例中，异多聚体蛋白质是双特异性抗体，例如具有非对称结构(包含两条不同的重链)的双特异性抗体。
本发明提供的异多聚体蛋白质，其包含改造的Fc区段，其中第一多肽恒定区CH3包含相对于野生型恒定区CH3在氨基酸位置394处利用带正电的氨基酸进行的取代，并/或第二多肽恒定区CH3包含相对于野生型恒定区CH3在氨基酸位置397处利用带负电荷的氨基酸进行的取代。
第一多肽恒定区CH3的394处的带正电荷的氨基酸与第二多肽恒定区CH3中的氨基酸残基形成离子和/或电荷相互作用，第二多肽恒定区CH3的397处的带负电荷的氨基酸与第一多肽恒定区CH3中的氨基酸残基形成离子和/或电荷相互作用。
双特异性抗体
在本发明的一个优选实施例中，所述异多聚体蛋白质为双特异性抗体。较佳地，所述双特异性抗体为抗HER-2和CD47的双特异性抗体，其包含改造的Fc区段，所述改造的Fc区段包含促进工程化离子和/或电荷相互作用的氨基酸替换和“Knobs-into-Holes”残基。进一步地，所述改造的Fc区段包含第一多肽恒定区CH3和第二多肽恒定区CH3，其包含选自下组的氨基酸取代：
第一多肽恒定区CH3：T394K、S354C、T366W；第二多肽恒定区CH3：V397D、Y349C、T366S、L368A、Y407V。
本发明的双特异性抗体为一种能与HER-2和CD47特异结合的不对称的双特异性抗体，其包含抗HER-2抗体部分和抗CD47抗体部分。具体地，其包含免疫球蛋白抗体IgG，一个Fab片段和一个可变区片段scFv，Fab片段包含可变区VH和恒定区CH1，以及可变区VL和恒定区CL，Fab片段通过接头肽L2与免疫球蛋白抗体IgG串联；单链可变片段scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接，单链可变片段scFv通过接头肽L2与免疫球蛋白抗体IgG串联。
本发明所述的“双特异性抗体”是指拥有两个不同的抗原结合位点，能同时结合HER-2和CD47的双特异性抗体，其包含一个Fab片段和一个可变区片段scFv，和与之缀合的免疫球蛋白抗体IgG，Fab片段和scFv经由肽接头L2分别连接至不同的IgG抗体重链上，形成双特异性抗体的的两条不同的重链并获得融合蛋白，其中scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接。
如上所述，本发明的双特异性抗体中的抗HER-2抗体部分为特异性结合HER-2蛋白的抗体或其抗原结合片段，抗CD47抗体部分为特异性结合CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段；所述的抗原结合片段的结构可以选自下组：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；或(vi)单域抗体dAb片段。
本发明的双特异性抗体可以为二聚体、三聚体或多聚体，优选为同源或异源二聚体。本发明的双特异性抗体中抗HER-2或抗CD47的抗体部分可以包括一个或多个抗体或其抗原结合片段，较佳地，1、2、3、4、5、6个。
作为优选的方案，本发明的双特异性抗体包含抗CD47抗体的scFv和HER-2的IgG抗体，其中所述抗CD47抗体的VH包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQID NO.3所示；
所述抗CD47抗体的VL包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述抗HER-2的IgG抗体的VH包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述抗HER-2的IgG抗体的VL包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本领域中，抗体的结合区通常均含有一条轻链可变区和一条重链可变区，每一个可变区均含有3个CDR结构域。抗体的重链和轻链的CDR结构域分别称为HCDR和LCDR。因此，常规抗体抗原结合位点包含六个CDR，包括分别来自重链和轻链V区的CDR集合。
在本发明中，本发明双特异性抗体的还包括其保守性变异体，指与本发明双特异性抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Leu(L) | Ala；Lys；Asp；Phe | Ala |
| Ser(S) | Cys；Thr | Cys |
| Thr(T) | Ser；Trp；Lys；Gly | Ser |
| Tyr(Y) | Cys；Val；Ser | Cys |
| Val(V) | Asp；Leu；Met；Phe | Asp |
作为优选的方案，第一重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，或在SEQID NO.18序列的基础上还具有选自第354、366和394位的氨基酸突变的序列，优选具有选自S354C、T366W和T394K中一个或多个位点氨基酸突变的序列；第二重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，或在SEQ ID NO.18序列的基础上还具有选自第349、366、368、407和397位的氨基酸突变的序列，优选具有选自Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D中一个或多个位点氨基酸突变的序列。
作为优选的方案，第一重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，或在SEQID NO.18序列的基础上还具有选自第354和366位的氨基酸突变的序列，优选具有选自和S354C和T366W中一个或多个位点氨基酸突变的序列；第二重链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO.18所示，或在SEQ ID NO.18序列的基础上还具有选自第349、366、368和407位的氨基酸突变的序列，优选具有选自Y349C、T366S、L368A和Y407V中一个或多个位点氨基酸突变的序列。
作为优选的方案，所述肽接头L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
作为优选的方案，所述肽接头L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。
作为优选的方案，所述单链可变片段scFv的分子结构形式为VH-L1-VL，每个scFv的C末端经由肽接头L2连接至免疫球蛋白抗体IgG重链的N末端。
作为优选的方案，所述单链可变片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
作为优选的方案，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.30和SEQ IDNO.31所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。
在构建本发明的双特异性抗体时，与该双特异性抗体的化学和物理稳定性相关的问题也得到了解决，诸如表达物理稳定的分子、增加热和盐依赖的稳定性、降低聚集、增加在高浓度下的溶解度以及维持分别针对两种抗原HER-2和CD47的亲和力等。
编码核酸和表达载体
本发明另一方面提供了一种多核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述所述的异多聚体蛋白质。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明所述核苷酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码上述单克隆抗体的核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述双特异性抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该双特异性抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明另一方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的核苷酸分子。
其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本发明所述表达载体较佳地为pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.4，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pTT5，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0，更佳地为pcDNA3.4。
本发明另外提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
作为优选的方案，所述宿主细胞是真核细胞。优选CHO细胞或293F细胞。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明另一方面提供了上述能与HER-2和CD47特异结合的双特异性抗体以及的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达能与HER-2和CD47特异结合的双特异性抗体；
b)分离并纯化步骤a)所述的双特异性抗体。
本发明所述的宿主细胞的培养方法、所述抗体的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及抗体分离纯化技术手册。本发明中公开的抗HER-2和CD47双特异性抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达能与HER-2和CD47特异结合的双特异性抗体；分离和纯化所述的抗HER-2和CD47双特异性抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的抗HER-2和CD47双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗HER-2和CD47双特异性抗体。本发明的发明人对所得抗HER-2和CD47双特异性抗体进行了检测实验，实验结果表明该抗HER-2和CD47双特异性抗体能很好地与靶细胞和抗原结合，具有较高的亲和力。
药物组合物
本发明的另一方面提供了一种组合物，所述组合物包含上述所述的能与HER-2和CD47特异结合的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。优选地，所述的组合物是药物组合物。
本发明提供的双特异性抗体，可以和药学上可接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明的双特异性抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述双特异性抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂。
本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的双特异性抗体可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双特异性抗体的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的双特异性抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的双特异性抗体还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的双特异性抗体或其免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
应用
本发明提供了与HER-2和CD47特异结合的双特异性抗体、或上述药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗癌症或肿瘤。
本发明所称的用于治疗癌症或肿瘤的药物，指具有抑制和/或***的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。
本发明所述的药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、直肠癌、结肠癌、***区癌、乳腺癌、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、***癌、***癌、胰腺癌、脑癌、睾丸癌、淋巴癌、移行细胞癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、慢性或急性白血病和所述癌的组合。
本发明的双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。
本发明的双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药以达到更加有效***的目的，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物：1)作用于核酸化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝脲类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)和草酸铂(Oxaliplatin)等；抗生素类如阿霉素(Adriamycin/Doxorubicin)、放线菌素D(DactinomycinD)、柔红霉素(Daunorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)、光辉霉素(Mithramycin)等；2)影响核酸代谢的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和培美曲塞(Pemetrexed)等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5-氟尿嘧啶、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(Hydroxycarbamide)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)和吉西他滨(Gemcitabine)等；3)作用于微管蛋白的药物：多西他赛(Docetaxel)、长春花碱(Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱等；2、激素类药物：抗***如他莫昔芬(Tamoxifen)、屈洛昔芬(Droloxifene)、依西美坦(Exemestane)等；芳香化酶抑制剂如氨鲁米特(Aminoglutethimide)、福美司坦(Formestane)、来曲唑(Letrozle)、阿那曲唑(Anastrozole)等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂类药物：此类药物主要通过调节机体免疫功能以到抗肿瘤的效果，如干扰素类(Interferon)；白细胞介素-2(Interleukin-2)；胸腺肽类(Thymosins)等；4、单克隆抗体类药物：曲妥昔单抗(Trastuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)等；5、其他类抗肿瘤药物：包括一些目前机制尚不明确、有待进一步研究的药物等。本发明公开的双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
本发明的主要优点包括
(1)本发明的异多聚体蛋白质包含具有促进离子和/或电荷相互作用的特定氨基酸取代的Fc段，通过与杵臼结构(KIH)突变相组合，有效促进异二聚体的形成和减少同二聚体的形成。
(2)本发明提供了在Fc区中具有工程化离子和/或电荷相互作用的氨基酸替换和“Knobs-into-Holes”杵臼结构的抗HER-2和CD47的双特异性抗体，其能够以高纯度稳定表达。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
以下实施例中使用的实验材料和来源以及实验试剂的配制方法具体说明如下。
实验材料：
感受态细胞：品牌生工，货号B528412。
293F细胞：品牌GIBCO，货号R79007。
0.45μm的过滤器：品牌密理博，货号SLHV013SL。
Hitrap Mabselect Sure层析柱：购自Cytiva公司。
HiLoad 26/600 Superdex 200pg柱：购自Cytiva公司。
AdvancedBio SEC 300A色谱柱：购自安捷伦公司。
GXⅡHT protein express labchip：购自PerkinElmer公司。
MassPREP Micro Desalting column：购自Waters公司。
实验试剂：
无内毒素质粒大提试剂盒：品牌天根，货号DP117。
DNA纯化回收试剂盒：品牌天根，货号DP214。
ClonExpressTM II One Step Cloning Kit：品牌诺唯赞，货号C112。
HS DNA Polymerase：品牌takara，货号R010B。
protein express reagent kit：品牌PerkinElmer，货号CLS960008。
PNGase F酶：品牌NEB，货号P0704S。
实验仪器：
Mastercycler nexus PCR仪：购自Eppendorf公司。
GX II仪：购自PerkinElmer公司。
Heraeus Fresco17离心机：购自Thermo公司。
UPLC-XEVO G2 Q-TOF液质联用***：购自Waters公司。
iCE3毛细管等点聚焦分析仪：购自ProteinSimple公司。
本发明的序列如下表所示：
表1.
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实施例1.KIH修饰的抗HER-2和CD47双抗分子构建
本发明采用了HER-2单抗IgG和CD47单抗scFv串联的方式，以及HER-2单抗IgG和HER-2单抗Fab片段重链区域串联的方式，通过knob-into-hole模式，构建了具有不对称结构的抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b，结构如图1所示，双特异性抗体a、b的CH3-CH3界面晶体结构局部视图分别如图1A、1B所示。
其中，HER-2的单抗来源于：三生国健药业按照Herceptin的可变区氨基酸序列、用CHO细胞表达***进行表达、自主研发的细胞培养生产工艺得到的人鼠嵌合单克隆抗体。
CD47的单抗来源于：WO2021218684A1中的人源化抗CD47抗体，其重链可变区和轻链可变区分别为Anti-CD47B-Hu-VH和Anti-CD47B-Hu-VL。
实施例中的抗HER-2单抗和抗CD47单抗对照分别为：按照上述相应的专利中公开的单抗氨基酸序列，参照实施例2中相同的表达纯化方法得到的单克隆抗体。
抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b都是异源二聚体，需对重链的恒定区CH3(SEQID NO.21)进行氨基酸突变，对恒定区CH3的S354C、T366W和T394K位点进行突变，获得抗HER-2单抗重链HC-Knob(SEQ ID NO.28)；对恒定区CH3的Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D位点进行突变，获得抗HER-2单抗重链HC-Hole(SEQ ID NO.29)。
其中的抗HER-2单抗Fab片段重链区域(SEQ ID NO.22)是由抗HER-2单抗重链可变区VH(SEQ ID NO.13)与重链恒定区CH1(SEQ ID NO.19)直接连接；其中抗CD47单抗可变片段scFv是通过肽接头L1(SEQ ID NO.24)连接CD47重链可变区VH(SEQ ID NO.15)和CD47轻链可变区VL(SEQ ID NO.16)，得到VH-L1-VL(SEQ ID NO.17)。
抗HER-2单抗Fab片段重链区域的C末端与抗HER-2单抗重链HC-Knob的N末端通过肽接头L2(SEQ ID NO:25)连接，获得抗HER-2和CD47双抗a的重链I(SEQ ID NO:30)；抗CD47单抗的可变片段scFv的C末端与抗HER-2单抗重链HC-Hole通过肽接头L2连接，获得抗HER-2和CD47双抗a的重链II(SEQ ID NO.31)，抗HER-2单抗轻链(SEQ ID NO:27)保持不变。
在抗HER-2和CD47双特异性抗体a的基础上对其重链恒定区CH3的氨基酸进行突变，获得抗HER-2和CD47双特异性抗体a’、b、c和c’，如表2所示。
为了提高抗体分子在CHO细胞中的表达效率，委托生工生物工程有限公司对抗HER-2和CD47双特异性抗体分子的核酸序列进行密码子优化，主要考虑密码子的偏好性、GC含量、mRNA的二级结构、重复序列等因素，并委托该公司对序列进行合成。
表2双抗分子重链恒定区CH3的氨基酸突变位点
实施例2.双抗的表达与纯化
将抗HER-2和CD47双特异性抗体的重链和轻链的DNA片段分别亚克隆到载体pcDNA3.4中，提取重组质粒并共转染293F细胞和/或CHO细胞。细胞培养5-7天后，将培养液通过高速离心，0.22μm滤膜过滤后上样至Hitrap Mabselect Sure亲和层析柱中，用100mM柠檬酸，pH3.5的洗脱液一步洗脱蛋白，回收目的样品并透析换液至pH7.4的PBS中，并进一步通过HiLoad 26/600 Superdex 200pg分子筛纯化，最后将纯化后的蛋白用UPLC-SEC检测，待测抗体用pH7.4的PBS调节浓度至1mg/mL，用Agilent 1290型UPLC检测SEC纯度，色谱柱为AdvancedBio SEC 300A(4.6*150mm，2.7μm)，流动相为磷酸-磷酸钠缓冲液(200mM，pH＝6.8±0.1)，运行时间为10分钟，得到抗HER-2和CD47双抗a和b分子的检测结果如图2A、图2B、表3所示。
实验结果表明，与单独具有KIH突变或者电荷突变的抗HER-2和CD47双抗c和c’分子的主峰纯度相比，抗HER-2和CD47双抗a分子的状态均一，单体纯度竟然能够出乎意料地达到90％以上，并且杂质1和杂质2的含量均显著下降(均小于6％或更低)；而抗HER-2和CD47双抗b分子中杂质2的含量超过10％，主峰纯度只有86.9％，低于双抗分子a的纯度；抗HER-2和CD47双抗a’分子的主峰纯度只有67.4％，都低于双抗a分子。
为了进一步证明双抗分子a的重链突变也可应用于其他靶点的非对称结构双抗制备，我们构建抗TROP-2和CD3的双特异性抗体分子d(其包括抗TROP-2的IgG抗体、抗CD3抗体的scFv片段)，其重链I包含S354C、T366W和T394K位突变，重链II包含Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D，分子d的Fc段中的替换完全与抗HER-2和CD47双抗a分子相同，如表3所示，单体纯度仍然达到90％以上。
表3不同双抗分子的纯化结果
| 双抗分子 | Fc段中的替换 | 产物百分比 | 杂质1 | 杂质2 |
| c | Knob into hole结构 | 77.4％ | 12.7％ | 9.9％ |
| c’ | T394K和V397D | 88.3％ | 8.3％ | 3.3％ |
| a | knob+T394K和Hole+V397D | 91.9％ | 2.4％ | 5.7％ |
| a’ | knob+V397D和Hole+T394K | 67.4％ | 14.1％ | 18.4％ |
| b | knob+L351K和Hole+L351D | 86.9％ | 2.6％ | 10.6％ |
| d | knob+T394K和Hole+V397D | 92.3％ | 5.0％ | 2.6％ |
实施例3.抗HER-2和CD47双抗a和b的CE-SDS检测
将抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b用超纯水调节浓度至1mg/mL，制备还原及非还原样品，参照protein express reagent kit说明，采用GXⅡHT protein expresslabchip芯片，用GX II毛细管电泳***检测样品的CE值，获得抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b的CE-SDS检测图谱如图3A和图3B所示。
实验结果表明，抗HER-2和CD47双抗a分子主峰占比为93.2％，与UPLC-SEC结果一致；抗HER-2和CD47双抗b分子主峰占比为94.2％，但是在该抗体大小约一半处存在5.8％的杂峰，说明该分子中存在一定量的半抗体结构。
实施例4.抗HER-2和CD47双抗a和b的分子量检测
将抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b用糖切酶PNGase F进行脱糖处理，用50mM的NH4HCO3稀释蛋白浓度至1mg/mL，转速12000rpm离心10min。取上清，经MassPREPTM MicroDesalting Column(20μm，2.1×5mm)脱盐柱后进行质谱分析，获得抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b的分子量检测图谱如图4A和图4B所示。
实验结果表明，抗HER-2和CD47双抗a分子状态均一，理论分子量与测试分子量一致，占比为100％；抗HER-2和CD47双抗b分子，理论分子量为与测试分子量基本一致，占比为61.9％，其中还含有38.1％大小为100KD的蛋白分子，说明该分子中存在一定量的未知结构杂质。
实施例5.抗HER-2和CD47双抗a和b的等电点检测
取抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b蛋白各100μg，加入182μl上样缓冲液，用超纯水定容至200μl，混匀并12000rpm离心5min除去气泡，取200μl上清，再12000rpm离心5min除气泡，将样品加入上样瓶后放入到iCE3毛细管等点聚焦分析仪中，设置仪器电泳参数，电泳10分钟后，获得抗HER-2和CD47双特异性抗体a和b的毛细管等电聚焦电泳图谱如图5A和图5B所示。
实验结果表明，抗HER-2和CD47双抗a的等电点主要集中在9.14-9.22之间，该范围占比97.07％，其中等电点9.22占比50.29％；抗HER-2和CD47双抗b的等电点在9.14-9.22之间，该范围占比87.07％，其中等电点9.18占比45.78％。说明抗HER-2和CD47双抗a的等电点范围相对更窄，单一等电点的蛋白含量相对更高。
讨论
通过上述实验可知，引入S354C、T366W和T394K位突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D突变的抗HER-2和CD47双特异性抗体a的体积排阻色谱、毛细管电泳、分子量质谱和等电点检测的结果均优于引入L351K和L351D抗HER-2和CD47双特异性抗体b。抗HER-2和CD47双特异性抗体a的目的蛋白含量更高且等电点范围更窄，相对更稳定，并且该突变适用于制备其他靶点的非对称双抗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种异多聚体蛋白质，其特征在于，包括含有第一重链恒定结构域3(CH3)结构域的第一多肽和含有第二重链恒定结构域3(CH3)结构域的第二多肽，其中所述第一CH3结构域包括相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置394处利用带正电荷的氨基酸进行的取代，和/或所述第二CH3结构域包括相对于野生型CH3结构域在氨基酸位置397处利用带负电荷的氨基酸进行的取代，所述氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
2.如权利要求1所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述第一CH3结构域在氨基酸位置394处包含赖氨酸(K)取代。
3.如权利要求1所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述第二CH3结构域在氨基酸位置397处包含天冬氨酸(D)取代。
4.如权利要求1所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域中，还包括一个或多个氨基酸取代，所述取代促进所述第一多肽和所述第二多肽之间形成杵-臼结构配对。
5.如权利要求1所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述异多聚体蛋白质包含第一重链、第二重链、第一轻链、第二轻链和第三轻链；其中，
所述第一重链从N端到C端包含：针对第一靶标的抗体重链可变结构域Z1、抗体重链恒定区Z4、针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2、第一CH1、第一CH2和第一CH3结构域；所述的第一轻链和第二轻链分别与所述第一重链配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第一靶标和第二靶标；
所述第二重链从N端到C端包含：针对第三靶标的抗原结合片段Z3，针对第二靶标的抗体重链可变结构域Z2、第二CH1、第二CH2和第二CH3结构域，所述的第三轻链分别与所述第二重链配合，使得所述的异多聚体蛋白质特异性结合于第二靶标；和针对第三靶标的抗原结合片段Z3特异性结合于第三靶标。
6.如权利要求5所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述异多聚体蛋白质具有两条重链和三条轻链，其中
第一重链自N端到C端包含：Fab-VH-CH1-铰链区-Fc1；
第二重链自N端到C端包含：scFv-VH-CH1-铰链区-Fc2；
所述轻链自N端到C端包含：VL-CL，其中所述第一重链的Fab的抗原结合结构域结合第一靶标；所述第一重链和第二重链的VH-CH1与所述轻链的VL-CL各自独立地形成结合于第二靶标的第二抗原结合域，所述第二重链的scFv的抗原结合结构域结合第三靶标。
7.如权利要求6所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述抗CD47抗体的重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；和
所述抗CD47抗体的轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；和
所述抗HER-2的IgG抗体的重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；和
所述抗HER-2的IgG抗体的轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
8.如权利要求7所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述抗HER-2的IgG抗体的重链可变区如SEQ ID NO.13所示；所述抗HER-2的IgG抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.14所示；和/或所述抗CD47抗体的重链可变区如SEQ ID NO.15所示；所述抗CD47抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.16所示。
9.如权利要求6所述的异多聚体蛋白质，其特征在于，所述的双特异性抗体选自下组：
(1)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
(2)将(1)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同时抗HER-2活性和抗CD47活性的由(1)衍生的多肽。
10.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码根据权利要求4-9中任一项所述的异多聚体蛋白质。
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