CN117568208A - 一种卷曲乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种卷曲乳杆菌及其应用。所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27662，分类命名为Lactobacillus crispatus BHC04。本发明的卷曲乳杆菌具有较强的生长能力和产酸能力。

Description

一种卷曲乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种卷曲乳杆菌及其应用。
背景技术
女性***被一系列不同的微生物定植，这些微生物组成了***微生物区系。健康女性***优势菌主要以乳杆菌属为主，这些乳杆菌通过不同作用机制有效拮抗致病菌。结合当前研究和乳杆菌在其他疾病缓解方面的作用机制研究，其在***中发挥的可能机制主要包括:(1)乳杆菌产生有效抗菌物质,如有机酸、过氧化氢(H2O2)、短链脂肪酸、细菌素等抗菌物质抑制致病菌的生长。(2)乳杆菌竞争黏附作用，乳杆菌通过与致病菌竞争上皮细胞的黏附位点，形成空间位阻，阻止致病菌的黏附和定植。(3)乳杆菌对***黏膜屏障的保护作用，***的上表皮覆盖着宫颈***黏液层。黏液层是与***微生物首先接触的部位，也是构成***屏障的重要组成之一。宫颈***粘液屏障的特性与黏附于其上的***微生物有关。(4)乳杆菌的免疫调节作用，乳杆菌可通过参与宿主局部免疫应答，调节由***炎相关致病菌引起的免疫反应。(5)乳杆菌对***菌群的调节作用，但是目前使用现有的菌种制得的抑菌剂其抑菌效果均比较差，生长活力差，现有的菌种在制备成抑菌产品后，无法实现长效抑菌，更无法有效治疗***、***炎、白带异常等***疾病，而且为了强化其抑菌效果，还在抑菌片中加入大量的化学药品，这些化学抑菌剂虽然具备杀菌效果，但是同时会破坏***中健康的菌群环境，造成***疾病的反复感染，因此，现有技术需要进一步的改进。
发明内容
本发明的目的是提供一株生长活力好，产酸能力强，抑菌效果好的抑菌性卷曲乳杆菌及应用。
一种卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27662，分类命名为Lactobacillus crispatus BHC04。
进一步的，所述的卷曲乳杆菌的16S rDNA全序列如SEQ ID No:1所示。
一种上述的卷曲乳杆菌分离纯化的方法，由以下步骤制备而成：(1)用无菌棉签从***下部的侧壁1/3处取得***分泌物，放入带有生理盐水的无菌试管中，于3-5℃下保存，得富集液；
(2)取步骤(1)中的富集液0.5-1mL，使用生理盐水稀释至10-2-10-4梯度后，再稀释后的富集液于MRS琼脂培养基平板上涂布，并在35-38℃的厌氧环境下倒置培养48h-60h，再挑取单个特征菌，该特征菌的直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，在35-38℃下厌氧培养48h-60h，反复划线至同一平板中的菌落颜色、大小、形状均一致，然后将菌落移接至含有MRS液体培养基的厌氧管中培养22-25h，得分离纯化后的卷曲乳杆菌。
进一步的，所述的步骤(1)中***分泌物与生理盐水的质量体积比为1-3g∶2-4ml，该生理盐水的质量浓度为8-9g/L。
进一步的，所述的步骤(2)中使用生理盐水稀释过的富集液与MRS琼脂培养基的体积比为：80-100μL：20-30mL；所述的步骤(2)中卷曲乳杆菌的菌落与MRS液体培养基的质量体积比为1-2g：100-200mL。
进一步的，所述的MRS液体培养基培养，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，K2HPO4·3H2O 2.68-3.15份，MnSO4·H2O 0.05-0.08份，MgSO40.048-0.052份，L-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份；所述的MRS琼脂培养基，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，K2HPO4·3H2O 2.68-3.15份，MnSO4·H2O 0.05-0.08份，MgSO40.048-0.052份，L-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份，琼脂粉13-17份。
一种含上述卷曲乳杆菌的***抑菌片，由以下重量分数的原料组成：卷曲乳杆菌粉0.3-0.7份，嗜酸乳杆菌粉0.2-0.5份、木糖醇60-90份、麦芽糊精2-5份、抗结剂0.2-0.5份。
进一步的，所述的卷曲乳杆菌粉为冻干粉，卷曲乳杆菌粉中活菌含量大于1.0×109cfu/g；所述的卷曲乳杆菌粉和嗜酸乳杆菌粉为冻干粉，嗜酸乳杆菌粉活菌含量大于1.0×108cfu/g。
进一步的，所述的抗结剂为二氧化硅粉末或者硬脂酸镁。
一种使用上述卷曲乳杆菌的***抑菌片制备方法，由以下步骤组成：将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌制备成冻干粉并混合均匀，在30-34℃下放置30-35min后与麦芽糊精按照“等量递加法”混匀，继而加入称重好的木糖醇、抗结剂混合均匀后，进入压片机压制成片，即得成品。
本发明的卷曲乳杆菌具有较强的生长能力和产酸能力，并且本发明的卷曲乳杆菌发酵上清液对金黄葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌均具有较强的抑制能力本发明制得***抑菌片可以有效治疗***、念珠性***炎、白带异常等疾病，无复发。
附图说明
图1为本发明的SEQ ID No:1序列图。
图2为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)BHC04菌落形态图。
图3为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)BHC04镜检结果图。
图4为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)BHC04的生长曲线。
图5为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)BHC04发酵液的48hpH变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
一种卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27662，分类命名为Lactobacillus crispatus BHC04。
进一步的，所述的卷曲乳杆菌的16S rDNA全序列如SEQ ID No:1所示。
一种上述的卷曲乳杆菌分离纯化的方法，由以下步骤制备而成：(1)用无菌棉签从***下部的侧壁1/3处取得***分泌物，放入带有生理盐水的无菌试管中，于3℃下保存，得富集液；
(2)取步骤(1)中的富集液0.5mL，使用生理盐水稀释至10-2梯度后，再稀释后的富集液于MRS琼脂培养基平板上涂布，并在35℃的厌氧环境下倒置培养48h，再挑取单个特征菌，该特征菌的直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，在35℃下厌氧培养48h，反复划线至同一平板中的菌落颜色、大小、形状均一致，然后将菌落移接至含有MRS液体培养基的厌氧管中培养22h，得分离纯化后的卷曲乳杆菌。
所述的步骤(1)中***分泌物与生理盐水的质量体积比为1g∶2ml，该生理盐水的质量浓度为8g/L。
所述的步骤(2)中使用生理盐水稀释过的富集液与MRS琼脂培养基的体积比为：80μL：20mL；所述的步骤(2)中卷曲乳杆菌的菌落与MRS液体培养基的质量体积比为1g：100mL。
所述的MRS液体培养基培养，由以下重量份数原料组成，酵母膏3份，蛋白胨8份，牛肉膏8份，乙酸钠3份，葡萄糖18份，柠檬酸二铵2份，K2HPO4·3H2O 2.68份，MnSO4·H2O 0.05份，MgSO40.048份，L-半胱氨酸盐酸盐0.3份；所述的MRS琼脂培养基，由以下重量份数原料组成，酵母膏3份，蛋白胨8份，牛肉膏8份，乙酸钠3份，葡萄糖18份，柠檬酸二铵2份，K2HPO4·3H2O 2.68份，MnSO4·H2O 0.05份，MgSO40.048份，L-半胱氨酸盐酸盐0.3份，琼脂粉13份。
卷曲乳杆菌BHC04的鉴定
菌落特征
卷曲乳杆菌在MRS琼脂培养基培养48h后，直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，如图2。
显微镜下形态
卷曲乳杆菌菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，圆端直杆菌，单个、成对或链状，无鞭毛，不产芽孢，如图3。
16S rDNA鉴定
通过16S rDNA基因测序，对筛选出的菌株进行鉴定。采用DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司)提取目标基因组DNA。利用27F和1492R两个通用引物进行16S rDNA的PCR实验，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度约1.5kb。将PCR产物送至深圳华大基因科技服务有限公司进行测序，并与NCBI BLAST序列数据库进行对比，从物种水平鉴定菌株，结果显示该序列(如SEQ ID NO:1所示)与卷曲乳杆菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
结合菌株卷曲乳杆菌BHC04的序列比对结果和生理生化结果，确定筛选的乳酸菌为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。
将对数生长期的卷曲乳杆菌，以2％的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃培养2小时，开始进入对数生长期，培养24小时到达稳定期。卷曲乳杆菌BHC04的生长曲线和产酸曲线见图4和图5。
一种含上述卷曲乳杆菌的***抑菌片，由以下重量分数的原料组成：卷曲乳杆菌粉0.3份，嗜酸乳杆菌粉0.2份、木糖醇60份、麦芽糊精2份、抗结剂0.2份。
所述的卷曲乳杆菌粉为冻干粉，卷曲乳杆菌粉中活菌含量大于1.0×109cfu/g；所述的卷曲乳杆菌粉和嗜酸乳杆菌粉为冻干粉，嗜酸乳杆菌粉活菌含量大于1.0×108cfu/g。
所述的抗结剂为二氧化硅粉末。
一种使用上述卷曲乳杆菌的***抑菌片制备方法，由以下步骤组成：将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌制备成冻干粉并混合均匀，在30℃下放置30min后与麦芽糊精按照“等量递加法”混匀，继而加入称重好的木糖醇、抗结剂混合均匀后，进入压片机压制成片，即得成品。
使用方法：每晚睡前用清水清洗外阴，将1片上述益生菌产品推入***深部，一片为1g，设计每1个疗程为10天，嘱患者使用期间及复查前禁止性生活，避开经期，避免全身使用抗生素，避免使用其他***药物。
实施例2：
一种卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27662，分类命名为Lactobacillus crispatus BHC04。
进一步的，所述的卷曲乳杆菌的16S rDNA全序列如SEQ ID No:1所示。
一种上述的卷曲乳杆菌分离纯化的方法，由以下步骤制备而成：(1)用无菌棉签从***下部的侧壁1/3处取得***分泌物，放入带有生理盐水的无菌试管中，于4℃下保存，得富集液；
(2)取步骤(1)中的富集液0.8mL，使用生理盐水稀释至10-3梯度后，再稀释后的富集液于MRS琼脂培养基平板上涂布，并在35-38℃的厌氧环境下倒置培养50h，再挑取单个特征菌，该特征菌的直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，在36℃下厌氧培养50h，反复划线至同一平板中的菌落颜色、大小、形状均一致，然后将菌落移接至含有MRS液体培养基的厌氧管中培养23h，得分离纯化后的卷曲乳杆菌。
所述的步骤(1)中***分泌物与生理盐水的质量体积比为2g∶3ml，该生理盐水的质量浓度为8.5g/L。
所述的步骤(2)中使用生理盐水稀释过的富集液与MRS琼脂培养基的体积比为：90μL：25mL；所述的步骤(2)中卷曲乳杆菌的菌落与MRS液体培养基的质量体积比为1.5g：150mL。
所述的MRS液体培养基培养，由以下重量份数原料组成，酵母膏5份，蛋白胨10份，牛肉膏10份，乙酸钠5份，葡萄糖20份，柠檬酸二铵2.5份，K2HPO4·3H2O3份，MnSO4·H2O 0.07份，MgSO40.05份，L-半胱氨酸盐酸盐0.6份；所述的MRS琼脂培养基，由以下重量份数原料组成，酵母膏6份，蛋白胨10份，牛肉膏10份，乙酸钠6份，葡萄糖20份，柠檬酸二铵2.5份，K2HPO4·3H2O 3份，MnSO4·H2O 0.07份，MgSO40.05份，L-半胱氨酸盐酸盐0.5份，琼脂粉15份。
卷曲乳杆菌BHC04的鉴定
菌落特征
卷曲乳杆菌在MRS琼脂培养基培养48h后，直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，如图2。
显微镜下形态
卷曲乳杆菌菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，圆端直杆菌，单个、成对或链状，无鞭毛，不产芽孢，如图2。
16S rDNA鉴定
通过16S rDNA基因测序，对筛选出的菌株进行鉴定。采用DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司)提取目标基因组DNA。利用27F和1492R两个通用引物进行16S rDNA的PCR实验，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度约1.5kb。将PCR产物送至深圳华大基因科技服务有限公司进行测序，并与NCBI BLAST序列数据库进行对比，从物种水平鉴定菌株，结果显示该序列(如SEQ ID NO:1所示)与卷曲乳杆菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
结合菌株卷曲乳杆菌BHC04的序列比对结果和生理生化结果，确定筛选的乳酸菌为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。
将对数生长期的卷曲乳杆菌，以2％的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃培养2小时，开始进入对数生长期，培养16小时到达稳定期。卷曲乳杆菌BHC04的生长曲线和产酸曲线见图3和图4。
一种含上述卷曲乳杆菌的***抑菌片，由以下重量分数的原料组成：卷曲乳杆菌粉0.5份，嗜酸乳杆菌粉0.3份、木糖醇80份、麦芽糊精3份、抗结剂0.3份。
所述的卷曲乳杆菌粉为冻干粉，卷曲乳杆菌粉中活菌含量大于1.0×109cfu/g；所述的卷曲乳杆菌粉和嗜酸乳杆菌粉为冻干粉，嗜酸乳杆菌粉活菌含量大于1.0×108cfu/g。
所述的抗结剂为硬脂酸镁。
一种使用上述卷曲乳杆菌的***抑菌片制备方法，由以下步骤组成：将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌制备成冻干粉并混合均匀，在32℃下放置32min后与麦芽糊精按照“等量递加法”混匀，继而加入称重好的木糖醇、抗结剂混合均匀后，进入压片机压制成片，即得成品。
使用方法：每晚睡前用清水清洗外阴，将1片上述益生菌产品推入***深部，一片为1g，设计每1个疗程为10天，嘱患者使用期间及复查前禁止性生活，避开经期，避免全身使用抗生素，避免使用其他***药物。
实施例3
一种卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27662，分类命名为Lactobacillus crispatus BHC04。
进一步的，所述的卷曲乳杆菌的16S rDNA全序列如SEQ ID No:1所示。
一种上述的卷曲乳杆菌分离纯化的方法，由以下步骤制备而成：(1)用无菌棉签从***下部的侧壁1/3处取得***分泌物，放入带有生理盐水的无菌试管中，于5℃下保存，得富集液；
(2)取步骤(1)中的富集液1mL，使用生理盐水稀释至10-4梯度后，再稀释后的富集液于MRS琼脂培养基平板上涂布，并在38℃的厌氧环境下倒置培养60h，再挑取单个特征菌，该特征菌的直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，在38℃下厌氧培养60h，反复划线至同一平板中的菌落颜色、大小、形状均一致，然后将菌落移接至含有MRS液体培养基的厌氧管中培养25h，得分离纯化后的卷曲乳杆菌。
所述的步骤(1)中***分泌物与生理盐水的质量体积比为3g∶4ml，该生理盐水的质量浓度为9g/L。
所述的步骤(2)中使用生理盐水稀释过的富集液与MRS琼脂培养基的体积比为：100μL：30mL；所述的步骤(2)中卷曲乳杆菌的菌落与MRS液体培养基的质量体积比为2g：200mL。
所述的MRS液体培养基培养，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨12份，牛肉膏12份，乙酸钠7份，葡萄糖22份，柠檬酸二铵3份，K2HPO4·3H2O 3.15份，MnSO4·H2O0.08份，MgSO4 0.052份，L-半胱氨酸盐酸盐0.7份；所述的MRS琼脂培养基，由以下重量份数原料组成，酵母膏7份，蛋白胨12份，牛肉膏12份，乙酸钠7份，葡萄糖22份，柠檬酸二铵3份，K2HPO4·3H2O 3.15份，MnSO4·H2O 0.08份，MgSO40.052份，L-半胱氨酸盐酸盐0.7份，琼脂粉17份。
卷曲乳杆菌BHC04的鉴定
菌落特征
卷曲乳杆菌在MRS琼脂培养基培养48h后，直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，如图2。
显微镜下形态
卷曲乳杆菌菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，圆端直杆菌，单个、成对或链状，无鞭毛，不产芽孢，如图3。
16S rDNA鉴定
通过16S rDNA基因测序，对筛选出的菌株进行鉴定。采用DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司)提取目标基因组DNA。利用27F和1492R两个通用引物进行16S rDNA的PCR实验，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度约1.5kb。将PCR产物送至深圳华大基因科技服务有限公司进行测序，并与NCBI BLAST序列数据库进行对比，从物种水平鉴定菌株，结果显示该序列(如SEQ ID NO:1所示)与卷曲乳杆菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
结合菌株卷曲乳杆菌BHC04的序列比对结果和生理生化结果，确定筛选的乳酸菌为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。
将对数生长期的卷曲乳杆菌，以2％的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃培养2小时，开始进入对数生长期，培养24小时到达稳定期。卷曲乳杆菌BHC04的生长曲线和产酸曲线见图4和图5。
一种含上述卷曲乳杆菌的***抑菌片，由以下重量分数的原料组成：卷曲乳杆菌粉0.7份，嗜酸乳杆菌粉0.5份、木糖醇90份、麦芽糊精5份、抗结剂0.5份。
所述的卷曲乳杆菌粉为冻干粉，卷曲乳杆菌粉中活菌含量大于1.0×109cfu/g；所述的卷曲乳杆菌粉和嗜酸乳杆菌粉为冻干粉，嗜酸乳杆菌粉活菌含量大于1.0×108cfu/g。
所述的抗结剂为二氧化硅粉末。
一种使用上述卷曲乳杆菌的***抑菌片制备方法，由以下步骤组成：将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌制备成冻干粉并混合均匀，在34℃下放置35min后与麦芽糊精按照“等量递加法”混匀，继而加入称重好的木糖醇、抗结剂混合均匀后，进入压片机压制成片，即得成品。
使用方法：每晚睡前用清水清洗外阴，将1片上述益生菌产品推入***深部，一片为1g，设计每1个疗程为10天，嘱患者使用期间及复查前禁止性生活，避开经期，避免全身使用抗生素，避免使用其他***药物。
试验例1：
对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制
1.抑菌样品的制备
将本实施例1中分离纯化后的卷曲乳杆菌按2％接种在厌氧管37℃培养48h，然后在4℃，6000rpm离心10min，0.22μL滤膜过滤，得卷曲乳杆菌样品菌液，4℃冰箱保存备用。
2.指示菌的制备
分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌按1％接种，摇床180r/min，37℃培养12h，得大肠杆菌指示菌液和金黄色葡萄球菌指示菌液，在4℃冰箱保存备用。
3.菌株抑菌能力的测定
用定君生中的菌株德氏乳杆菌DM8909作为对照。取分别取适量大肠杆菌指示菌液和金黄色葡萄球菌指示菌液加入50℃左右的LB培养基，使培养基中指示菌为1×106cfu/mL，充分混匀后倒平板，将平板敞口放置在操作台90min吹干凝固，随后将牛津杯放置于平板表面，加入200μL抑菌粗品，冰箱4℃扩散12h，37℃培养8～10h，抑菌圈结果表1所示。
表1卷曲乳杆菌BHC04对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力
结果显示：本发明卷曲乳杆菌BHC04对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力显著高于阳性对照德氏乳杆菌DM8908。
试验例2：
卷曲乳杆菌对白色念珠菌的抑制
1.指示菌的制备
将白色念珠菌按1％接种于沙氏葡萄糖培养基，在摇床100r/min，28℃培养24h，制备菌悬液，调整菌体浓度为1×104cfu/mL。
2.微量孔板法
用定君生中的菌株德氏乳杆菌DM8909作为对照。九十六孔板每孔加入190μL乳酸菌无菌体发酵液以及10μL指示菌悬液，用MRS代替乳酸菌无菌体发酵液作为对照。在28℃培养48h后于酶标仪580nm处测定其吸光度。
3.抑菌率
乳酸菌的抑菌活性以其对指示真菌的抑菌率表示，按如下公式计算抑菌率，其中ODLAB指示菌和发酵液培养48h在580nm处的吸光度，ODControl:指示菌和MRS培养48h在580nm处的吸光度。
抑菌率(％)＝(1-ODLAB/ODControl)％
表2卷曲乳杆菌BHC04对白色念珠菌的抑制能力
菌种 白色念珠菌/％
德氏乳杆菌DM8909 72.58％±0.0018b
卷曲乳杆菌BHC04 72.80％±0.0030a
结果显示：本发明卷曲乳杆菌BHC04对白色念珠菌的抑制能力显著高于阳性对照德氏乳杆菌DM8908。
试验例3：
生长曲线的测定：
将实施例1中分离纯化后的卷曲乳杆菌进行活化传代，并以2％(体积分数)的接种量在MRS液体培养基中接种菌株，选取原MRS液体培养基作为空白对照，每隔4h测定菌液的OD600值，监测48h。
卷曲乳杆菌BHC04的生长曲线见图4，由图可知，该菌株生长迅速，几乎没有延滞期，0～12h时，菌体迅速增加，可见菌株适应环境能力强，12h后各菌株的生长速率减缓，但仍有增长，16h时就进入稳定生长期，并且持续稳定生长，具有优秀的生长活力以及稳定的生长周期，可长时间在***中存活和生长。
试验例4：
将实施例2中分离纯化后的卷曲乳杆菌进行活化传代，并以2％(体积分数)的接种量在MRS液体培养基中接种菌株，每隔4h测定菌液的pH值，监测48h。
卷曲乳杆菌BHC04的发酵液pH变化见图5，菌株pH变化与菌株生长曲线密切相关。由图可知，0～12h内其随着菌体数目的增加而快速降低，由于本菌种具备较强的产酸能力，因此pH快速下降，12h后随着培养时间的延长，导致代谢产物积累和营养物质消耗，使待测菌株的增殖速度受到明显抑制，pH值的下降速率减缓，36h后菌株培养液pH基本保持稳定，但仍有下降，该菌株最低pH可达4.10，而该pH下菌种不仅仍然具备活性，可以持续产酸，使***可以保持在酸性环境下，为其他有益菌提供有益其生存的生长环境，保证***菌群环境的健康。
试验例5：
观察***患者107例，其中I度55例，II度30例，III度22例。睡前用清水清洗外阴，将1片上述益生菌产品置入***深部，设计每10天为一个疗程，嘱患者使用期间及复查前禁止性生活，避开经期，避免全身使用抗生素，避免***使用其他药物。2个疗程后，55位I度患者中50位症状消失，痊愈率90.9％，5位症状明显缓解，显效率9.1％，总有效率100％；30例II度转为I度，22例III度有12例转为II度。继续使用3个疗程后，35位I度症状消失，12例II度转为I度，10例III度转为II度，总有效率100％，无复发。
试验例6：
观察念珠性***炎患者31例。每晚睡前用清水清洗外阴，将1片上述益生菌片剂放入***深部，上述每1个疗程为10天。嘱患者使用期间及复查前禁止性生活，避免全身使用抗生素，避免***使用其他药物。2个疗程后24例症状消失，治愈率77.4％，4例症状缓解，显效率12.9％，继续使用，三个疗程后，治愈28例，治愈率90.3％，2例症状缓解，显效率6.4％，总有效率96.7％。1例无效，本人不同意继续用药，总有效率96.7％，无复发。
试验例7：
观察白带多患者56例。每晚睡前用清水清洗外阴，将1片上述益生菌片剂放入***深部，1个疗程为10天。嘱患者使用期间及复查前禁止性生活，避免全身使用抗生素，避免***使用其他药物。2个疗程后54例症状减轻，显效率96.43％，继续使用，三个疗程后，治愈率96.43％(54/56)，2例症状明细那减轻，显效率3.37％(2/56)，总有效率100％，无复发。

Claims (10)

1.一种卷曲乳杆菌，其特征在于，所述卷曲乳杆菌已于2023年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27662，分类命名为Lactobacillus crispatus BHC04。
2.根据权利要求1所述的卷曲乳杆菌，其特征在于，所述的卷曲乳杆菌的16S rDNA全序列如SEQ ID No:1所示。
3.一种权利要求1-2所述的卷曲乳杆菌分离纯化的方法，其特征在于，由以下步骤制备而成：
(1)用无菌棉签从***下部的侧壁1/3处取得***分泌物，放入带有生理盐水的无菌试管中，于3-5℃下保存，得富集液；
(2)取步骤(1)中的富集液0.5-1mL，使用生理盐水稀释至10-2-10-4梯度后，再稀释后的富集液于MRS琼脂培养基平板上涂布，并在35-38℃的厌氧环境下倒置培养48h-60h，再挑取单个特征菌，该特征菌的直径在0.3-1.0mm之间，菌落圆形，中部***、光滑湿润、呈乳白色边缘整齐，白色，表面湿润光滑，在35-38℃下厌氧培养48h-60h，反复划线至同一平板中的菌落颜色、大小、形状均一致，然后将菌落移接至含有MRS液体培养基的厌氧管中培养22-25h，得分离纯化后的卷曲乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的卷曲乳杆菌的分离纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中***分泌物与生理盐水的质量体积比为1-3g∶2-4ml，该生理盐水的质量浓度为8-9g/L。
5.根据权利要求3所述的分离纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中使用生理盐水稀释过的富集液与MRS琼脂培养基的体积比为：80-100μL：20-30mL；所述的步骤(2)中卷曲乳杆菌的菌落与MRS液体培养基的质量体积比为1-2g：100-200mL。
6.根据权利要求3所述的分离纯化的方法，其特征在于，所述的MRS液体培养基培养，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，K2HPO4·3H2O 2.68-3.15份，MnSO4·H2O 0.05-0.08份，MgSO40.048-0.052份，L-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份；所述的MRS琼脂培养基，由以下重量份数原料组成，酵母膏3-7份，蛋白胨8-12份，牛肉膏8-12份，乙酸钠3-7份，葡萄糖18-22份，柠檬酸二铵2-3份，K2HPO4·3H2O 2.68-3.15份，MnSO4·H2O 0.05-0.08份，MgSO40.048-0.052份，L-半胱氨酸盐酸盐0.3-0.7份，琼脂粉13-17份。
7.一种含权利要求5中卷曲乳杆菌的***抑菌片，其特征在于，由以下重量分数的原料组成：卷曲乳杆菌粉0.3-0.7份，嗜酸乳杆菌粉0.2-0.5份、木糖醇60-90份、麦芽糊精2-5份、抗结剂0.2-0.5份。
8.根据权利要求5中卷曲乳杆菌的***抑菌片，其特征在于，所述的卷曲乳杆菌粉为冻干粉，卷曲乳杆菌粉中活菌含量大于1.0×109cfu/g；所述的卷曲乳杆菌粉和嗜酸乳杆菌粉为冻干粉，嗜酸乳杆菌粉活菌含量大于1.0×108cfu/g。
9.根据权利要求5中卷曲乳杆菌的***抑菌片，其特征在于，所述的抗结剂为二氧化硅粉末或者硬脂酸镁。
10.一种使用权利要求9所述的卷曲乳杆菌的***抑菌片制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌制备成冻干粉并混合均匀，在30-34℃下放置30-35min后与麦芽糊精按照“等量递加法”混匀，继而加入称重好的木糖醇、抗结剂混合均匀后，进入压片机压制成片，即得成品。
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