CN117534585A - 一种新型可电离阳离子脂质化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型可电离阳离子脂质化合物及其制备方法与应用。具有式I所示结构；其中n为2～4的整数；R1为‑CH3，‑CH2CH3，‑CH2CH2CH3，‑CH2CH2CH2CH3，‑CH2OH，‑CH2CH2OH，‑CH2CH2CH2OH，‑CH2CH2CH2CH2OH，‑CH2CH2NHCOCH3；R2为‑H；R3、R4、R5为或X为O，S或N杂原子，n1选自1～10的整数，m1选自1～10的整数；R6为包含或不含杂原子的C6‑25烷基、烯基或炔基。本发明提供的新型化合物具有更好的核酸包封率及细胞或体内转染率，其脂质纳米颗粒具有特异性靶向肝脏，脾脏和/或肺部的功能作用。

Description

一种新型可电离阳离子脂质化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药用化合物技术领域，具体涉及一种新型可电离阳离子脂质化合物及其制备方法与应用。
背景技术
核酸是生命体重要的组成原件，并在生命活动中发挥关键作用。基于核酸的纳米医学是一种通过核酸分子(包括DNA类和RNA类)治疗或预防疾病的方法。其中DNA类包括如质粒和反义寡核苷酸(ASO)等；RNA类包括如小干扰RNA(siRNA)、内源性microRNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)，成簇的有规律地间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)，以及RNA适配体等。其可以通过基因的抑制、添加、替换或编辑来实现。受益于在核酸生物学、核酸疗法和基于核酸的纳米医学传输***领域的长期研究。这些基于核酸的治疗方法已被广泛开发和使用，如基于mRNA的疫苗，mRNA-1273(Moderna)和BNT162b2(Pfizer/BioNTech)应用在应对2019年冠状病毒(COVID-19)的预防。然而，目前在核酸治疗应用中仍面临很多问题，例如，mRNA是一种带负电的亲水大分子，其较大的分子量和大量负电荷使其难以透过细胞膜；mRNA并且具有酶不稳定性，其单链结构极易被RNA酶降解。所以，如何将mRNA有效地递送到靶器官或靶细胞是实现其体内应用的关键技术。因此，急需要开发低毒、高效、具有器官/组织细胞靶向性的递送***，尤其是用于非肝靶向递送的可电离阳离子脂质化合物以及相关的方法和组合物，以促进各类治疗或预防剂在胞外或胞内的递送以用于治疗和/或预防的目的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型可电离阳离子脂质化合物及其制备方法与应用。本发明提供的新型可电离阳离子脂质化合物，其可用于递送生物活性分子(如，DNA，siRNA，miRNA，mRNA，多肽，蛋白质等)，尤其适用于运输具有负电荷的核酸分子，例如DNA，siRNA，mRNA等。为生物活性分子递送以及核酸预防剂及治疗剂的发展和应用提供更多的选择。
本发明第一方面提供的新型可电离阳离子脂质化合物，具有式I所示结构：
其中，n为2～4的整数；R1为-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH3CH3，-CH2OH，-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CH2CH2CH2OH，-CH2CH2NHCOCH3；R2为-H；R3、R4、R5为X为O，S或N杂原子，n1选自1～10的整数，m1选自1～10的整数；R6为包含或不含杂原子的C6-25烷基、烯基或炔基。本发明的新型可电离阳离子脂质化合物具有三条疏水尾链结构，相比较于传统的四条疏水尾链结构的化合物其可以在空间结构上提高对核酸的包封率，更好的细胞或体内转染率，本发明发现了可电离阳离子脂质化合物立体空间结构对于促进转染率的内在规律，最主要的是通过改变其疏水尾链的不饱和度，杂原子，支链结构或长度可以调节可电离阳离子脂质化合物的立体空间结构，并使其脂质纳米颗粒具有特异性靶向肝脏，脾脏和/或肺部的功能作用。
在本发明的优选实施方式中，R3、R4、R5为 X为O，S或N杂原子，n1选自1～10的整数，m1选自1～10的整数，n1和m1彼此独立，可以相同也可以不同；R6为直链或支链C6-25烷基，直链或支链C6-25烯基，直链或支链C6-25炔基，所述烷基、烯基或炔基的至少1个C原子任选被独立地选自O、S或N的杂原子所替换。
在本发明的优选实施方式中，n为2，R1为-CH3，R2为-H；优选的，式I化合物为其中，R3、R4、R5为/>X为O，S或N杂原子，n1选自1～10的整数，m1选自1～10的整数，n1和m1彼此独立，可以相同也可以不同；R6为直链或支链C6-25烷基，直链或支链C6-25烯基，直链或支链C6-25炔基，所述烷基、烯基或炔基的至少1个C原子任选被独立地选自O、N、S、S-S或Se的杂原子所替换。
作为本发明的一些优选的实施方案，所述式I化合物为n为2，R1为-CH3，R2为-H；其中，R3、R4、R5为/>R6为直链或支链C6-25烷基，直链或支链C6-25烯基，所述烷基、烯基的至少1个C原子任选被独立地选自O、S或N的杂原子所替换；优选的，X为O或N杂原子；进一步优选，n1为选自4～8的整数，m1为选自4～8的整数，R6为直链或支链C6-18烷基，直链或支链C6-18烯基，所述烷基、烯基的至少1个C原子任选被独立地选自S或S-S的杂原子所替换。
在本发明的优选实施方式中，所述新型可电离阳离子脂质化合物选自式A化合物，式B化合物，式C化合物，或式D化合物：
其中每条支链上的n2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的整数，m2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的整数，每个Y各自独立的选自0～3的整数；优选的，每个n2都选自4～8的整数，每个m2都选自4～8的整数，每个Y各自独立的选自0～2的整数。
其中每条支链上的n3各自独立的选自1～18的整数优选6～18的整数；优选的，每个n3都选自6～18的整数。
其中每条支链上的n4各自独立的选自1～18的整数优选2～18的整数；优选的，每个n4都选自2～18的整数。
其中每条支链上的n5各自独立的选自1～18的整数优选4～18的整数，m5各自独立的选自1～18的整数优选1～14的整数；优选的，每个n5都选自4～18的整数，每个m5都选自1～14的整数。
本发明提供的R2为-H的同时优化其余三条疏水尾链的新型可电离脂质化合物，该特定新型化合物具有比现有四条疏水尾链分子结构的化合物具有更高的细胞转染率效果，这或许也与该化合物具有的不同构型/构象，立体空间结构等有所关联；例如亲水头基更容易形成一个可电离带正电的亲水平面与带负电mRNA相互作用结合，以增加脂质纳米颗粒对mRNA的负载量。其在偏酸性的溶酶体微环境中，含有三条疏水尾链的化合物倾向形成锥形的分子结构，这可以促进细胞膜的六边形转换和溶酶体逃逸。并且在此基础上同时优化X基团或疏水尾链(包括，不饱和度，杂原子，支链结构和/烷基链长度)能提供具有更优异的特异性靶向效果的非肝靶向递送的脂质化合物及递送***，更高效的将核酸递送到靶器官。
本发明还提供了这些新型可电离阳离子脂质化合物的合成方法。本发明的新型可电离阳离子脂质化合物可以采用本领域已有的方法进行合成，例如，使用一当量或一当量以上的胺(含胺基的亲水极性头部)与三当量或三当量以上的疏水脂质尾链化合物在合适的条件下反应形成。可电离脂质化合物的合成是在有或无溶剂的情况下进行，并且所述合成可在25-120℃范围内的较高温度下进行。可任选纯化制得的可电离阳离子脂质化合物。例如，可纯化可电离阳离子脂质化合物的混合物，得到特定的可电离阳离子脂质化合物，如含有三条疏水脂质尾链的产物。所述疏水脂质尾链化合物可以商业购买，或者合成制备。
在本发明的一些实施方式中提供所述新型可电离阳离子脂质化合物的制备方法，包括：
化合物合成路线：
(其中每条支链上的n2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的整数，m2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的整数，每个Y各自独立的选自0～3的整数；优选的，每个n2都选自4～8的整数，每个m2都选自4～8的整数，每个Y各自独立的选自0～2的整数)
具体包括以下步骤：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物A1的羟基酯化成酯基以获得化合物A2；
2)迈克尔加成：使化合物A2与胺(例如，N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺)通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物。
在本发明的一些实施方式中，所提供的所述新型可电离阳离子脂质化合物的制备方法，包括：
化合物合成路线：
(其中每条支链上的n3各自独立的选自1～18的整数优选6～18的整数；优选的，每个n3都选自6～18的整数。)
具体包括以下步骤：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物B1的羟基酯化成酯基以获得化合物B2；
2)迈克尔加成：使化合物B2与胺(例如，N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺)通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物。
在本发明的一些实施方式中，所提供的所述新型可电离阳离子脂质化合物的制备方法，包括：
化合物合成路线：
(其中每条支链上的n4各自独立的选自1～18的整数优选2～18的整数；优选的，每个n4都选自2～18的整数)
具体包括以下步骤：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物C1的羟基酯化成酯基以获得化合物C2；
2)迈克尔加成：使化合物C2与胺(例如，N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺)通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物。
在本发明的一些实施方式中，所提供的所述新型可电离阳离子脂质化合物的制备方法，包括：
化合物合成路线：
(其中每条支链上的n5各自独立的选自1～18的整数优选4～18的整数，m5各自独立的选自1～18的整数优选1～14的整数；优选的，每个n5都选自4～18的整数，每个m5都选自1～14的整数)
具体包括以下步骤：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物D1的羟基酯化成酯基以获得化合物D2；
2)迈克尔加成：使化合物D2与胺(例如，N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺)通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物。
根据本发明，酯化反应所用溶剂的实例包括但不限于卤代烃(如二氯甲烷、二氯乙烷和三氯甲烷等)，烃类(如正戊烷、苯和甲苯等)，腈类(如乙腈等)，及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。迈克尔加成反应可以选择或者不使用溶剂，其反应用溶剂的实例包括但不限于异丙醇、叔丁醇，四氢呋喃等。胺可以采用N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺。
根据本发明，所述制备方法中的原料可以商购也可以采用常规方法合成。
根据本发明所提供的新型可电离阳离子脂质分子结构中含有两个相邻的顺式双键，或双硫键(S-S)，支链结构或直链结构，使其在后续应用于递送***包裹活性物质(如mRNA)时，具有较高的包封率，较好的细胞转染率；此外，在制备脂质纳米颗粒时，尾链中的两个相邻顺式双键，双硫键(S-S)或支链结构的存在可以使得到的脂质纳米颗粒粒径更均匀。本发明的可电离脂质化合物尤其适合于制备实心结构的纳米颗粒。
本发明还提供了所述的新型可电离阳离子脂质化合物在制备生物活性物质递送***中的应用；优选的，所述递送***为微泡、微粒、纳米粒子、脂质体或脂质纳米颗粒。
在本发明的一些优选的实施方案，当所述新型可电离阳离子脂质化合物为式I化合物为其中，R3、R4、R5为/>R6为直链或支链C6-25烷基，直链或支链C6-25烯基，所述烷基、烯基的至少1个C原子任选被独立地选自O、S或N的杂原子所替换；优选的，X为O或N杂原子；进一步优选，n1为选自4～8的整数，m1为选自4～8的整数，R6为直链或支链C6-18烷基，直链或支链C6-18烯基，所述烷基、烯基的至少1个C原子任选被独立地选自S的杂原子所替换。优选的，X为O原子；进一步优选，n1为选自4～8的整数，m1为选自4～8的整数，R6为直链或支链C6-18烷基，直链或支链C6-18烯基，所述烷基、烯基的2个C原子任选被独立地选自S原子所替换。
本发明中，通过对化合物结构优化意外发现了所述新型可电离阳离子脂质化合物立体空间结构对于促进转染率的内在规律，最主要的是通过改变其疏水尾链的不饱和度，杂原子，支链结构或长度可以调节可电离阳离子脂质化合物的立体空间结构以促进其体内细胞转染率，并对应的使其脂质纳米颗粒具有特异性靶向肝脏，脾脏和/或肺部的功能作用。
在本发明的一个优选实施方式中，当所述新型可电离阳离子脂质化合物为式A、式B化合物，所述的新型可电离阳离子脂质化合物在制备特异性的靶向脾脏的生物活性物质递送***中的应用；当所述新型可电离阳离子脂质化合物为式C化合物，所述的新型可电离阳离子脂质化合物在制备特异性的靶向脾脏和肺部的生物活性物质递送***中的应用；当所述新型可电离阳离子脂质化合物为式D化合物，所述的新型可电离阳离子脂质化合物在制备特异性的靶向脾脏和肝脏的生物活性物质递送***中的应用。
根据本发明的优选实施方式，本发明采用优选的式A化合物，尤其是疏水尾链长度为18C并且含有相邻顺式双键结构，其相邻顺式双键的存在可以使得疏水尾链在C9位置开始弯折形成相对长度大约9C烷烃链长，三条疏水尾链的结构使式A化合物形成独特的三角锥型空间立体结构，能够更有利于可电离脂质化合物与mRNA的结合，并提高溶酶体逃逸率，如化合物N24-O18-2(3T)，相比较于N24-O18(3T)化合物，其递送mRNA的效果有大幅的提升并且其脂质纳米颗粒可以特异性靶向到脾脏。
进一步优选，本发明的一些具体实施例中，所述新型可电离阳离子脂质化合物优选为：
N24-O18-2(3T)
根据本发明的优选实施方式，本发明采用优选的式B化合物，当其疏水尾链长度在8-10C之间时，能够更有利于其脂质纳米颗粒对脾脏器官的靶向运输，如化合物N24-O10(3T)，相比较于N24-O18(3T)化合物，其能够大幅提升mRNA的转染效率，并且提高靶向脾脏的效果。
进一步优选，本发明的一些具体实施例中，所述新型可电离阳离子脂质化合物优选为：
N24-O6(3T)
N24-O8(3T)
N24-O10(3T)
N24-O12(3T)
N24-O14(3T)
N24-O16(3T)
N24-O18(3T)
进一步优选，本发明的一些具体实施例中，所述新型可电离阳离子脂质化合物进一步优选为：
N24-O10(3T)
根据本发明的优选实施方式，本发明采用优选的式C化合物，疏水尾链中杂原子S-S的引入可以使得疏水尾链在S-S位置发生弯折，此结构的特点使亲水头基形成的平面更加大，更容易增加对mRNA分子的负载。如化合物N24-O18-SS(3T)，相比较于N24-O18(3T)化合物，其能够大幅提升递送mRNA的效果，并且能有利于同时靶向递送到脾脏和肺部。N24-O18-SS(3T)-LNP的脂质纳米颗粒效果更佳。
进一步优选，本发明的一些具体实施例中，所述新型可电离阳离子脂质化合物：
N24-O6-SS(3T)
N24-O8-SS(3T)
N24-O10-SS(3T)
N24-O12-SS(3T)
N24-O14-SS(3T)
N24-O16-SS(3T)
N24-O18-SS(3T)
N24-O6-S(3T)
N24-O8-S(3T)
N24-O10-S(3T)
N24-O12-S(3T)
N24-O14-S(3T)
N24-O16-S(3T)
N24-O18-S(3T)
N24-O6-O(3T)
N24-O8-O(3T)
N24-O10-O(3T)
N24-O12-O(3T)
N24-O14-O(3T)
N24-O16-O(3T)
N24-O18-O(3T)
N24-O6-N(3T)
N24-O8-N(3T)
N24-O10-N(3T)
N24-O12-N(3T)
N24-O14-N(3T)
N24-O16-N(3T)
N24-O18-N(3T)
N24-O6-Se(3T)
N24-O8-Se(3T)
N24-O10-Se(3T)
N24-O12-Se(3T)
N24-O14-Se(3T)
N24-O16-Se(3T)
N24-O18-Se(3T)
根据本发明的优选实施方式，本发明采用优选的式D化合物，其疏水尾链中的支化结构使得分子的空间立体结构刚性增加，使得裸露在一端的亲水头基能更好地接触并负载mRNA。如化合物N24-O11B(3T)，相比较于N24-O18(3T)化合物，其能够大幅提升递送mRNA的效果，并且能有利于同时靶向递送到肝脏和脾脏。
进一步优选，本发明的一些具体实施例中，所述新型可电离阳离子脂质化合物优选为：
本发明中，可以发现，通过调节本发明化合物的疏水尾链，如不饱和度(疏水尾链长度为18C并且含有相邻三个，两个顺式双键或单个双键)、直链长短(疏水尾链长度为8C-18C的直链烷烃)，杂原子(-O-,-N-,-SS-,-S-,-Se-)和支化结构(其中一条链为C5-C18长度，另一条支链为C1-C14长度)，使其获得特定空间立体结构，能更有利的促进其递送mRNA的能力和特异靶向器官组织的能力。采用本发明上述具体实施例提供的新型化合物具有更好的核酸包封率及细胞或体内转染率，其脂质纳米颗粒具有更佳的特异性靶向肝脏，脾脏和/或肺部的功能作用。
本发明中，经研究进一步发现，当本发明化合物采用特定立体结构，在化合物不饱和度、杂原子、支化结构和直链长短的作用下，能更有利的促进其递送RNA的能力。
在本发明的一个优选实施方式中，所述递送***是脂质纳米颗粒。
在某些实施例中，胺的所有氨基都与疏水脂质尾链化合物完全反应形成叔胺。在其它实施例中，胺的所有氨基并不都与疏水脂质尾链化合物完全反应，由此在可电离阳离子脂质化合物中产生伯胺或仲胺。使这些伯胺或仲胺保持原样或可与诸如不同疏水脂质尾链化合物等另一亲电子试剂反应。由本领域技术可知，使过量的胺与疏水脂质尾链化合物反应将会产生多种具有各种尾部数目的不同的可电离脂质化合物。举例来说，二胺或多胺可在分子的各种氨基部分上包括一个、两个、三个或四个尾链化合物，从而产生伯胺、仲胺和叔胺。在某些实施例中，使用同一种相同的尾链化合物；或者使用两种同一类型的尾链化合物。在其它实施例中，使用两种或两种以上不同尾链化合物。
本发明还提供了含有所述的新型可电离阳离子脂质化合物的生物活性物质递送***，优选的，所述递送***为微泡、微粒、纳米粒子、脂质体或脂质纳米颗粒。
在本发明的一个实施方式中，所述递送***是脂质纳米颗粒。此类脂质纳米颗粒可以将生物活性物质(例如，mRNA)高效递送到细胞、组织或器官中，实现生物活性物质的高效调控。在本发明中，所述新型可电离阳离子脂质化合物与靶向细胞或器官传递的生物活性物质(例如，mRNA)或进一步包含其他的物质(例如，其它的阴离子、阳离子或可电离脂质化合物、合成或天然的聚合物、蛋白质、磷脂、胆固醇、碳水化合物、表面活性剂等)一同，组合形成微泡、微粒、纳米粒子、脂质体或脂质纳米颗粒。而所述的生物活性物质可呈气体、液体或固体形式，可为核苷酸、小分子化合物、多肽或蛋白质。在本发明中，所述递送***可接着任选地与医药赋形剂组合形成医药组合物。
本发明还提供一种药物组合物，含有所述的生物活性物质递送***。
另一方面，本发明还提供了一种脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物中含有脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒中包含所述的新型可电离阳离子脂质化合物。
根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物，进一步包含其他脂质分子。所述其他脂质分子可以是本领域中用于构建脂质纳米颗粒已知或常规使用的脂质分子，包括但不限于中性脂质分子、类脂质分子、胆固醇、PEG化的脂质分子。
根据本发明，所述脂质纳米颗粒组合物在用于药物递送***时，可囊封药剂，包括核苷酸、小分子化合物、多肽、蛋白质或金属等。
所述核酸包括但不限于DNA、反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、内源性microRNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA适配体(RNAaptamer)、小激活RNA(saRNA)等。所述新型可电离阳离子脂质化合物具有适合于制备药物递送***的若干性质：1)中和带负电活性物质上的电荷的能力；2)脂质复合和保护不稳定药剂的能力；3)缓冲体内pH值的能力；4)充当“质子海绵”和引起体内溶解的能力。
根据本发明的一些优选实施方式，所述脂质纳米颗粒组合物中，所述脂质纳米颗粒中含有：占总体脂质分子20-60mol％的式I的新型可电离阳离子脂质化合物，5-30mol％的中性脂质分子，30-60mol％的胆固醇类脂质分子，0.5-5mol％的PEG化的脂质分子；优选含有20-50mol％的可电离阳离子脂质分子，5-20mol％中性脂质分子，30-50mol％的胆固醇类脂质分子，0.5-2.5mol％的PEG化的脂质分子；更优选含有35-48mol％的式I的可电离阳离子脂质分子，10-15mol％中性脂质分子，35-50mol％的胆固醇类脂质分子，1.0-2.0mol％的PEG化的脂质分子。
根据本发明的一些优选实施方式，式I的可电离脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为20-60mol％。
根据本发明的一些优选实施方式，所述中性脂质分子是不带电脂质分子或两性离子型脂质分子，例如磷脂酰胆碱类化合物，或/和磷脂酰乙醇胺类化合物。
根据本发明的一些优选实施方式，所述中性脂质分子选自磷脂酰胆碱类化合物和/或磷脂酰乙醇胺类化合物。
根据本发明的一些优选实施方式，中性脂质分子的实例包括但不限于二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、溶血磷脂酰胆碱以及它们的组合。
在一个实施方案中，中性脂质分子可选自由以下组成的组：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)。
根据本发明，中性脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为5-30mol％。
根据本发明，胆固醇类脂质分子包括类固醇和固醇等，实例包括但不限于胆固醇和胆固醇半琥珀酸酯。
根据本发明的一些优选实施方式，所述胆固醇类脂质分子选自胆固醇和胆固醇半琥珀酸酯中的一种或多种。
在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇(CHOL)。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇半琥珀酸酯。
根据本发明，胆固醇类脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-60mol％。
根据本发明的一些优选实施方式，所述PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分，表示为脂质部分-PEG的数均分子量，所述脂质部分包括二酰基甘油和/或二酰基甘油酰胺，优选选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺中的一种或多种；所述PEG的数均分子量为100～50,000，优选为200～10,000，进一步优选为500～3,000，最优选为1,500～2,500。
根据本发明，PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分。在一些实施方案中，脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺(diacylglycamide)、包括包含具有独立地包含约C4至约C30饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些，其中该链可包含一个或多个官能团，诸如酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团可还包含一个或多个取代的烷基。链长可为对称或不对称的。在一个实施方案中，PEG部分包括PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992))；或者，PEG部分不包括PEG共聚物，例如其可为PEG单聚物。在一个实施方案中，PEG的分子量为约100至约50,000。在某些实施方案中，PEG为“PEG 2000”，其平均分子量为约2,000道尔顿。
在本发明的一些实施方式中，PEG在本发明中由下式表示，对于PEG-2000其中n为45，意指数均聚合度包含约45个亚单位；也可使用本领域中已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数均聚合度包含约23个亚单位(n＝23)和/或68个亚单位(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可在约30至约60的范围内。在一些实施方案中，n可在约35至约55的范围内。在一些实施方案中，n可在约40至约50的范围内。在一些实施方案中，n可在约42至约48的范围内。在一些实施方案中，n可为45。在一些实施方案中，R可选自H、取代的烷基和未取代的烷基。在一些实施方案中，R可为未取代的C1-C30的烷基，例如C1-C20的烷基，C1-C10的烷基，C1-C6的烷基。在一些实施方案中，R可为H，甲基或乙基。
在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”或者“PEG-数均分子量-脂质部分”或者，“PEG-脂质部分”。所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为约100至约50,000。
在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8′-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3′,6′-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMG-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(DMA-PEG2000)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSA-PEG2000)。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DMG-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为C-DMA-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSA-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C11。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSG-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DSPE-PEG2000。在一个实施方案中，PEG化的脂质分子可为DMA-PEG2000。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C14。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C16。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可为PEG2000-C18。
根据本发明，PEG化的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为0.5-5mol％。
在本发明的一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒中含有式D所示的可电离阳离子脂质分子，中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子，其中：
其中每条支链上的n5各自独立的选自1～18的整数优选4～18的整数，m5各自独立的选自1～18的整数优选1～14的整数；优选的，每个n5都选自4～18的整数，每个m5都选自1～14的整数；式D所示的可电离阳离子脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质摩尔百分比为20-60mol％，优选为35-50mol％；
中性脂质分子选自磷脂酰胆碱类化合物，磷脂酰乙醇胺类化合物；中性脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为5-30mol％，优选为5-20mol％，更优选为10-15mol％；
胆固醇类脂质分子选自胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯；胆固醇类脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为30-60mol％，优选为30-50mol％，更优选为35-48mol％；
PEG化的脂质分子表示“脂质部分-PEG-数均分子量”，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为约100至约50,000。PEG化的脂质分子占脂质纳米颗粒中脂质的摩尔百分比为0.5-5mol％，优选为0.5-2.5mol％，更优选为1.0-2.0mol％。
在本发明的一些实施方式中，式D所示的可电离阳离子脂质分子、中性脂质分子、胆固醇和PEG化的脂质分子摩尔比为35:15:48.5:1.5。
在本发明的一些实施方式中，式D所示的可电离阳离子脂质分子、中性脂质分子、胆固醇和PEG化的脂质分子摩尔比为45:15:38.5:1.5。
在本发明的一些实施方式中，式D所示的可电离阳离子脂质分子、中性脂质分子、胆固醇和PEG化的脂质分子摩尔比为40:10:48.5:1.5。
在本发明的一个实施方式中，式D可电离阳离子脂质分子为化合物N24-O11B(3T)。
在本发明的一个实施方式中，所述中性脂质分子是DSPC，所述PEG化的脂质分子是DMG-PEG2000。或，所述中性脂质分子是DOPE，所述PEG化的脂质分子是DMG-PEG2000。或，所述中性脂质分子是DSPC，所述PEG化的脂质分子是DSPE-PEG2000。或，所述中性脂质分子是DOPE，所述PEG化的脂质分子是DSPE-PEG2000。
本发明提供的具有相邻顺式双键结构，或双硫键(S-S)，或支链结构的三条疏水尾链可电离脂质化合物，可以提供更高的活性物质包封率，更好的细胞或体内转染率，尤其适合于制备实心结构的纳米颗粒，并且在脂质纳米颗粒组合物中，脂质纳米颗粒中的式I的可电离阳离子脂质分子，中性脂质分子，胆固醇类脂质分子，和PEG化的脂质分子占总体脂质分子摩尔％比进行了最优选，最主要的是上述脂质纳米颗粒具有更佳的特异性靶向脾脏和/或肺部的功能作用。
本发明还提供制备脂质纳米颗粒组合物的方法，包括：将上述各脂质分子按摩尔比用有机溶剂溶解制成混合脂质的溶液，以混合脂质的溶液为有机相，以被递送物(例如，mRNA)的水溶液为水相，混合有机相和水相，制备脂质纳米颗粒。可以采用包括但不限于喷雾干燥、溶剂萃取、相分离、纳米沉淀、单一和双重乳液溶剂蒸发、微流控、简单和复杂凝聚以及所属领域的普通技术人员熟知的其它方法来制备脂质纳米颗粒。
在一些实施方式中，所述有机溶剂是醇，例如乙醇。
在一些实施方式中，所述有机相和水相的体积比为(2～5):1，例如3:1。
在一些实施方案中，采用微流控平台制备纳米颗粒。
根据本发明，所述制备方法还进一步包括，分离和纯化得到所述脂质纳米颗粒的步骤。
根据本发明，所述制备方法还进一步包括，冻干所述脂质纳米颗粒的步骤。
本发明中脂质纳米颗粒的粒径范围在1nm到1000nm范围。
由本发明的新型可电离阳离子脂质化合物形成的递送***还可修饰上靶向分子，使其成为靶向剂而能靶向特定细胞、组织或器官。靶向分子可包括在整个递送***中或可仅位于其表面上。靶向分子可为小分子、核酸、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂质等，其实例包括(但不限于)抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(LDL)、唾液酸、适体、转铁蛋白(transferrin)、脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)、受体配体等。
通过本发明的可电离脂质化合物形成的递送***传递的活性物质可为治疗剂、诊断剂或预防剂。活性物质的性质可为小分子化合物、经同位素标记的化合物、核酸、多肽、蛋白质、疫苗、金属等。
由本发明的新型可电离阳离子脂质化合物形成的递送***可与一种或一种以上医药赋形剂组合形成适合于投予动物(包括人类)的医药组合物。术语“医药赋形剂”的意思是任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂等，包括但不限于纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠和乙酸纤维素；糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；明胶；滑石；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；油，诸如花生油、棉籽油、玉米油和大豆油；表面活性剂，诸如吐温80(Tween80)；着色剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂；缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲液等。
本发明提供的核酸药物递送***，可以高效特异性地将核酸药物分子递送至脾脏和/或肺脏中并有效翻译成目标分子，同时降低脂质体在肝脏累积副作用，对核酸药物的靶向给药及其发展和应用具有重要意义。
本发明中的术语说明：“约”：与数值结合使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉和可接受的准确度区间。通常，这种精确度的区间为±10％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中化合物丙烯酸-1-乙基壬基酯(a2)的氢谱图；
图2为本发明实施例中化合物N24-O11B(3T)的氢谱图；
图3为本发明实施例中化合物N24-O11B(3T)的质谱图；
图4为本发明实施例中化合物N24-O11B(4T)的氢谱图；
图5为本发明实施例中化合物N24-O11B(4T)的质谱图；
图6为本发明实施例中化合物N24-O11B(3T)(A)，N24-O11B(4T)(B)的解离常数(pKa)图；
图7为本发明实施例中N24-O11B(3T)，N24-O11B(4T)制备的LNP包封LuciferasemRNA(LucRNA)转染293T细胞24h后Luciferase蛋白表达量图；
图8为本发明实施例中N24-O11B(3T)，ALC-0315制备的LNP包封Luciferase mRNA(LucRNA)转染293T细胞24h后Luciferase蛋白表达量图；
图9为本发明实施例中小鼠通过静脉注射N24-O18-2(3T)/LucRNA，N24-O10(3T)/LucRNA，N24-O18-SS(3T)/LucRNA和N24-O11B(3T)/LucRNA 6h后各器官的荧光表达情况；
图10为本发明实施例中化合物N24-O10(3T)的氢谱图；
图11为本发明实施例中化合物N24-O10(3T)的质谱图；
图12为本发明实施例中化合物N24-O18-2(3T)的质谱图；
图13为本发明实施例中化合物N24-O18-2(3T)的氢谱图；
图14为本发明实施例中化合物N24-O18-SS(3T)的氢谱图；
图15为本发明实施例中化合物N24-O18-SS(3T)的质谱图；
图16为本发明实施例中N24-O18(3T)，N24-O16(3T),N24-O14(3T),N24-O12(3T),N24-O10(3T),N24-O8(3T),N24-O6(3T)制备的LNP包封Luciferase mRNA(LucRNA)转染293T细胞24h后Luciferase蛋白表达量图；
图17为本发明实施例中N24-O10(3T),N24-O18-2(3T),N24-O18-SS(3T),N24-O11B(3T)制备的LNP包封Luciferase mRNA(LucRNA)转染293T细胞24h后Luciferase蛋白表达量图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1可电离阳离子脂质，N24-O11B(3T)的合成
丙烯酸-1-乙基壬基酯(a2)的合成：在0℃下向30.0mL二氯甲烷中加入3-十一醇(3.0g)、三乙胺(5.28g)，随后将含有丙烯酰氯(2.36g)的二氯甲烷(10.0mL)溶液滴加到反应体系中，反应液在20℃下搅拌2h。反应液中析出的三乙胺盐用布氏漏斗过滤，收集滤液，依次用水、质量分数5％的盐酸、水洗涤滤液，无水硫酸钠干燥有机相。蒸发至干燥，然后通过快速过柱法用石油醚/乙酸乙酯洗脱来纯化残余物，得到目标产物丙烯酸-1-乙基壬基酯(a2)(2.8g)，收率70％，化合物a2的氢谱见图1。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.39(dd,J＝17.3,1.5Hz,1H),6.12(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),5.80(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H),4.94–4.84(m,1H),1.69–1.48(m,4H),1.26(s,12H),0.88(q,J＝7.2Hz,6H).
N24-O11B(3T)，N24-O11B(4T)(用于对比)的合成：在室温下，向250mg N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺溶液中加入丙烯酸-1-乙基壬基酯(1.7g)，之后混合物加热到120℃并持续搅拌24h。当薄层层析板检测反应结束，得到粗产物2.0g，然后通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇洗脱来纯化目标产物，得到N24-O11B(3T)276mg，N24-O11B(4T)195mg，化合物N24-O11B(3T)的氢谱见图2，质谱见图3，化合物N24-O11B(4T)的氢谱见图4，质谱见图5。
N24-O11B(3T)：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.90–4.72(m,3H),2.92(t,J＝6.7Hz,2H),2.80(t,J＝7.3Hz,4H),2.71(t,J＝5.9Hz,2H),2.61–2.49(m,6H),2.45(dd,J＝16.1,8.6Hz,6H),2.23(s,3H),1.55(ddd,J＝14.2,9.7,5.1Hz,12H),1.26(s,36H),0.95–0.82(m,18H).
MALDI-TOF MS：m/z 796.753[M+H]+.
N24-O11B(4T)：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.81(p,J＝6.3Hz,4H),2.81(dd,J＝17.9,10.6Hz,8H),2.56(s,4H),2.41(dd,J＝32.9,25.7Hz,12H),2.24(s,2H),1.63–1.46(m,16H),1.28(d,J＝14.6Hz,48H),0.91–0.84(m,24H).
MALDI-TOF MS：m/z 1022.924[M+H]+.
实施例2可电离阳离子脂质N24-O11B(3T)的解离常数(pKa)
可电离脂质有两个主要作用：结合核酸和允许核酸分子在细胞中释放。脂质的pKa是一个重要因素，因为脂质需要在低pH值下带正电荷才能与核酸结合，但在中性pH值下不带电荷，因此LNP不会引起毒性。如图6，通过TNS染料结合试验测定可电离脂质N24-O11B(3T)的pKa在6.68(A)，N24-O11B(3T)的pKa在5.93(B)。可见两个分子都符合可以在酸性条件下带正电和RNA搭载，在中性pH值下不带电荷(pH＝7.4)。
实施例3N24-O11B(3T)包裹mRNA制备脂质纳米颗粒
可电离阳离子脂质N24-O11B(3T)或N24-O11B(4T)、DOPE、Cholesterol和DMG-PEG2000分别按照摩尔比45％:15％:38.5％:1.5％配置乙醇溶液作为有机相，把Luciferase mRNA(LucRNA)溶于pH＝4的水溶液作为水相。按照水相和有机相的体积比为3:1，在纳米药物制造仪(迈安纳)上用微流控技术制备得到纳米颗粒混悬液。制备完后再超滤浓缩得到最终的LucRNA-LNP脂质纳米颗粒，保存于2-8℃备用。
使用ZetasizerPro纳米粒度电位仪(马尔文帕纳科)进行LucRNA-LNP粒径和Zeta电位的表征。用F-280荧光分光光度计(天津港东)Ribogreen的方法来检测LucRNA-LNP的包封率。实施例3的检测结果如表1所示。
表1脂质纳米颗粒理化质控数据
从实施例3的结果可以看出，由新型脂质化合物N24-O11B(3T)制备的脂质纳米颗粒LucRNA-LNP粒径在140nm左右，LucRNA-LNP粒径分布较窄(PDI较小)，包封率高达96.68％。
此外，用多功能酶标仪(BioTek,型号为SLXFATS)荧光素报告基因法来检测制备的LucRNA-LNP细胞的转染效率。体外转录LucRNA的方法如下：293T细胞铺板，细胞密度为1×104个细胞/well，当细胞融合度为30％-50％进行转染。使用转染试剂Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)转染1.0μg LucRNA，按照转染试剂产品说明书进行转染操作。转染24h后使用多功能酶标仪检测蛋白表达量。阴性对照为不添加LucRNA-LNP的细胞培养基。体外细胞转染效率如图7所示，表明由可电离脂质N24-O11B(3T)制备的LNP包裹mRNA具有非常高的细胞转染效率，相比较与传统常用的含有四条疏水尾链的可电离脂质N24-O11B(4T)，其制备的LNP包裹mRNA的细胞转染效率要低很多，大约有数量级的转染效率下降。可见相比较与传统常用的含有四条疏水尾链的可电离脂质N24-O11B(4T)，含有三条疏水尾链的可电离脂质N24-O11B(3T)具有更高的细胞转染效率，优势非常明显。此类三条疏水尾链脂质化合物相比较于传统常用的含有四条疏水尾链的脂质化合物拥有更高的细胞转染效率的现象同时适用于本发明中通式结构的其他脂质化合物。
从实施例3的结果也可以看出，由新型脂质化合物N24-O11B(3T)制备的脂质纳米颗粒LucRNA-LNP的理化特征较好，且体外细胞转染效率比商用Lipofectamine 2000(Lipo2000)高约2-3倍。
对比例1(商业化可电离阳离子脂质分子ALC-0315)
ALC-0315的分子式为：((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)。购买于艾伟拓(上海)医药科技有限公司。
ALC-0315的结构式为：
实施例4N24-O11B(3T)
本实施例提供N24-O11B(3T)和商业化可电离阳离子脂质分子ALC-0315的效果对比
按照实施例3所述的方法，分别使用N24-O11B(3T)和ALC-0315制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：N24-O11B(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；ALC-0315:DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表(表2)所示：
表2脂质纳米颗粒理化质控数据
由上表可见，N24-O11B(3T)制备的脂质纳米颗粒包封率高达96％，相比较类似于ALC-0315的脂质纳米颗粒。
采用实施例3相同的转染方式，将制备的脂质纳米颗粒转染细胞，了解蛋白的表达情况，结果如图8所示，N24-O11B(3T)制备的脂质纳米颗粒携带mRNA转染细胞之后，细胞中蛋白表达量要高于Lipofectamine 2000的，并且其对应mRNA浓度转染的细胞中蛋白表达量也高于ALC-0315，说明N24-O11B(3T)制成的脂质纳米颗粒的细胞转染效率很高。
实施例5N24-O18-2(3T)-LNP，N24-O10(3T)-LNP，N24-O18-SS(3T)-LNP，N24-O11B(3T)-LNP脂质纳米颗粒在动物体内的转染实验
采用纳米脂质颗粒小鼠尾静脉注射的方式，按照实施例3所述的方法，使用N24-O18-2(3T)，N24-O10(3T)，N24-O18-SS(3T)或N24-O11B(3T)-LNP制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：N24-O18-2(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1,N24-O10(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1，N24-O18-SS(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1，N24-O11B(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1。其中mRNA为表达Luciferase荧光蛋白的mRNA，mRNA的用量为10μg，N24-O18-2(3T)，N24-O10(3T)，N24-O18-SS(3T)，或N24-O11B(3T)-LNP、DOPE、Cholesterol、DMG-PEG2000的总量为100μg，采用200μL的中性PBS缓冲溶液快速转换脂质体环境，并迅速通过尾静脉注射到6-8周雌性C57小鼠，控制静脉注射10μg mRNA。
小鼠通过尾静脉注射N24-O18-2(3T)-LNP，PBS(空白对照)，6h后各器官的荧光表达情况见图9。结果显示，在静脉注射(IV)N24-O18-2(3T)-LNP的脂质纳米颗粒后，小鼠各器官中的荧光表达量主要分布在脾脏约95％，肝脏5％，心脏0％，肺部0％，肾脏0％，可见其可以特异性的靶向脾脏。小鼠通过尾静脉注射N24-O10(3T)-LNP，PBS(空白对照)，6h后各器官的荧光表达情况见图9。结果显示，在静脉注射(IV)N24-O10(3T)-LNP的脂质纳米颗粒后，小鼠各器官中的荧光表达量主要分布在脾脏约100％，心脏0％，肝脏0％，肺部0％，肾脏0％，可见其可以特异性的靶向脾脏。小鼠通过尾静脉注射N24-O18-SS(3T)-LNP，PBS(空白对照)，6h后各器官的荧光表达情况见图9。结果显示，在静脉注射(IV)N24-O18-SS(3T)-LNP的脂质纳米颗粒后，小鼠各器官中的荧光表达量主要分布在脾脏约60％，肝脏0％，肺部40％，心脏0％，肾脏0％，可见其可以特异性的靶向脾脏和肺部。小鼠通过尾静脉注射N24-O11B(3T)-LNP，PBS(空白对照)，6h后各器官的荧光表达情况见图9。结果显示，在静脉注射(IV)N24-O11B(3T)-LNP的脂质纳米颗粒后，小鼠各器官中的荧光表达量主要分布在脾脏约50％，肝脏50％，心脏0％，肺部0％，肾脏0％，可见其可以特异性的靶向脾脏和肝脏。可见，本发明基于三条脂质疏水尾链形成异构的化合物，进一步通过调节脂质X基团或疏水尾链(包括，不饱和度，杂原子，支链结构和/烷基链长度)更好地实现了不同器官的特异性靶向。
实施例6N24-O10(3T)
采用同实施例1相同的合成和纯化方法，区别之处在于将实施例1中的化合物3-十一醇改为正癸醇，其结构如下：
本实施例还提供该化合物的制备方法：
N24-O10(3T)的合成：在室温下，向250mg N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺溶液中加入丙烯酸癸基酯(1.6g)，之后混合物加热到120℃并持续搅拌24h。当薄层层析板检测反应结束，得到粗产物1.9g，然后通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇洗脱来纯化目标产物，得到N24-O10(3T)300mg。化合物N24-O11B(3T)的氢谱见图10，质谱见图11。
N24-O10(3T)：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.06(dt,J＝13.9,6.9Hz,6H),2.93(t,J＝6.6Hz,2H),2.79(t,J＝7.2Hz,4H),2.73(t,J＝5.6Hz,2H),2.60–2.49(m,6H),2.45(dd,J＝15.6,8.3Hz,6H),2.24(s,3H),1.61(dd,J＝13.2,6.5Hz,6H),1.28(d,J＝15.3Hz,42H),0.88(t,J＝6.7Hz,9H).
MALDI-TOF MS：m/z 754.319[M+H]+.
本实施例还提供了该化合物N24-O11B(3T)的解离常数(pKa＝7.09)以及包载LucRNA脂质纳米颗粒N24-O10(3T)-LNP(N24-O10(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1)的制备。通过对N24-O10(3T)-LNP脂质纳米颗粒在动物体内的转染实验来研究其在体内的分布情况，可见N24-O10(3T)-LNP主要特异性靶向脾脏，如图9，本实施例的N24-O10(3T)脂质化合物与实施例N24-O11B(3T)化合物相比，通过调节疏水尾链中支链结构为直链结构并保持长短为10个碳原子长度，能够实现脂质纳米颗粒特异性靶向由脾脏和肝脏转化为单独脾脏部位。
实施例7N24-O18-2(3T)
采用同实施例1相同的合成和纯化方法，区别之处在于将实施例1中的化合物3-十一醇改为(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-醇(亚油醇)，其结构如下：
本实施例还提供该化合物的制备方法：
N24-O18-2(3T)的合成：在室温下，向300mg N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺溶液中加入(9Z,12Z)-9,12-二烯十八烷丙烯酸酯(2.9g)，之后混合物加热到120℃并持续搅拌24h。当薄层层析板检测反应结束，得到粗产物3.2g，然后通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇洗脱来纯化目标产物，得到N24-O18-2(3T)480mg。化合物N24-O18-2(3T)的氢谱见图12，质谱见图13。
N24-O18-2(3T)：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.25(m,12H),4.06(dd,J＝14.8,7.4Hz,6H),2.93(t,J＝6.5Hz,2H),2.83–2.68(m,12H),2.55(dd,J＝14.7,6.7Hz,6H),2.45(dd,J＝15.6,8.3Hz,6H),2.24(s,3H),2.13–1.98(m,12H),1.67–1.56(m,6H),1.42–1.23(m,48H),0.89(t,J＝6.7Hz,9H).
MALDI-TOF MS：m/z 1079.008[M+H]+.
本实施例还提供了该化合物N24-O18-2(3T)的解离常数(pKa＝6.70)以及包载LucRNA脂质纳米颗粒N24-O18-2(3T)-LNP(N24-O18-2(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1)的制备。通过对N24-O18-2(3T)-LNP脂质纳米颗粒在动物体内的转染实验来研究其在体内的分布情况，可见N24-O18-2(3T)-LNP可以特异性靶向脾脏，如图9所示，本实施例的N24-O18-2(3T)脂质化合物与实施例N24-O11B(3T)化合物相比，通过调节疏水尾链中支化链结构为含有不饱和度的直链结构，如在C9-C13之间加入相邻顺式双键，由于其相邻顺式双键的存在可以使得疏水尾链在C9位置开始弯折形成相对长度大约9C烷烃链长，三条疏水尾链的结构使N24-O18-2(3T)化合物形成独特的三角锥型空间立体结构，能够更有利于可电离脂质化合物与mRNA的结合，并提高溶酶体逃逸率，其递送mRNA的效果有大幅的提升并且其脂质纳米颗粒特异性靶向由脾脏和肝脏转化为单独脾脏部位。
实施例8N24-O18-SS(3T)
采用同实施例1相同的合成和纯化方法，区别之处在于将实施例1中的化合物3-十一醇改为2-(十六烷基二硫)乙醇，其结构如下：
本实施例还提供该化合物的制备方法：
N24-O18-2(3T)的合成：在室温下，向300mg N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺溶液中加入丙烯酸2-(十六烷基二硫)乙基酯(3.2g)，之后混合物加热到120℃并持续搅拌24h。当薄层层析板检测反应结束，得到粗产物3.5g，然后通过快速过柱法用二氯甲烷/甲醇洗脱来纯化目标产物，得到N24-O18-2(3T)525mg。化合物N24-O18-SS(3T)的氢谱见图14，质谱见图15。
N24-O18-SS(3T)：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.36(ddd,J＝14.7,13.4,7.2Hz,6H),2.98(t,J＝6.4Hz,2H),2.89(dd,J＝12.3,5.6Hz,6H),2.81(dd,J＝12.7,5.8Hz,6H),2.69(dd,J＝16.4,9.0Hz,8H),2.57(d,J＝6.7Hz,4H),2.48(dd,J＝14.0,7.1Hz,6H),2.27(s,3H),1.74–1.61(m,6H),1.37(dd,J＝14.1,7.1Hz,6H),1.28(d,J＝16.6Hz,60H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H).
MALDI-TOF MS：m/z 1198.799[M+H]+.
本实施例还提供了该化合物N24-O18-SS(3T)的解离常数(pKa＝7.21)以及包载LucRNA脂质纳米颗粒N24-O18-SS(3T)-LNP(N24-O18-SS(3T):DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；N/P比为10:1)的制备。通过对N24-O18-SS(3T)-LNP脂质纳米颗粒在动物体内的转染实验来研究其在体内的分布情况，可见N24-O18-SS(3T)-LNP可以特异性靶向脾脏和肺部，如图9所示，本实施例的N24-O18-SS(3T)脂质化合物与实施例N24-O11B(3T)化合物相比，通过调节疏水尾链中支化链结构为含有S杂原子的直链结构，如在C3，C4两个C-C位置替换成S-S，疏水尾链中杂原子S-S的引入可以使得疏水尾链在S-S位置发生弯折，此结构的特点使亲水头基形成的平面更加大，更容易增加对mRNA分子的负载。其递送mRNA的效果有大幅的提升并且其脂质纳米颗粒特异性靶向由脾脏和肝脏转化为脾脏和肺部。
对比例2脂质化合物疏水尾链长度对脂质纳米颗粒细胞转染的影响
本发明设计合成了一系列不同疏水尾链长度的脂质化合物，按照实施例3所述的方法，分别使用N24-O18(3T)，N24-O16(3T)，N24-O14(3T)，N24-O12(3T)，N24-O10(3T)，N24-O8(3T)，N24-O6(3T)制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：脂质化合物:DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表(表3)所示：
表3脂质纳米颗粒理化质控数据
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采用实施例3相同的转染方式，将制备的脂质纳米颗粒转染细胞，分析蛋白的表达情况，结果如图16所示，随着疏水尾链的碳数的减少，其对应的脂质化合物制备的脂质纳米颗粒的细胞转染效率有增加然后减小的趋势，在尾链长为C10时，N24-O10(3T)-LNP具有最高的转染效率，并且能够实现脂质纳米颗粒特异性靶向脾脏部位。
对比例3脂质化合物疏水尾链空间结构对脂质纳米颗粒细胞转染和器官/组织靶向性的影响
主要是通过改变其疏水尾链的不饱和度，杂原子，或支链结构来调节可电离阳离子脂质化合物空间结构，使得其能更好的负载mRNA，并使其脂质纳米颗粒具有特异性靶向肝脏，脾脏和/或肺部的功能作用。
本发明设计合成了一系列不同疏水尾链空间结构的脂质化合物，按照实施例3所述的方法，分别使用N24-O18-2(3T)，N24-O18-SS(3T)，N24-O11B(3T)制备脂质纳米颗粒，具体摩尔配比为：脂质化合物:DOPE:Cholesterol:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表(表4)所示：
表4脂质纳米颗粒理化质控数据
采用实施例3相同的转染方式，将制备的脂质纳米颗粒转染细胞，分析蛋白的表达情况，结果如图17所示，相比较于实例N24-O10(3T)-LNP，脂质化合物疏水尾链中的不饱和度，杂原子，或支链结构的引入可以增加其对应脂质纳米颗粒转染细胞的效率，这种结果可能是脂质化合物疏水尾链中的不饱和度，杂原子，或支链结构引入后使得可电离阳离子脂质化合物拥有特定的空间结构，增加了负载mRNA的量，以及增加了其溶酶体逃逸率，最终提高了细胞转染的效率。本发明提供的新型可电离阳离子脂质化合物能很好的负载mRNA，尤其能够更好实现脂质纳米颗粒特异性靶向特定器官。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种新型可电离阳离子脂质化合物，其特征在于，具有式I所示结构：
其中，n为2～4的整数；R1为-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH3，-CH2OH，-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CH2CH2CH2OH，-CH2CH2NHCOCH3；R2为-H；R3、R4、R5为X为O，S或N杂原子，n1选自1～10的整数，m1选自1～10的整数；R6为包含或不含杂原子的C6-25烷基、烯基或炔基。
2.根据权利要求1所述的新型可电离阳离子脂质化合物，其特征在于，n为2，R1为-CH3，R2为-H；
优选的，式I化合物为其中，R3、R4、R5为X为O，N或S杂原子，n1选自1～10的整数，m1选自1～10的整数，n1和m1彼此独立，可以相同也可以不同；R6为直链或支链C6-25烷基，直链或支链C6-25烯基，直链或支链C6-25炔基，所述烷基、烯基或炔基的至少1个C原子任选被独立地选自O、N、S、S-S或Se的杂原子所替换。
3.根据权利要求1或2所述的新型可电离阳离子脂质化合物，其特征在于，n为2，R1为-CH3，R2为-H；优选的，所述式I化合物为其中，R3、R4、R5为/>R6为直链或支链C6-25烷基，直链或支链C6-25烯基，所述烷基、烯基的至少1个C原子任选被独立地选自O、S或N的杂原子所替换；优选的，X为O或N杂原子；进一步优选，n1为选自4～8的整数，m1为选自4～8的整数，R6为直链或支链C6-18烷基，直链或支链C6-18烯基，所述烷基、烯基的至少1个C原子任选被独立地选自S或S-S的杂原子所替换。
4.根据权利要求1-3任一项所述的新型可电离阳离子脂质化合物，其特征在于，所述新型可电离阳离子脂质化合物选自式A化合物或式B化合物或式C化合物或式D化合物：
其中每条支链上的n2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的整数，m2各自独立的选自1～8的整数优选4～8的整数，每个Y各自独立的选自0～3的整数；优选的，每个n2都选自4～8的整数，每个m2都选自4～8的整数，每个Y各自独立的选自0～2的整数；
其中每条支链上的n3各自独立的选自1～18的整数优选6～18的整数；优选的，每个n3都选自6～18的整数；
其中每条支链上的n4各自独立的选自1～18的整数优选2～18的整数；优选的，每个n4都选自2～18的整数；
其中每条支链上的n5各自独立的选自1～18的整数优选4～18的整数，m5各自独立的选自1～18的整数优选1～14的整数；优选的，每个n5都选自4～18的整数，每个m5都选自1～14的整数。
5.权利要求1-4任一项所述新型可电离阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物A1的羟基酯化成酯基以获得化合物A2；
2)迈克尔加成：使化合物A2与胺通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物；或者：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物B1的羟基酯化成酯基以获得化合物B2；
2)迈克尔加成：使化合物B2与胺通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物；或者：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物C1的羟基酯化成酯基以获得化合物C2；
2)迈克尔加成：使化合物C2与胺通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物；或者：
1)酯化：在丙烯酰氯的存在下，将化合物D1的羟基酯化成酯基以获得化合物D2；
2)迈克尔加成：使化合物D2与胺通过迈克尔加成反应，得到所述新型可电离阳离子脂质化合物。
6.权利要求1-4任一项所述的新型可电离阳离子脂质化合物在制备生物活性物质递送***中的应用；优选的，所述递送***为微泡、微粒、纳米粒子、脂质体或脂质纳米颗粒。
7.一种生物活性物质递送***，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述的新型可电离阳离子脂质化合物；优选的，所述递送***为微粒、纳米粒子、脂质体、脂质纳米颗粒或微泡。
8.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求7所述的生物活性物质递送***。
9.一种脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述脂质纳米颗粒组合物中含有脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒中含有权利要求1-4任一项所述的新型可电离阳离子脂质化合物；优选的，所述脂质纳米颗粒组合物中，所述脂质纳米颗粒中含有：占总体脂质分子20-60mol％的式I的新型可电离阳离子脂质化合物，5-30mol％的中性脂质分子，30-60mol％的胆固醇类脂质分子，0.5-5mol％的PEG化的脂质分子；
优选含有20-50mol％的可电离阳离子脂质分子，5-20mol％中性脂质分子，30-50mol％的胆固醇类脂质分子，0.5-2.5mol％的PEG化的脂质分子；
更优选含有35-48mol％的式I的可电离阳离子脂质分子，10-15mol％中性脂质分子，35-50mol％的胆固醇类脂质分子，1.0-2.0mol％的PEG化的脂质分子。
10.根据权利要求9所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述中性脂质分子选自磷脂酰胆碱类化合物和/或磷脂酰乙醇胺类化合物；和/或，
所述胆固醇类脂质分子选自胆固醇和胆固醇半琥珀酸酯中的一种或多种；和/或，
所述PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分，表示为脂质部分-PEG的数均分子量，所述脂质部分包括二酰基甘油和/或二酰基甘油酰胺，优选选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺中的一种或多种；所述PEG的数均分子量为100～50,000，优选为200～10,000，进一步优选为500～3,000，最优选为1,500～2,500。
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