CN117487747B - 一种培养基及其在诱导干细胞分泌胰岛素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域，本发明具体公开了一种培养基及其在诱导干细胞分泌胰岛素中的应用，所述的培养基，包括以下质量百分比的组分：0.05~0.2%成纤维细胞生长因子、0.1~0.3%胰岛素‑转铁蛋白‑硒、0.1~0.4%激活素A、0.2~0.6%烟酰胺、0.4~1%白藜芦醇、0.5~1.2%β‑巯基乙醇、0.5~1.2%槐花提取物、0.6~1.5%改性石墨烯、0.8~1.8%半胱氨酸、0.8~2%维生素C、余量高糖DMEM培养基。本发明所述的培养基各成分之间相容性好，分散性好，能够在保证细胞状态稳定的前提下有效诱导，高效的诱导促进关键转录因子的表达，促进细胞更新，进而有效的诱导干细胞分泌胰岛素。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种培养基及其在诱导干细胞分泌胰岛素中的应用。
背景技术
1 型糖尿病是由于自身免疫***调节紊乱，自身反应性T 细胞对胰岛 β 细胞特异性免疫损伤导致的糖尿病。目前临床上主要的治疗方法是通过胰岛素替代治疗控制血糖，但不能遏制胰岛 β 细胞功能的进行性衰竭，无法有效阻止远期并发症的发生。更为理想的方案是胰岛细胞移植，但由于供体细胞来源严重短缺、移植后免疫排斥反应等因素，限制了其临床应用。
干细胞具有多向分化潜能和自我更新能力，干细胞来源胰岛 β 细胞移植被认为是治疗 1 型糖尿病的有效手段，诱导干细胞分泌诱导素，不仅能够为患者生成特异性的细胞类型，而且为疾病治疗、药物筛选和再生性医学等创新开辟了新的途径。
发明内容
本发明提供一种培养基及其在诱导干细胞分泌胰岛素中的应用，所述的培养基能够有效的诱导干细胞分泌胰岛素。
一种培养基，包括以下质量百分比的组分： 0.05~0.2%成纤维细胞生长因子、0.1~0.3%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.1~0.4%激活素A、0.2~0.6%烟酰胺、0.4~1%白藜芦醇、0.5~1.2%β-巯基乙醇、0.5~1.2%槐花提取物、0.6~1.5%改性石墨烯、0.8~1.8%半胱氨酸、0.8~2%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
本发明通过将上述各原料按照特定的质量比进行组合，得到能够有效的诱导干细胞分泌胰岛素的培养基，所述的培养基各成分之间相容性好，分散性好，能够在保证细胞状态稳定的前提下有效诱导，高效的诱导促进关键转录因子的表达，并促进相关细胞扩增，促进细胞更新，进而有效的诱导干细胞分泌胰岛素。
作为本发明的优选实施方案，包括以下质量百分比的组分：0.08~0.15%成纤维细胞生长因子、0.15~0.25%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.15~0.3%激活素A、0.3~0.5%烟酰胺、0.5~0.8%白藜芦醇、0.6~1.0%槐花提取物、0.8~1.1%β-巯基乙醇、0.8~1.2%改性石墨烯、1~1.5%半胱氨酸、1.2~1.8%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
作为本发明的优选实施方案，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、0.8%槐花提取物、1%天冬酰胺、1.1%改性石墨烯、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
作为本发明的优选实施方案，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至10~100目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在45~55℃下超声酶解2~6h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
作为本发明的优选实施方案，所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：（2~10）：（0.02~0.06）：（0.02~0.05）。
作为本发明的优选实施方案，所述超声功率为200~600W。
作为本发明的优选实施方案，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在55~75℃下搅拌均匀，得到前驱液；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在70~95℃下搅拌均匀，干燥，得到改性石墨烯。
作为本发明的优选实施方案，所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：（0.5~2）：（4~10）。
作为本发明的优选实施方案，所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为（0.01~0.05）：1。
作为本发明的优选实施方案，所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：（10~30）。
本发明还提供了上述培养基在诱导干细胞分泌胰岛素中的应用。
本发明的有益效果：本发明所述的培养基各成分之间相容性好，分散性好，能够在保证细胞状态稳定的前提下有效诱导，高效的诱导促进关键转录因子的表达，促进细胞更新，进而有效的诱导干细胞分泌胰岛素。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本发明中，具体的分散、搅拌处理方式没有特别限制。
本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明各实施例及对比例所用组分原料除非特别说明，否则均为市售原料，且各平行实验中所使用的组分原料均为同种。
实施例1
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、0.8%槐花提取物、1%天冬酰胺、1.1%改性石墨烯、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：8：0.05：0.04。
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：1：8；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在65℃下以800rpm搅拌2h，得到前驱液；所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为0.04：1；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：20。
实施例2
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.05%成纤维细胞生长因子、0.3%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.1%激活素A、0.6%烟酰胺、0.4%白藜芦醇、1.2%β-巯基乙醇、0.5%槐花提取物、1.3%改性石墨烯、0.8%半胱氨酸、2%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：8：0.05：0.04。
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：1：8；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在65℃下以800rpm搅拌2h，得到前驱液；所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为0.04：1；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：20。
实施例3
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.2%成纤维细胞生长因子、0.1%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.4%激活素A、0.2%烟酰胺、1%白藜芦醇、0.5%β-巯基乙醇、1.2%槐花提取物、0.6%改性石墨烯、1.8%半胱氨酸、0.8%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：8：0.05：0.04。
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：1：8；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在65℃下以800rpm搅拌2h，得到前驱液；所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为0.04：1；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：20。
实施例4
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.08%成纤维细胞生长因子、0.25%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.15%激活素A、0.5%烟酰胺、0.5%白藜芦醇、1.0%槐花提取物、0.8%β-巯基乙醇、0.8%改性石墨烯、1%半胱氨酸、1.8%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：8：0.05：0.04。
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：1：8；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在65℃下以800rpm搅拌2h，得到前驱液；所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为0.04：1；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：20。
实施例5
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.15%成纤维细胞生长因子、0.15%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.3%激活素A、0.3%烟酰胺、0.8%白藜芦醇、0.6%槐花提取物、1.1%β-巯基乙醇、1.2%改性石墨烯、1.5%半胱氨酸、1.2%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：8：0.05：0.04。
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：1：8；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在65℃下以800rpm搅拌2h，得到前驱液；所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为0.04：1；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：20。
实施例6
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、0.8%槐花提取物、1%天冬酰胺、1.1%改性石墨烯、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：2：0.02：0.02。
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：0.5：4；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在65℃下以800rpm搅拌2h，得到前驱液；所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为0.01：1；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：30。
实施例7
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、0.8%槐花提取物、1%天冬酰胺、1.1%改性石墨烯、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：10：0.06：0.05。
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：2：10；
（2）将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到混合液中，在65℃下以800rpm搅拌2h，得到前驱液；所述γ-氨丙基三乙氧基硅烷、混合液的质量比为0.05：1；
（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：10。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处在于，对比例1不含有槐花提取物，其他都相同。
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、1%天冬酰胺、1.1%改性石墨烯、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
对比例2
对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2的槐花提取物的制备方法不同于实施例1，其他都相同。
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入纤维素酶、果胶酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物。
所述槐花粉、水、纤维素酶、果胶酶的质量比为1：2：0.02：0.02。
对比例3
对比例3与实施例1不同之处在于，对比例3不含有改性石墨烯，其他都相同。
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、0.8%槐花提取物、1%天冬酰胺、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
对比例4
对比例4与实施例1不同之处在于，对比例4采用羟基化石墨烯替换改性石墨烯，其他都相同。
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm。
对比例5
对比例5与实施例1不同之处在于，对比例5不含有槐花提取物、改性石墨烯，其他都相同。
一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、1%天冬酰胺、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基。
测试例
将人脐带间充质干细胞（1×106个细胞/mL，钰博生物科技）重悬于培养基（分别为实施例和对比例的培养基）中，在37℃下5%的二氧化碳培养箱中培养14天，每2天换液一次。
取诱导完成的细胞，收集并固定细胞，细胞核用hochest33342 染色呈蓝色荧光，insulin 抗体染细胞呈绿色荧光，C肽 和 Pdx1 抗体染色呈现红色荧光，用imageJ软件进行图片分析，阳性率如表1所示。
阳性率=insulin阳性率+ C肽阳性率+Pdx1阳性率
表1
从表1中可看出，本发明所述的培养基能够有效的诱导干细胞分泌胰岛素。
对比实施例1~5可知，实施例1为本发明的最佳实施方式，有着最佳的诱导效果。
对比实施例1与对比例1~2可看出，本发明所述的槐花提取物能够有效的提高诱导效果，且不同的方法制备得到的槐花提取物的诱导效果是不同的，采用本发明的制备方法制备得到的槐花提取物相比于其他方法具有更佳的诱导效果。
对比实施例1与对比例3~4可看出，本发明通过对石墨烯进行改性，有效的提高了诱导效果。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (2)
1.一种培养基，包括以下质量百分比的组分：0.12%成纤维细胞生长因子、0.2%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.25%激活素A、0.4%烟酰胺、0.6%白藜芦醇、0.8%槐花提取物、1%天冬酰胺、1.1%改性石墨烯、1.4%半胱氨酸、1.5%维生素 C、余量高糖DMEM培养基；
其中，所述槐花提取物的制备方法为：
（1）将槐花粉碎至50目，得到槐花粉；
（2）将槐花粉加入到水中，再加入碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶，在50℃下以500W超声酶解5h，而后采用截留分子量1.5KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，最后采用截留分子量为0.8KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到槐花提取物；
所述槐花粉、水、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：8：0.05：0.04；
其中，所述改性石墨烯的制备方法为：
（1）将羟基化石墨烯、丙酮加入到水中，分散均匀，得到混合液；
其中，所述羟基化石墨烯购买于先丰纳米，牌号为XF307，所述羟基化石墨烯的片径为1~3μm，厚度为1~5nm；
所述羟基化石墨烯、丙酮、水的质量比为1：1：8；
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（3）将β-巯基乙醇加入到前驱液中，在85℃下以800rpm转速搅拌4h，干燥，得到改性石墨烯；所述β-巯基乙醇、前驱液的质量比为1：20。
2.权利要求1所述的培养基在诱导干细胞分泌胰岛素中的应用；所述的干细胞为人脐带间充质干细胞。
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| 成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌样细胞及其鉴定;杨乃龙等;中国组织工程研究与临床康复;20080916;第12卷(第38期);91-94 * |
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