CN117487706A - 一种防控白芷根腐病的拮抗菌及生物有机肥 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防控白芷根腐病的拮抗菌Le395，分类命名为产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)，菌种保藏号为CGMCC NO.28570。本发明公开了拮抗菌Le395在防控白芷根腐病的应用。本发明公开了一种生物有机肥，是将拮抗菌Le395接种到加拿大一枝黄花秸秆和/或玉米秸秆为主要原料堆肥制得的有机肥中得到的。Le395对引起白芷根腐病害的病原菌镰刀菌有较好的抑制作用。利用菌株Le395将秸秆尤其是加拿大一枝黄花开发成生物有机肥，孢子数量至少达108个/g；Le395能定殖在白芷的根际，并产生拮抗物质，抑制白芷根际病原微生物生长，对白芷根腐病害的生物防治率达80％以上。

Description

一种防控白芷根腐病的拮抗菌及生物有机肥
技术领域
本发明属于农业集约化技术领域，涉及一种防控白芷根腐病的拮抗菌Le395及其在防控白芷根腐病的应用，以及采用加拿大一枝黄花秸秆和/或玉米秸秆堆肥生产有机肥，并将其与拮抗菌Le395发酵液混合的生物有机肥，该生物有机肥可用于防控白芷土传病害问题。
背景技术
白芷(Angelica dahurica)是多年生草本植物，喜湿润、不耐干旱。白芷具有解表散寒、祛风止痛、通鼻窍、消肿排脓、祛风止痒的功效，其含有的主要化学成分还有抗肿瘤和保肝的作用。由于可利用土地资源不断减少，导致白芷轮作周期短，种植白芷具有连作障碍，且生态群落结构组成比较单一，物种多样性较低，为病害优势种群的出现创造了有利条件，严重制约了白芷产业的发展。研究表明，白芷土传病害是由多种病原菌引起的土传根部病害，其中主要是由镰刀菌(Fusarium oxysporun)引起的根腐病。目前缺乏防治白芷根腐病的有效手段，利用土壤微生物防治病害是综合防治土传病害的重要措施之一。生物防治技术满足了现代农业对环境保护、食品安全等的要求，是实现农业可持续的有效方法之一。
相比于蔬菜瓜果等农作物，生物有机肥在中药材种植中可应用的产品种类较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防控白芷根腐病的拮抗菌。
一种防控白芷根腐病的拮抗菌Le395，分类命名为产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)，于2023年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.28570。
拮抗菌Le395主要生物学特性为在TSA培养基上最佳的生长温度28℃，培养1～2天，形成2～4mm的菌落。
本发明的另一个目的是提供所述的拮抗菌Le395在防控白芷根腐病的应用。
本发明的另一个目的是提供所述的拮抗菌Le395在制备防控白芷根腐病的生物有机肥中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种生物有机肥，所述的生物有机肥是将拮抗菌Le395接种到加拿大一枝黄花秸秆和/或玉米秸秆为主要原料堆肥制得的有机肥中得到的，生物有机肥中拮抗菌Le395孢子数≥108个/g。
本发明的另一目的在于提供一种生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、制备发酵液：将拮抗菌Le395接种到液体培养基中，摇床培养得到种子液；将种子液倒入装有灭菌的液体培养基的发酵桶中，通入无菌空气，28℃～30℃发酵2d，得到发酵液；
步骤(2)、制备生物有机肥：以加拿大一枝黄花秸秆和/或玉米秸秆为主要原料，进行堆肥，制得有机肥；将有机肥和步骤(1)制得的发酵液混合均匀，制得生物有机肥，生物有机肥中拮抗菌Le395孢子数≥108个/g。
步骤(1)中，所述的液体培养基的配方为：蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.1～7.5。
优选的，所述的种子液的培养：拮抗菌Le395单菌落接种到100mL液体培养基中，置于摇床中，在温度28～30℃下，以转速180r/min培养24h，得到种子液。
优选的，所述的发酵液的制备：将按照接种量2.5％，将种子液倒入装有灭菌的液体培养基的发酵桶中，通入无菌空气，28℃～30℃发酵2d，得到发酵液。
优选的，所述的发酵液中拮抗菌Le395的孢子数为108～109个/mL。
步骤(2)中，优选的，所述的有机肥是由以下方法制得的：将加拿大一枝黄花秸秆或玉米秸秆破碎、烘干后，加入秸秆质量1％～5％的尿素，调节水分至60％～65左右，堆制成发酵堆，前三天每天翻动一次，增加发酵堆与空气的接触面积，使发酵堆升温，第四天开始每天测量发酵堆温度，当发酵堆温度高于70℃时，加大翻堆频率，发酵25d左右，当发酵堆颜色变深，水分含量下降至30％～40％左右、温度降至35℃～40℃左右时，停止发酵，得到有机肥。
优选的，按照发酵液和有机肥的用量比1:10mL/g，将有机肥和发酵液混合均匀。
本发明的另一个目的是提供所述的生物有机肥在防控白芷根腐病和/或促进白芷生长的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明生防菌株Le395对引起白芷根腐病害的病原菌镰刀菌(Fusariumoxysporun)有较好的抑制作用。
2、利用生防菌株Le395将秸秆尤其是加拿大一枝黄花开发成更高附加值的生物有机肥，孢子数量至少达到108个/g；且以加拿大一枝黄花作为生产原料，其量大、价廉、易得，可满足生物有机肥生产的营养需求，且生产成本仅有常规生物有机肥的1/2～1/3，有利于产酶溶杆菌生物有机肥的推广应用。同时，也能够防控加拿大一枝黄花。因此，采用加拿大一枝黄花生产溶杆菌生物有机肥是一种低成本高效的生产方法。
3、本发明生物有机肥的作用机制在于生物有机肥中的拮抗菌Le395能很好的定殖在白芷的根际，并产生拮抗物质，抑制白芷根际病原微生物的生长，也提高了作物的抗逆能力。试验结果表明，在白芷根腐病的土壤上施用生物有机肥后，对白芷根腐病害的生物防治率达80％以上，确保集约化农业的顺利发展，对防控白芷根腐病，提高中药材品质，保护环境有重要意义。
4、溶杆菌生物有机肥是生物菌肥，没有因为化学农药的使用带来一系列问题，因而有利于白芷的无公害生产，农民可以减少其他防治土传病害化学农药的使用量，这不仅可以为农民节省开支，而且有利于提高中药材的质量，从而增加农民的收入。
附图说明
图1为拮抗菌Le395的***发育树。
图2为拮抗菌Le395在不同基质中的活菌数。
图3为拮抗菌Le395在施用有机肥和化肥土壤中的数量；其中，OF为施加有机肥土壤，CF为施加化肥土壤，F.o为添加病原菌处理。
图4为利用加拿大一枝黄花秸秆制备生物有机肥的方法流程图。
图5为不同处理对白芷根腐病发病率的影响。
图6为不同处理白芷的病情指数。
图7为不同处理对白芷根腐病的防控效果。
菌种保藏信息
Le395，分类命名为产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)，于2023年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.28570。
具体实施方式
液体培养基，用于菌株Le395液体种子培养和发酵液制备，以配制1L液体培养基为例：蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，pH 7.1～7.5；去离子水定容至1L，121℃灭菌20min。
实施例1
1、菌株的分离
采集江苏省南京市溧水区白马镇白马基地加拿大一枝黄花根际土壤，采用稀释涂布法分离拮抗菌，具体方法为：量取90mL蒸馏水，加入250mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，取10g加拿大一枝黄花根际土壤，放入上述锥形瓶中，28℃、180r/min震荡30min，用移液枪吸取10-1梯度的土壤稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，混匀，依次梯度稀释得到不同稀释梯度的土壤悬液，吸取50μL土壤悬液，在TSA培养基平板涂布，28℃培养1d，挑取单菌落在TSA培养基上涂布，28℃培养1d，对菌株进行生物学鉴定并保存。
2、拮抗菌筛选与鉴定
(1)、病原菌来源：白芷根腐病害的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporun)，从患有根腐病的白芷根际土壤中由实验室自己分离得到。筛选流程为：称取1g发病土样，装入50mL三角瓶中，加入9mL无菌水，混合，封口；将三角瓶置于30℃恒温摇床中，以转速180r/min振荡30min，于超净工作台静置30min，吸取1mL上清液于1.5mL灭菌的离心管中，取100μL上清液，按照与水1:9的比例稀释至10-2、10-3等梯度。使用移液枪吸取100μL不同稀释梯度的上清液涂布于PDA固体培养基上，将涂布好的平板倒置于28℃恒温培养箱中培养3d。挑取不同形态的菌丝接种到新的PDA固体培养基上，28℃培养箱中3d进行纯化，经菌株鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporun)。
(2)、拮抗菌筛选：采用平板对峙法筛选对白芷根腐病害的病原菌尖孢镰刀菌有抑制作用的最佳菌株。将尖孢镰刀菌在28℃条件下培养3d，用打孔器(Φ＝6mm)打成菌饼，移至PDA培养基的平板中央；将在TSB培养基中28℃培养1d的待筛选菌株的菌液滴加在菌饼周围，28℃培养3d，测量抑菌直径，筛选出拮抗效果良好的菌株Le395，菌种保存于-80℃冰箱。
(3)、菌株鉴定：细菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以此为模板，以细菌16S rRNA通用引物27F、1492R作为扩增引物进行PCR扩增；真菌使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以此为模板，以真菌ITS通用引物ITS1、ITS4作为扩增引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至公司测序，将测序所得序列在NCBI中进行BLAST同源性对比，采用MEGA5软件构建***发育树(如图1)。
经生物公司测序，通过NCBI比对鉴定拮抗菌Le395为产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)。产酶溶杆菌Le395，主要生物学特性为：在TSA培养基上最佳生长温度28℃，培养培养1～2天，形成2～4mm的菌落。
菌株Le395，分类命名为产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)，于2023年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.28570。
实施例2
Le395菌液的制备：从TSB固体培养基上取Le395单菌落，将其接种到100mL灭菌的液体培养基中，进行液体种子培养，培养条件为：培养液初始pH 7.1～7.5，培养温度28℃，摇床转速180r/min，培养24h，得到种子液；将装有液体培养基的发酵桶进行121℃灭菌，待发酵桶内培养基温度冷却至室温，在无菌条件下倒入种子液，接种量为2.5％，将接种口封好后通入无菌空气，28℃～30℃发酵2d，得到孢子数量为109个/mL的Le395菌液。
加拿大一枝黄花秸秆有机肥的制备：将加拿大一枝黄花秸秆破碎、烘干后，加入秸秆质量1％的尿素，调节水分至60％左右(以用手抓紧秸秆，指缝刚好挤出水滴为宜)，堆制成发酵堆，前三天每天翻动一次发酵堆，增加发酵堆与空气的接触面积，使发酵堆升温，第四天开始每天测量发酵堆温度，当发酵堆温度高于70℃时，加大翻堆频率，当发酵堆颜色变深，水分下降至40％左右、温度降至40℃左右时，停止发酵，得到有机肥。
尖孢镰刀菌菌液的制备：选取从白芷发病土壤中分离出的病原菌尖孢镰刀菌(同实施例1)，接种至PDA平板上，28℃下培养3d，使用打孔器在PDA平板上打孔挑取5块左右菌饼放入PDB培养基中，每三角瓶300mL PDB培养液，将三角瓶放在摇床上，28℃、以转速180r/min振荡培养3d，得到尖孢镰刀菌菌液。
(一)、比较在不同腐熟载体中的拮抗菌Le395活菌数
实验流程为：选取烟草秸秆、水稻秸秆(即稻草)、高粱秸秆、玉米秸秆、加拿大一枝黄花秸秆、猪粪、羊粪，分别在室外进行堆肥腐熟25d。称取2g腐熟载体，灭菌后置于50mL灭菌的离心管中，每个离心管中加入一种腐熟载体，添加8mL无碳源的无机盐培养基使腐熟载体的含水率为80％，按照腐熟载体质量的1％接种Le395菌液，充分震荡混合，放置于恒温恒湿培养箱中28℃静置发酵7d，再加入18mL无菌水，置于28℃恒温摇床上，以转速180r/min振荡30min，于超净工作台静置30min，吸取200μL上清液于酶标仪上测OD600。
无机盐培养基配方：磷酸二氢钾3.0g、硝酸钠3.0g、七水合硫酸镁0.5g、氯化钙0.5g，去离子水定容至1L。
结果如图2所示，与烟草秸秆、稻草、高粱秸秆、猪粪、羊粪等各自为原料制成的腐熟载体相比，分别以入侵植物加拿大一枝黄花秸秆和玉米秸秆为原料制成的腐熟载体是拮抗菌Le395发育的良好载体。且将一枝黄花秸秆用于制备生物有机肥，成本低廉，既防控了加拿大一枝黄花的入侵，又利于生物有机肥大范围推广应用。
(二)、比较拮抗菌Le395在施用有机肥土壤中和施用化肥土壤中的活菌数
具体实验流程为：采集江苏省南京市溧水区白马镇白马基地施用有机肥(加拿大一枝黄花秸秆有机肥，施用量500kg/亩)和施用化肥(复合肥N：P：K＝15％：15％：15％，施用量50kg/亩)的土壤。分为OF(Le395+F.o)组、OF(Le395)组、CF(Le395+F.o)组、CF(Le395)组，OF(Le395+F.o)组：称取4g施用有机肥(OF)的灭菌土壤于6孔板中，按照接种量为5％加入Le395菌液，加入1mL尖孢镰刀菌菌体(尖孢镰刀菌菌液离心，弃上清液)；OF(Le395)组：称取4g施用有机肥(OF)的灭菌土壤于6孔板中，按照接种量为5％加入Le395菌液；CF(Le395+F.o)组：称取4g施用化肥(CF)的灭菌土壤于6孔板中，按照接种量为5％加入Le395菌液，加入1mL尖孢镰刀菌菌体(尖孢镰刀菌菌液离心，弃上清液)；CF(Le395)组：称取4g施用有机肥(OF)的灭菌土壤于6孔板中，按照接种量为5％加入Le395菌液。每个处理3个重复，室温培养，选取不同时间段采用稀释涂布法测定土壤中Le395活菌数并记录。
结果如图3所示，拮抗菌Le395在施用有机肥的土壤中活菌数更高，而在施用化肥土壤中几乎很难存活，因此通过制备生物有机肥的形式防控白芷根腐病。
实施例3
生物有机肥的制备方法如图4所示，包括以下步骤：
步骤(1)、培养菌株Le395种子液：从TSB固体培养基上取Le395单菌落，将其接种到100mL灭菌的液体培养基中，进行液体种子培养，培养条件为：培养液初始pH 7.1～7.5，培养温度28℃，摇床转速180r/min，培养24h，得到种子液；
步骤(2)、制备发酵液：将装有液体培养基的发酵桶进行121℃灭菌，待发酵桶内培养基温度冷却至室温，在无菌条件下倒入种子液，接种量为2.5％，将接种口封好后通入无菌空气，28℃～30℃发酵2d，得到孢子数量达109个/mL的发酵液；
步骤(3)、采用加拿大一枝黄花秸秆为原料制备有机肥：将加拿大一枝黄花秸秆破碎、烘干后，加入秸秆质量1％的尿素，调节水分至60％左右(以用手抓紧秸秆，指缝刚好挤出水滴为宜)，发酵堆堆制后，前三天每天翻动一次发酵堆，增加发酵堆与空气的接触面积，使发酵堆升温，第四天开始每天测量发酵堆温度，当发酵堆温度高于70℃时，加大翻堆频率，发酵25d左右，当发酵堆颜色变深，水分下降至40％左右、温度降至40℃左右时，停止发酵，得到有机肥；
步骤(4)、制备生物有机肥：以10％接种量(mL/g，按堆肥重量计算)将发酵液添加至有机肥中，反复搅拌使两者混合均匀，摊开发酵堆风干水分，待发酵堆水分低于30％时，通过稀释涂布方法检测生物有机肥中产酶溶杆菌Le395为108CFU/g，各项检测有机肥指标均按照NY884-2012的要求，即得生物有机肥。
实施例4
1、病原菌接种液
选取从白芷发病土壤中分离出的病原菌尖孢镰刀菌(同实施例1)，接种至PDA平板上，28℃下培养3d，使用打孔器在PDA平板上打孔挑取5块左右菌饼放入PDB培养基中，每三角瓶300mL PDB培养液，将三角瓶放在摇床上，28℃、以转速180r/min振荡培养3d。
2、温室防效试验
考察含拮抗菌株Le395生物有机肥防控白芷土传病害的能力。试验设计如下：
对照(CK)：仅有育苗土；
有机肥处理(OF)：育苗土+有机肥处理；
生物有机肥处理(BOF)：育苗土+生物有机肥处理；
1.5kg育苗土/盆钵，每处理12盆，1棵苗/盆。OF：每盆施用育苗土总质量1％的有机肥(15g，实施例3步骤(3)制的有机肥)与盆栽土混合作基肥；BOF：每盆施用育苗土总质量1％的生物有机肥(15g，实施例3步骤(4)制得的生物有机肥)与育苗土混合作基肥。白芷通过育苗盘育苗，于2023年7月5日移栽到1.5kg育苗土的盆钵中，移栽7d后，采用灌根法将病原菌均匀浇入白芷根部附近土壤中，每盆白芷接入病原菌终浓度为108个/g，当白芷在盆钵中生长至21天时取样，统计发病程度，计算病情指数，测定植株总鲜重，根鲜重考察防控促生效果。
白芷根腐病发病程度分为4级。0级为根系未发病；1级根系发病率≤25％，叶片正常；2级为25％＜根系发病率≤50％，叶片变黄；3级为50％＜根系发病率≤75％，叶片枯萎；4级为根系发病率大于75％以上，叶片干枯。
病情指数和防治效果分别按照下列公式计算：
病情指数＝[Σ(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100
防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
施加生物有机肥处理和有机肥处理均能降低根腐病发病率(见图5)，其中施加生物有机肥处理表现出更好的防治效果，其防治效果为81.6％(见图6)，施加有机肥防治效果仅为18.5％，施加生物有机肥处理及有机肥处理的白芷地上部分鲜重分别增加了560％，109％，根鲜重分别增加了51.4％，44.5％。表明施加生物有机肥和有机肥均可促进白芷生长发育，但以施加生物有机肥对白芷生长促进效果更显著(见表1)。
表1.温室盆栽试验各处理对白芷根腐病防治效果、白芷生长的影响
本发明从改善土壤微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能显著降低白芷根腐病发生的生物有机肥，对白芷根腐病的防治率达80％以上。
本发明实施例中使用的尖孢镰刀菌，仅是为了举例说明“拮抗菌Le395能够防控白芷根腐病”，但使用的尖孢镰刀菌并不局限于该来源。本领域技术人员应该清楚，只要使用具有相应致病性的且鉴定为引起白芷根腐病的尖孢镰刀菌，均适用于本发明。

Claims (10)

1.一种防控白芷根腐病的拮抗菌Le395，分类命名为产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)，于2023年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.28570。
2.权利要求1所述的拮抗菌Le395在防控白芷根腐病的应用。
3.权利要求1所述的拮抗菌Le395在制备防控白芷根腐病的生物有机肥中的应用。
4.一种生物有机肥，其特征在于：所述的生物有机肥是将权利要求1所述的拮抗菌Le395接种到加拿大一枝黄花秸秆和/或玉米秸秆为主要原料堆肥制得的有机肥中得到的，生物有机肥中拮抗菌Le395孢子数≥108个/g。
5.一种权利要求4所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)、制备发酵液：将拮抗菌Le395接种到液体培养基中，摇床培养得到种子液；将种子液倒入装有灭菌的液体培养基的发酵桶中，通入无菌空气，28℃～30℃发酵2d，得到发酵液；
步骤(2)、制备生物有机肥：以加拿大一枝黄花秸秆和/或玉米秸秆为主要原料，进行堆肥，制得有机肥；将有机肥和步骤(1)制得的发酵液混合均匀，制得生物有机肥，生物有机肥中拮抗菌Le395孢子数≥108个/g。
6.根据权利要求5所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的液体培养基的配方为：蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.1～7.5。
7.根据权利要求5所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的种子液的培养：拮抗菌Le395单菌落接种到100mL液体培养基中，置于摇床中，在温度28～30℃下，以转速180r/min培养24h，得到种子液；
所述的发酵液的制备：将按照接种量2.5％，将种子液倒入装有灭菌的液体培养基的发酵桶中，通入无菌空气，28℃～30℃发酵2d，得到发酵液。
8.根据权利要求5所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的发酵液中拮抗菌Le395的孢子数为108～109个/mL。
9.根据权利要求5所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的有机肥是由以下方法制得的：将加拿大一枝黄花秸秆或玉米秸秆破碎、烘干后，加入秸秆质量1％～5％的尿素，调节水分至60％～65％，堆制成发酵堆，前三天每天翻动一次，第四天开始每天测量发酵堆温度，当发酵堆温度高于70℃时，加大翻堆频率，当发酵堆颜色变深，水分含量下降至30％～40％、温度降至35℃～40℃时，停止发酵，得到有机肥。
10.权利要求4所述的生物有机肥在防控白芷根腐病和/或促进白芷生长的应用。
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