CN117447610A - 一种嵌合抗原受体（car）及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向EGFR的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内信号转导域，其中scFv具有特殊的氨基酸结构，与目标抗原具有高度亲和力，可有效防止脱靶效应；使用IL‑35处理T细胞，可防止炎症因子过度释放，提高治疗的安全性；使用IFN‑β处理T细胞，可保持T细胞的增殖活性，保证抗肿瘤效果。

Description

一种嵌合抗原受体(CAR)及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域：

本发明属于生物技术研发领域，具体提供了一种嵌合抗原受体(CAR)及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T)免疫疗法疗法是一种***的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。CAR-T细胞疗法通过重新编程免疫***来对抗肿瘤细胞，而不依赖于HLA呈递，T细胞经过基因工程改造，以呈现识别肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，并输注到患者体内。工程化抗体对这些癌症同源特异性抗原的识别会导致T细胞中某些信号传导途径的启动，从而诱导多种促炎细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-2)释放和肿瘤细胞的溶解。CAR-T细胞的这种独特功能可以弥补T细胞受体(TCR)介导的免疫反应的局限性，例如T细胞对抗原的亲和力低以及肿瘤细胞上MHC的缺失。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是一种人工蛋白质，由三个主要成分组成：跨膜结构域、细胞内信号基序和细胞外肿瘤特异性抗体。细胞外肿瘤特异性抗体是抗原靶向的关键组成部分，并包含源自天然肿瘤特异性抗体的单链片段(scFv)(参见Srivastava S,Riddell SR.Engineering CAR-T cells:design concepts.TrendsImmunol.2015；36(8):494-502)。该成分参与CAR-T细胞与癌细胞的结合，随后刺激T细胞的激活和增殖，从而产生细胞因子和细胞溶解性脱颗粒。细胞内信号基序提供了T细胞对癌症特异性抗原反应的持久性、质量和强度，经过改造以提高CAR-T细胞的抗癌效力。

迄今为止，已经开发出五代CAR。在第一代中，胞内结构域(细胞内信号基序)仅由CD3δ链组成，无法提供足够的T细胞增殖和细胞因子释放。因此在第二代中，添加了细胞内共刺激结构域(CD28或4-1BB)，以改善T细胞增殖和持久性。在第三代中，CD28和4-1BB均已添加到细胞内，以进一步增加T细胞增殖和持久性。在***，第二代CAR的内域中添加了多种细胞因子，例如IL-12，可刺激T细胞和自然杀伤细胞针对癌细胞的激活，这些受刺激的自然杀伤细胞可以招募细胞因子，并有助于增加针对癌细胞的细胞毒性，这种结构出现延长了CAR-T细胞的寿命，并刺激CAR-T细胞对抗抗原阴性癌细胞和肿瘤微环境。在第五代中，添加了STAT3转录因子和IL-2受体的结合位点以诱导细胞因子风暴。

此外，研究人员尝试应用了多种方法来提高CAR-T细胞的抗肿瘤功能。临床前模型已经证明，CD28和4-1BB联合共刺激可以增强CAR-T细胞的持久性、IL-2分泌和细胞溶解活性。带有CD40L的修饰T细胞将导致促炎细胞因子的产生和分泌增加，例如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-2和IL-12。IL-12通过招募和增强巨噬细胞和NK细胞等先天免疫细胞、增加细胞毒性T细胞活化、增加1型辅助T(Th1)水平，在CAR-T细胞的抗癌活性中发挥多种关键作用反应，并减少血管生成活性。近年来，还开发了T细胞重定向通用细胞因子杀伤(TRUCK)方法，TRUCK可以通过产生和分泌外源因子(例如IL-12)来重定向CAR-T细胞，以刺激免疫***对抗CAR-T细胞无法识别的癌细胞(参见Chmielewski M,Hombach AA,Abken H.OfCAR s and TRUCK s:chimeric antigen receptor(CAR)T cells engineeredwith an inducible cytokine to modulate the tumor stroma.Immunol Rev.2014.Jan；257(1):83-90)。除了靶向癌症特异性抗原外，CAR-T细胞还产生IFN-γ细胞因子，该细胞因子通过与肿瘤基质中表达的IFNγ受体(IFNγR)相互作用，在不依赖于抗原的癌细胞破坏中发挥作用。

尽管如此，CAR-T细胞疗法仍面临诸多挑战，包括如下方面：

第一，抗原逃逸。虽然最初靶向CAR-T细胞的单一抗原可以提高反应率，但接受这些CAR-T细胞治疗的很大一部分患者的恶性细胞表现出部分或完全丧失靶抗原表达，这种现象称为抗原逃逸。例如，虽然70-90％的复发和/或难治性ALL患者对CD19靶向CAR-T细胞疗法表现出持久的反应(参见Maude SL,Teachey DT,Porter DL,Grupp SA.CD19-targetedchimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblasticleukemia.Blood.2015；125:4017–4023)。为了降低CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤和实体瘤的复发率，现在许多策略都依赖于针对多种抗原，采用双CAR构建体或串联CAR，包含两个scFv的单个CAR构建体，以便同时靶向多个靶肿瘤抗原。

第二，CAR-T细胞运输和肿瘤浸润。与血液恶性肿瘤相比，实体瘤CAR-T细胞治疗受到CAR-T细胞运输和浸润实体瘤能力的限制，因为免疫抑制性肿瘤微环境和肿瘤基质等物理肿瘤屏障限制了CAR的渗透和流动性-T细胞。为改善这些限制，最先想到的策略是利用全身递送以外的递送途径，局部给药消除了CAR-T细胞运输到疾病部位的需要，限制了靶向肿瘤外毒性，最大限度地减少与正常组织的相互作用。另一种策略是在CAR-T细胞上表达趋化因子受体，这些受体与肿瘤来源的趋化因子相匹配并对其做出反应，例如研究表明，经过修饰以表达CXCR2的整合素αvβ6-CAR-T细胞或过度表达CXCR1或CXCR2的CAR-T细胞均可增强运输并显着提高抗肿瘤功效(参见Liu G,et al.CXCR2-modified CAR-T cells haveenhanced trafficking ability that improves treatment of hepatocellularcarcinoma.Eur.J.Immunol.2020；50:712–724)。

第三，免疫抑制微环境。在肿瘤微环境中，许多驱动免疫抑制的细胞类型可以浸润实体瘤，包括骨髓源性抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和调节性T细胞(Treg)，这些浸润和肿瘤细胞驱动肿瘤促进细胞因子、趋化因子和生长因子的产生。此外，PD-1或CTLA-4等免疫检查点通路可降低抗肿瘤免疫力。CAR-T细胞疗法无反应或反应弱的主要原因之一是T细胞扩增不良和短期T细胞持久性。因此，研究人员试图设计能够抵抗恶劣肿瘤微环境中免疫抑制因素(如TGFβ介导的抑制信号)的CAR；还有对CAR-T细胞进行改造，以刺激性细胞因子的形式提供免疫刺激信号，从而增加T细胞的存活、增殖、抗肿瘤活性，并重新平衡肿瘤微环境；也有研究人员考察了多种细胞因子来创建这些“装甲CAR”，关注促炎细胞因子表达而非抑制信号的研究依赖于IL-12分泌、IL-15表达，并将免疫抑制细胞因子(例如IL-4)信号转导至促炎细胞因子。

第四，CAR-T细胞相关毒性。尽管CAR-T细胞疗法已成为一种革命性的癌症治疗工具，但高毒性和死亡率阻碍了CAR-T细胞疗法成为一线治疗方法。CAR-T细胞疗法的毒性在接受FDA批准的第一个CAR-T细胞疗法(CD19定向CAR)的患者中得到了最广泛的表征，其中还包括严重的危及生命的事件(参见Maude SL,et al.Tisagenlecleucel in childrenand young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.N.Engl.J.Med.2018；378:439–448)。细胞因子释放综合征(CRS)是常见的毒性反应，CRS是CAR-T细胞广泛激活导致释放大量细胞因子的结果，轻度CRS的临床表现是发热并伴有疲劳、腹泻、头痛、皮疹、关节痛和肌痛，严重者可出现低血压、心功能不全、循环衰竭、呼吸衰竭、肾衰竭、多器官***衰竭等。从病理生理学角度来看，CRS被认为主要由IL-6介导，因此，治疗依赖于使用托珠单抗和皮质类固醇阻断IL-6受体

鉴于CAR-T疗法中的上述缺陷，本发明提供了一种新型嵌合抗原受体，其包括与目标抗原具有高度亲和力的scFv，可以防止脱靶效应出现；在CAR-T细胞制备过程中，使用IL-35和IL-15进行免疫刺激，一方面可产生免疫记忆，刺激T细胞增殖，另一方面还可以防止细胞因子的过度释放，降低毒性作用。

发明内容

本发明中的第一方面提供了一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向EGFR的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内信号转导域，所述靶向EGFR的scFv包括如SEQ ID NO.1所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQ IDNO.2所示的轻链可变区氨基酸序列。

进一步的，所述胞内共刺激结构域选自以下蛋白质中的一种或几种：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB、CDS、ICAM-1、LFA-1、CLAUDIN、CD278或GITR。

进一步的，所述胞内共刺激结构域为4-1BB。

进一步的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列和如SEQ ID NO.3所示。

本发明中的第二方面提供了一种重组细胞，所述重组细胞表所述的嵌合抗原受体，所述重组细胞为经修饰的T细胞。

进一步的，所述T细胞经过IFN-β和IL-35诱导激活。

进一步的，所述诱导激活步骤为在终浓度为50-100ng/mL的IFN-β和10-50ng/mL的IL-35培养基中孵育24-48h。

IL-35是1997年新发现IL-12家族中的细胞因子，Sawant等证实IL-35是IL-12家族中最强的免疫抑制因子(参见Sawant D V,Hamilton K,Vignali D A.Interleukin-35:Expanding Its Job Profile[J].JInterferon Cytokine Res,2015,35(7):499-512)。现已证实IL-35在急性促炎症刺激(如内毒素)和慢性促炎症刺激(如高脂血症、高血糖)等因素下可被诱导表达，主要由调节性T细胞，调节性B细胞，树突细胞分泌，少部分由内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞分泌与主要由活化的抗原提呈细胞(树突状细胞、单核/巨噬细胞和B细胞)分泌的IL-12家族其他成员不同，IL-35可抑制T细胞增殖，抑制Th1和Th17细胞分化，诱导Treg细胞增殖。李恺研究表明，IL-35可抑制CD4+T细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17A、IL-6、IL-1β等细胞因子的分泌(参见李恺，白介素-35通过调控CD4+T细胞分化抑制高脂诱导的内皮细胞激活，南昌大学硕士论文，2023)。本发明中采用IL-35处理，可降低CAR-T细胞中细胞因子的过度分泌，防止免疫因子风暴的产生。干扰素β(IFN-β)被广泛用作调节T细胞反应的一线干预，尽管其多效性和多方面的活性影响其对疾病发展的有效性，其机制尚不完全清楚，但有研究表明其能够促进T细胞的增殖和分化(参见Nadia Kavrochorianou etal,IFN-βdifferentially regulates the function of T cell subsets in MS andEAE,Cytokine Growth Factor Rev,2016:30:47-54),本发明中采用IFN-β和IL-35配合使用，既能够刺激T细胞增殖，又可防止过度的免疫因子释放，降低毒副作用。

本发明中的第三方面提供了一种所述的嵌合抗原受体和/或所述的重组细胞在制备治疗实体瘤的药物中的应用。

进一步的，所述实体瘤包括肝癌、肺癌、骨癌、脑癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝内胆管癌、卵巢癌、肾癌、胶质瘤、头颈部细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、恶性间皮瘤、甲状腺癌、***、神经膀胱癌、***癌。

进一步的，所述实体瘤为乳腺癌。

有益效果

本发明提供了一种嵌合抗原受体及其在制备抗肿瘤药物中的应用，具有以下优势：

(1)选用对目标抗原具有高亲和力且具有特定氨基酸结构的scFv构建嵌合抗原受体，可有效防止脱靶效应，提高治疗的有效性；

(2)使用IL-35处理T细胞，可防止炎症因子过度释放，提高治疗的安全性；

(3)使用IFN-β处理T细胞，可保持T细胞的增殖活性，保证抗肿瘤效果。

附图说明

图1：嵌合抗原受体结构示意图；

图2：IL-35和IFN-β处理对于细胞因子释放的调节作用图；

图3：细胞因子处理对于细胞增殖能力的影响图；

图4：不同CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力图；

图5：动物平均生存时间图。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1CAR-T细胞的制备

1.1T细胞分离

从健康志愿者体内，取12mL外周静脉血入肝素抗凝管。先在15m L离心管中加入6mL淋巴细胞分离液，再贴壁加入6mL血液，在32℃、1000g条件下离心30min。离心后可见分层，将白膜层即单个核细胞层(PBMCs)吸入至50mL离心管中。加入20mL X-VIVO培养基清洗，300g离心10min后弃上清液，加入20mL红细胞裂解缓冲液，裂解2min后300g离心5min。离心后弃上清，加入20mL X-VIVO培养基清洗，300g离心5min后弃上清，并用含有抗人CD3/CD28抗体磁珠的X-VIVO完全培养基(磁珠：细胞＝1∶1)进行活化、培养传代。

1.2嵌合抗原受体的设计

在前期实验中，设计、筛选并获得靶向EpCAM的scFv片段，所述片段包括如SEQ IDNO.1所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区氨基酸序列，该片段对于目标抗原具有高亲和力，其解离系数达到nM级。

在此基础上，本发明中设计了相应的嵌合抗原受体结构，其结构示意图如图1所示，依次包括信号肽、scFv片段、铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激因子和胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

1.3CAR-T细胞制备

将1.2节中所述的CAR基因序列导入慢病毒载体中，然后将2×10⁶个T细胞接种于6孔板(内含有1mL X-VIVO培养基)，37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h，待细胞进入稳定状态后，按MOI 10加入慢病毒，37℃、5％CO₂培养箱中孵育，每天监测生长状况，并根据生长情况更换培养基，3-5天后获得经慢病毒转染后的CAR-T细胞,记为TR-CAR-T。

实施例2白介素因子激活T细胞及相应CAR-T细胞的制备

为了改善CAR-T细胞的抗肿瘤活性，同时降低毒性作用发生的可能性，本实施例中采用不同的细胞因子处理T细胞，并制备相应的CAR-T细胞。

使用IL-35处理分离获得的T细胞，向采用1.1节中所述方法获得的T细胞培养基中加入终浓度为50ng/mL的IL-35，37℃培养箱中孵育24h，然后采用1.3节中所述方法，制备CAR-T细胞,记为IL-35-CAR-T。

在早期实验中，使用IL-35处理后，T细胞的增殖活性受到一定程度的抑制，故考虑使用IFN-β处理，以便解除对T细胞的限制。分别在培养基中加入终浓度100ng/mL的IFN-β，或同时加入终浓度100ng/mL的IFN-β和50ng/mL的IL-35，37℃培养箱中孵育24h。然后采用1.3节中所述方法，制备CAR-T细胞,分别记为IFN-β-CAR-T和双因子CAR-T。

实施例3白介素因子调节CAR-T细胞的细胞因子分泌功能

将所述TR-CAR-T、IL-35-CAR-T、IFN-β-CAR-T和双因子CAR-T细胞接种于6孔板中，37℃培养箱中培养24h后取细胞上清，1000g离心10min去除杂质和细胞碎片，使用ELISA试剂盒(购自美国BioLegend公司)检测上清中的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8含量，具体方法按照试剂盒说明书进行。

结果如图2所示，IL-35使得IFN-γ、TNF-α、IL-6的表达水平受到抑制，但是对于IL-8的影响不大；而使用IFN-β可以缓解IL-35的抑制作用，使得细胞因子分泌水平温和下降，在双因子CAR-T细胞中相应细胞因子的分泌水平有所降低，但基本上高于IL-35-CAR-T的分泌水平。

实施例4白介素因子调节CAR-T细胞的增殖能力和抗肿瘤能力

4.1增殖能力

CAR-T细胞的增殖能力与抗肿瘤功能密切相关，如果增殖能力降低，则意味着体内半衰期缩短，难以发挥长效抗肿瘤作用。本节中采用MTT法检测所述CAR-T细胞的增殖活性，分别取5×10⁵个TR-CAR-T、IL-35-CAR-T、IFN-β-CAR-T和双因子CAR-T细胞接种于96孔板中，各组设置5个复孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，弃去原培养液，每孔加20μL5g/L MTT溶液，置于37℃培养箱中孵育4h后，每孔加150μL DMSO，振荡10min，用酶标仪测量波长490nm处吸光度值(OD)，并按公式计算细胞相对增殖率，细胞相对增殖率＝实验组OD值/对照组OD值×100％，以TR-CAR-T细胞为对照组。

结果如图3所示，IL-35的处理虽然能够抑制炎症因子分泌，但是也使得CAR-T细胞增殖能力大幅度降低，不利于后期的肿瘤治疗。为此，本发明中使用IFN-β协同处理，以便对抗IL-35对细胞增殖能力造成的不利影响，经过双因子处理后，细胞增殖能力得到了恢复，并有增强的趋势。

4.2抗肿瘤能力

本节中考察所述CAR-T细胞对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(购自美国ATCC公司)的抑制作用。采用荧光素酶法检测体外杀伤效果，按照10：1的效靶比，分别将TR-CAR-T、IL-35-CAR-T、IFN-β-CAR-T和双因子CAR-T细胞与MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，每组设置3个复孔。共培养24h后取出96孔细胞培养板，每孔加入50μL 2％Triton裂解液，反复吹匀，静置3-5min，取50μL裂解液置于黑色96孔板中，加入50μL底物(300μg/mL D-Luciferin水溶液与2mol/mL ATP水溶液按照体积比为3∶1混和)吹吸混匀。30min后用酶标仪检测其化学发光值，以不加效应细胞的条件作为杀伤靶细胞实验的空白对照，以T细胞对相应靶细胞的杀伤作用作为阴性对照，杀伤效率(％)＝[(空白对照荧光平均值－实验组荧光平均值)/空白对照荧光平均值]×100％。相同效靶比的CAR-T杀伤效率减去T细胞杀伤效率，即为CAR-T的实际杀伤率。

结果如图4所示，本发明提供的CAR-T细胞均能够有效发挥肿瘤杀伤作用，但是IL-35的处理使得这种抗肿瘤活性减弱，而IFN-β的促进增殖作用，使得抗肿瘤活性得以恢复。

实施例5CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用

取5×10⁶个处于对数生长期的MDA-MB-231接种于裸鼠背部，每天观察成瘤情况并记录，肿瘤体积生长至100mm³以上时，表示造模成功。取50只造模成功小鼠，随机分为5组，分别为TR-CAR-T组：尾静脉注射1×10⁶个TR-CAR-T细胞，每周给药一次；IL-35-CAR-T组：尾静脉注射1×10⁶个IL-35-CAR-T细胞，每周给药一次；IFN-β-CAR-T组：尾静脉注射1×10⁶个IFN-β-CAR-T细胞，每周给药一次；双因子CAR-T组：尾静脉注射1×10⁶个双因子CAR-T细胞，每周给药一次；对照组，每周给药一次注射等体积生理盐水。各组共给药4周，每天观察动物生长状态，并记录生存时间。

结果如图5所示，采用经典的TR-CAR-T细胞***小鼠，相对于对照组可显著延长生存周期，但其改善幅度有限，由于伴随着大量的细胞因子释放，治疗的安全性存在隐患；使用IL-35处理后，炎症因子分泌受到抑制，但是T细胞增殖活性降低，使得治疗效果仍不理想；而使用IL-35和IFN-β共同处理后，使得在保持增殖活性的同时，降低过度炎症因子的表达，从而在整体上改善了治疗效果。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向EGFR的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内信号转导域，所述靶向EGFR的scFv包括如SEQ ID NO.1所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域选自以下蛋白质中的一种或几种：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB、CDS、ICAM-1、LFA-1、CLAUDIN、CD278或GITR。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域为4-1BB。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列和如SEQ ID NO.3所示。

5.一种重组细胞，所述重组细胞表达权利要求1-4任一项中所述的嵌合抗原受体，所述重组细胞为经修饰的T细胞。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述T细胞经过IFN-β和IL-35诱导激活。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述诱导激活步骤为在终浓度为50-100ng/mL的IFN-β和10-50ng/mL的IL-35培养基中孵育24-48h。

8.一种权利要求1-4中任意一项所述的嵌合抗原受体和/或权利要求5-7任一项所述的重组细胞在制备治疗实体瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述实体瘤包括肝癌、肺癌、骨癌、脑癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝内胆管癌、卵巢癌、肾癌、胶质瘤、头颈部细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、恶性间皮瘤、甲状腺癌、***、神经膀胱癌、***癌。

10.根据权利要求9所述的应用，所述实体瘤为乳腺癌。