CN117412772A - 用于双靶向治疗神经内分泌瘤的组合物和方法 - Google Patents

用于双靶向治疗神经内分泌瘤的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了化合物组合物及其合成方法。本文公开和所述的组合物是直接针对结合至去甲肾上腺素转运体(NET)或儿茶酚胺转运体的靶标的甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂。该组合物在治疗和诊断成像神经内分泌瘤中具有双靶向的效果，并增加了靶向效率。

Description

用于双靶向治疗神经内分泌瘤的组合物和方法
技术领域
本发明一般涉及靶向并治疗神经内分泌瘤的组合物。特别是，该组合物可能包括甲状腺激素αvβ3整联蛋白受体拮抗剂(称为“甲状腺整联蛋白拮抗剂”)，以及将去甲肾上腺素转运体(NET)或儿茶酚胺转运体(例如苄胍(“BG”)或其衍生物)作为靶标的化合物。
背景技术
去甲肾上腺素/儿茶酚胺转运体(“去甲肾上腺素转运体”)对于在突触末端和肾上腺嗜铬细胞上的去甲肾上腺素的摄取是必不可少的。在神经内分泌瘤中，去甲肾上腺素转运体是高度活跃的，且对局部放疗的成像和/或治疗可以进行靶向。靶向去甲肾上腺素转运体的最广泛使用的治疗剂之一是间碘苄胍(MIBG)，其为去甲肾上腺素的胍类似物。123I-MIBG/131I-MIBG治疗诊断学已用于神经内分泌瘤的临床评估和管理，尤其是用在成神经细胞瘤、副神经节瘤和嗜铬细胞瘤中。123I-MIBG成像已用于评估成神经细胞瘤中，而131I-MIBG则用于治疗复发性高危成神经细胞瘤，然而，结果仍然欠佳。靶向去甲肾上腺素转运体的正电子发射断层扫描(PET)示踪剂及其靶标在成神经细胞瘤、副神经节瘤/嗜铬细胞瘤和类癌治疗后展现为成像和评估的更好选择。
整联蛋白是细胞表面粘附受体的超家族，其控制细胞与固定细胞外环境对细胞外基质(ECM)和其他细胞的粘附。粘附对于细胞是至关重要的；它提供了定位、迁移路径以及生长和分化的信号。整联蛋白直接参与许多正常和病理情况，因此其是治疗干预的主要靶标。整联蛋白是整合的跨膜蛋白，为异二聚体，其结合特异性取决于14条α-链中的哪条与8条β-链中的哪条结合。整联蛋白划分为四个重叠的亚家族，包含β1、β2、β3或αv链。细胞可以表达来自每个亚家族的几种不同的整联蛋白。在过去的几十年中，已经显示整联蛋白是参与细胞粘附的主要受体，因此可能是用于治疗干预的合适靶标。整联蛋白αvβ3调节细胞生长和存活，因为这种受体的连接在某些环境下可以诱导肿瘤细胞凋亡。已显示采用抗αvβ3抗体、RGD肽、肽模拟物或非肽衍生物以及其他整联蛋白拮抗剂来破坏细胞粘附可减缓肿瘤的生长。
已显示甲状腺整联蛋白拮抗剂通过与整联蛋白αvβ3相互作用来影响肿瘤血管生成。甲状腺整联蛋白拮抗剂的效果描述于公开号为2017/0348425，标题为《与αvβ3整联蛋白甲状腺拮抗剂结合的不可裂解的聚合物》的美国专利，其内容通过引用并入本文。
包括甲状腺整联蛋白拮抗剂化合物和去甲肾上腺素转运体靶标化合物的组合物将会在本领域中深受欢迎。
发明内容
根据一个方面，组合物包括下列通式化合物：
或其盐；
其中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自由氢、碘、氟、溴、甲氧基基团、硝基基团、氨基基团、腈基团所构成的组；其中R5、R6、R7和R8各自独立地选自由氢、碘、烷烃基团所构成的组；且n1≥0；n2≥1；以及Y包括氨基。
根据另一方面，一种用于双靶向肿瘤细胞的方法，包括施用组合物，所述组合物包含通式化合物：
或其盐，
其中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自由氢、碘、氟、溴、甲氧基基团、硝基基团、氨基基团、腈基团所构成的组；其中R5、R6、R7和R8各自独立地选自由氢、碘、烷烃基团所构成的组；且n1≥0；n2≥1；以及Y包括氨基。
根据另一方面，组合物包括N-卞胍以及甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂，其中N-卞胍和甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂通过连接体连接。
附图说明
本专利或本申请文件至少包括一个以彩色绘制的附图。将根据申请人的要求和支付必要的费用，由专利局提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开副本。
将参考以下附图详细描述部分实施例，其中类似的名称表示类似的部分，其中：
图1描述了用于双靶向神经内分泌瘤的示范性组合物的通式；
图2a描述了具有一氨基连接体的示范性组合物的另一通式；
图2b描述了具有二氨基连接体的示范性组合物的另一通式；
图2c描述了具有***连接体的示范性组合物的另一通式；
图3描述了用于双靶向神经内分泌瘤的一个示范性组合物；
图4a描述了来自图3的组合物300的合成路径概述；
图4b描述了图4a的合成路径的详细示意图；
图4c描述了生产称为组合物201(BG-PEG-MAT)和组合物202(BG-PEG-DAT)的另外两个示范性组合物的可能合成路径概述，其中生产使用了甲苯磺酸酯基团或乙醛；
图4d描述了生产图4c中所示组合物的另一合成路径概述，其中生产使用了甲苯磺酸酯基团或乙醛；
图4e描述了使用乙醛的图4c和图4d的合成路径详细示意图；
图4f描述了使用甲苯磺酸酯基团的图4c和图4d的合成路径详细示意图；
图5描述了曲线图，该图显示在采用对照或组合物300对老鼠进行多日治疗期间，当以1-10mg/kg的不同剂量皮下给药15天时，小鼠的体重没有显著变化；
图6描述了曲线图，该图显示与对照组的肿瘤体积增加相比，在皮下给药组合物300，以1-10mg/kg进行多日治疗期间，随着时间推移(15天)，小鼠内的肿瘤体积呈剂量依赖性减少；
图7a显示对照组中的老鼠图像，老鼠具有可视大型皮下肿瘤，以及提示伴有中枢行为改变的异常动物头部运动；
图7b显示用组合物300治疗的老鼠图像，且表明可视皮下肿瘤以剂量依赖性的方式明显减少或消失(肿瘤显著的收缩至消失)，连同已观察到的异常动物头部运动也消失；
图8为肿瘤重量与组合物300的剂量函数关系示意图，表示显示肿瘤收缩至肿瘤完全消失；
图9a为显示相对肿瘤体积和阻断血管生成与组合物300的剂量函数关系的肿瘤照片；
图9b为显示绝对肿瘤体积与组合物300的剂量变化的函数关系的肿瘤照片，证明在剂量水平为10mg/kg情况下，从明显的肿瘤收缩至消失；
图10为成神经细胞瘤癌细胞活性与组合物300的剂量变化的函数关系图，显示在剂量水平为10mg/kg情况下，癌细胞从活性丧失至完全丧失；
图11为成神经细胞瘤癌细胞坏死随组合物300的剂量变化的函数关系图，显示在剂量水平为3mg/kg和10mg/k情况下，癌细胞坏死增长80％-100％；
图12a为每日皮下给药3mq/kg，给药15天情况下，肿瘤重量收缩随采用不同苄胍衍生物进行治疗变化的函数关系图，该苄胍衍生物包括MIBG、BG和结合BG的聚合物，与对照(PBS溶媒)相比，显示出可比较的收缩，范围为40％-50％；
图12b为全部每日皮下给药3mg/kg，给药15天情况下，肿瘤重量收缩随采用苄胍给药、TAT衍生物给药、或BG-TAT衍生物联合给药与BG-P-TAT(组合物300)给药的治疗变化的函数关系图(数据证明采用BG、TAT或BG-TAT联合给药使肿瘤收缩40-50％，与之相比，采用BG-P-TAT(组合物300)肿瘤收缩80％，且采用BG-P-TAT使癌细胞最大丧失活性)；
图13a为在给药Cy5标记的偶联TAT的聚合物(组1)、偶联BG的聚合物(组2)、以及偶联BG-TAT的聚合物(组合物300、组3)的1小时和2小时后，各种小鼠的荧光图像照片；
图13b为给药后4小时、6小时和24小时后图13a小鼠的荧光图像照片(数据清楚地表明成神经细胞瘤中有明显且最高强度的富集(圈定和成像)，且用Cy5标记的偶联BG-P-TAT的聚合物(组合物300)涂布)；
图14描述了用于双靶向神经内分泌瘤的另一示范性组合物，其被称为组合物7a或dI-BG-P-TAT；
图15描述了用于双靶向神经内分泌瘤的另一示范性组合物，其被称为组合物7b或dM-BG-P-TAT；
图16描述了用于双靶向神经内分泌瘤的另一示范性组合物，其被称为组合物15或BG-P-PAT；
图17描述了来自图15和16中的组合物7a和组合物7b的合成路径概述；
图18描述了来自图16的组合物15的一部分合成路径概述；
图19描述了来自图16的组合物15的另一部分合成路径概述；
图20描述了各个示范性组合物的结合亲和力；
图21A描述了各个示范性组合物的细胞摄取；
图21B描述了各个示范性组合物的细胞摄取；
图22描述了与对照组的肿瘤体积增加相比，在3mg/kg皮下注射组合物7a、组合物7b和组合物15的多日(20天)治疗期间，小鼠肿瘤体积随着时间减少的曲线图；
图23描述了与对照组的肿瘤重量增加相比，在3mg/kg皮下注射组合物7a、组合物7b和组合物15的多日(20天)治疗期间，小鼠肿瘤重量随着时间减少的曲线图；
图24描述了与对照组相比，显示组合物7a、组合物7b、组合物15的疗效的组织学图像。
具体实施方式
本文通过范例的方式而不是参考附图的限制，给出了对上述所描述的公开组合物和方法具体实施例的详细内容。虽然显示和描述部分实施例的细节，但是应当理解可以在不脱离所附权利要求的范围的情况下进行各种更改和修改。本发明的范围绝不限于构成成分的数量、其材料、其形状、其颜色、其相对排列等，并且仅作为本发明的实施例的示例公开。对本实施例及其优点的更完整的理解可以通过参考以下与附图结合的描述来获得，其中类似的参考编号表示类似的特征。
作为发明内容的前言，应当注意，正如在本说明书和所附权利要求书中使用的那样，单数形式“个”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
概述
本发明的实施例描述了新的化学组合物及其合成方法。本文公开和描述的组合物可针对抗血管生成剂，特别是甲状腺整联蛋白拮抗剂，其可与整联蛋白αvβ3受体家族的一种或多种细胞表面受体相互作用。本文公开和描述的组合物也可以针对去甲肾上腺素转运体(也称为儿茶酚胺转运体)的靶标。去甲肾上腺素转运体的靶点可作为神经内分泌瘤细胞靶向剂。
本文公开和描述的组合物可针对包括甲状腺整联蛋白和去甲肾上腺素转运体靶标的组合物。此外，改组合物可使用聚合物或其他连接体，以连接甲状腺整联蛋白和去甲肾上腺素转运体靶标。
去甲肾上腺素转运体是正常生理中儿茶酚胺摄取的调节因子，且在成神经细胞瘤等神经内分泌瘤中高度表达和过度活跃。虽然去甲肾上腺素类似物间碘苄胍(MIBG)是去甲肾上腺素转运体的既定底物，但类似物如(123)I-MIBG/(131)I-MIBG或含有氟化物(F18)而不是碘化物(放射性)的类似物也可用于成神经细胞瘤和其他神经内分泌瘤的诊断成像。
研究表明，各种成神经细胞瘤细胞系高度表达αvp3整联蛋白受体(90-95％)。然而，高亲和力αvβ3整联蛋白受体拮抗剂在肿瘤生长速度和肿瘤活性抑制方面的效果是有限的(40-50％)。类似地，证明苯胍及其衍生物对成神经细胞瘤的抗癌效果有限，尽管其在成神经细胞瘤和其他的成神经细胞瘤肿瘤中的摄取最大(90-100％)。此外，去甲肾上腺素转运体靶标(如苄胍或其衍生物)与甲状腺整联蛋白拮抗剂(如***四碘甲腺乙酸衍生物)的联合治疗对成神经细胞瘤的生长和活性的抑制不超过50％。
相反且出乎意料地，将去甲肾上腺素转运体靶标(如苯胍衍生物)和甲状腺整联蛋白拮抗剂(如***四碘甲腺乙酸衍生物)通过不同的聚合物连接体(如聚乙二醇(PEG))偶联成单个的新型化学实体，导致在不同剂量下最大限度地被成神经细胞瘤和其他神经内分泌瘤摄取，并最大限度地(80-100％)抑制肿瘤的生长和活性。甲状腺整联蛋白拮抗剂通过连接体与去甲肾上腺素/儿茶酚胺转运体靶标化合物偶联，可提供对成神经内分泌瘤肿瘤靶向具有双重靶向作用的组合物。例如，根据本发明的一个实施例，该组合物可包括连接到苄胍(或苄胍衍生物)的α-V-β-3(αvβ3)整联蛋白-甲状腺激素受体拮抗剂。
本文描述的组合物可由化合物构成，例如甲状腺整联蛋白拮抗剂或其衍生物共价连接到去甲肾上腺素转运体靶标，形成单个化学实体。甲状腺整联蛋白拮抗剂和去甲肾上腺素靶标可以通过一个连接体连接。
可参照特定的甲状腺整联蛋白化合物和去甲肾上腺素化合物，例如四碘甲腺乙酸(tetrac)、三碘甲腺乙酸(triac)和苄胍。这些短语包括根据本发明全部教导的这类化合物的衍生物，即使没有将这类衍生物在本发明中特定列出。
参照附图，图1描述了通式100的实施例，该通式100包括通过连接体130连接至去甲肾上腺素转运体靶标120的甲状腺整联蛋白拮抗剂110。该组合物可被称为通过连接体130结合至苄胍衍生物的甲状腺整联蛋白拮抗剂衍生物，或用连接体130修饰结合至苄胍衍生物的甲状腺整联蛋白拮抗剂衍生物。图1描述了通式100的羧酸形式。对于本领域技术人员显而易见的是可以使用通式100的盐(例如钠盐)。
连接体130包括间隔基132和聚合物131。连接体130抗生物降解，如此使得连接体在生理条件下保持为不会裂解的。在一个实施例中，间隔基132包括CH2单元和毗邻的亚甲基(CH2)单元的重复连接，其可通过n1个重复进行限定，其中n1是≥0的整数。在其他实施例中，n1可以是≥1、≥2或≥3。连接体130还包括部分“Y”。在某些情况中，部分“Y”的实施例可以是氨基。例如，通式的Y部分可以是具有一个氨基基团的二价烷烃，或具有两个氨基基团的二价烷烃，如图2a和2b的通式200a和200b的实例所示。在另一个实施例中，Y部分可以是***，如图2c所示的通式200c的实例所示。聚合物131可能包括聚醚，例如聚乙二醇(PEG)。可使用其他聚合物，包括壳聚糖、海藻酸、透明质酸和其他聚合物。在使用PEG作为聚合物131的实施例中，该聚合物可能具有的分子量为200g/mol至4000g/mol。
本文中术语甲状腺拮抗剂描述了具有本领域技术人员已知的抑制或对抗一种或多种甲状腺激素受体的能力的化合物，例如甲状腺激素受体的整联蛋白家族，像甲状腺激素细胞表面受体αvβ3。甲状腺整联蛋白拮抗剂110可以是抗血管生成的甲状腺激素或甲状腺激素受体拮抗剂。例如，甲状腺整联蛋白拮抗剂110可以是α-V-β-3(αvβ3)整联蛋白-甲状腺激素受体拮抗剂。
甲状腺整联蛋白拮抗剂110的特定实施例可能包括四碘甲腺乙酸(tetrac)、三碘甲腺乙酸(triac)、其衍生物和其变量。在一些实施例中，包括tetrac和triac的甲状腺整联蛋白拮抗剂的一种或多种变量的实例可能包括二氨基四碘甲腺乙酸(DAT)、或二氨基三碘甲腺乙酸(DATri)(在下文中可以互换地称为“DAT”)、一氨基四碘甲腺乙酸(MAT)或一氨基三碘甲腺乙酸(MATri)(在下文中可以互换地称为“MAT”)、***四碘甲腺乙酸(TAT)或***三碘甲腺乙酸(TATri)(在下文中可以互换地称为“TAT”)，及其衍生物或本领域技术人员已知的其他甲状腺拮抗剂。甲状腺整联蛋白拮抗剂可能是在公开号为2017/0348425，标题为《与αvβ3甲状腺整联蛋白拮抗剂结合的不可裂解的聚合物》的美国专利中所述的类型，其内容通过引用并入本文。
基于图1的通式结构100的示范性甲状腺整联蛋白拮抗剂如下表1所示。
表1
在甲状腺整联蛋白拮抗剂110的一些实施例中，被描述为R5、R6、R7、和R8的变量可能各自独立地被例如氢、碘和烷烃的分子取代。在一些实施例中，烷烃具有四个或更少的碳。例如，如表1所示，在甲状腺整联蛋白拮抗剂110的一些实施例中，被描述为R5、R6、R7和R8的变量可能各自独立地被例如氢、碘和例如异丙基或异丁基的烷烃基团的分子取代。在表1的实施例中，烷烃具有四个或更少的碳。
去甲肾上腺素转运体靶标120可能是神经内分泌瘤细胞靶向剂。作为一个示例，去甲肾上腺素转运体靶标120可能是苄胍或苄胍衍生物。作为另一个示例，去甲肾上腺素转运体靶标120可能是N-苄胍或其衍生物。
基于来自图1的通式100的示范性去甲肾上腺素转运体靶标120在下面的表2中示出。
表2
在去甲肾上腺素靶标120的一些实施例中，被描述为R1、R2、R3、和R4的变量可能各自独立地被例如氢、碘、氟、溴、甲氧基基团、硝基基团、氨基基团和腈基团的分子所取代。例如，在去甲肾上腺素转运体靶标120的一些实施例中，被描述成R1、R2、R3和R4的变量可能各自独立地被例如氢、碘、氟、溴、甲氧基基团、硝基基团、氨基基团和腈基团的分子取代，如表2中所描述。还可使用其他实施例和取代基。在一个实施例中，R1、R2、R3和R4中的至少一个是放射性标记的。合适的放射性标记的示例包括I(123)、I(131)和F(18)。该化合物可以施用于人类或动物。
通过连接体130，可将任何示范性的甲状腺整联蛋白拮抗剂110(以及本文中教导的任何其他甲状腺整联蛋白拮抗剂实施例)连接至任何示范性的去甲肾上腺素转运体靶标120(以及本文中教导的其他任何去甲肾上腺素转运体靶实施例)，来形成组合物。
从表1和表2清楚看到，在组合物中，有许多可用作甲状腺整联蛋白拮抗剂110的化合物以及有许多可用作去甲肾上腺素转运体靶标120的化合物。此外，多种甲状腺整联蛋白拮抗剂110可以与多种去甲肾上腺素转运体靶标120结合，从而导致本文中所述组合物具有许多可能的化学结构。
本文中所述的每种组合物的实施例可能具有多种类型的用于治疗由血管生成或其抑制所调节的若干种不同疾病的功用。鉴于在所述组合物中存在甲状腺整联蛋白拮抗剂110，本发明中描述的每种组合物可能具有对位于遍及人体和多种动物体内的众多类型细胞上的靶向整联蛋白受体αvβ3的高度亲力。
此外，在本发明中所述的每种组合物的实施例可能具有治疗以去甲肾上腺素转运体的活性为特征的多种不同疾病的功用。鉴于在所述组合物中存在去甲肾上腺素转运体靶标120，本发明中所述的每种组合物可能各自具有靶向在众多类型细胞的亲和力，发现这些细胞在利用去甲肾上腺素转运体的整个人体和多种动物体内。本发明中所述的每种组合物可能对表现出去甲肾上腺素转运体，例如神经内分泌瘤细胞的增强的或高于平均活性的靶向细胞具有增强的亲和力。作为更具体的实例，该组合物对靶向成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤细胞可具有增强的亲和力。
更进一步，由于该组合物一起使用甲状腺整联蛋白拮抗剂110和去甲肾上腺素转运体靶标120，该组合物对于对抗某些疾病和/或情况具有增强的功用和疗效。例如，神经内分泌瘤对用甲状腺整联蛋白拮抗剂进行治疗敏感，同时还表明去甲肾上腺素转运体的活性增加。本文中所述的组合物使用两个化合物，在对神经内分泌瘤细胞治疗中具有双靶向疗效。此外，增加的疗效超过通过用甲状腺整联蛋白拮抗剂和去甲肾上腺素转运体靶标的同时单独治疗所预期或实现的任何增加疗效。关于有益功用的更多细节将在下面在实验研究方面进行讨论。
如图1的通式100的化学结构所示，化学结构的实施例可能包括一个或多个变量，该变量限定通式100的甲状腺整联蛋白拮抗剂110的额外特征。例如，在甲状腺整联蛋白拮抗剂110的一些实施例中，被描述成R5、R6、R7和R8的变量可能各自独立地是上述表1中所示的氢、碘和烷烃。
因此，有很多种可用作通式100的甲状腺整联蛋白拮抗剂110的甲状腺整联蛋白拮抗剂化合物。例如，如图2a所示，甲状腺整联蛋白拮抗剂110a可能包括用于R5-R8的碘取代基，导致形成具有3个碳连接体和一氨基作为Y部分的四碘甲腺乙酸(tetrac)衍生物。通式200a可能称为通过PEG连接至苄胍或苄胍衍生物的一氨基四碘甲腺乙酸(MAT)。同样地，在图2b中，四碘甲腺乙酸分子还包括连接至碳连接体的二氨基Y部分。该通式200b可能称为通过PEG结合至苄胍或苄胍衍生物的二氨基四碘甲腺乙酸(DAT)。在图2c的另一实施例中，通式200c可包括连接至碳连接体的单个碳的***部分。该通式200c可称为通过PEG连接至苄胍或苄胍衍生物的***四碘甲腺乙酸(TAT)。
其他甲状腺整联蛋白拮抗剂化合物可以用于本文中所述组合物的形成。例如，可使用甲状腺整联蛋白拮抗剂110a、110b和110c的一般结构，其中仅R5-R7包括碘，从而提供类似的三碘甲腺乙酸衍生物。此外，如上表1所示，可使用类似的结构，其中甲状腺整联蛋白拮抗剂包括其他元素或官能团的取代基，用于R5-R8中的任意一个和/或全部。
去甲肾上腺素转运体靶标120可能包括苄胍或苄胍衍生物。去甲肾上腺素转运体靶标120的化学结构的实施例可能包括一个或多个变量，限定如图1所示的通式100的去甲肾上腺素转运体靶标120的额外特征。例如，在去甲肾上腺素转运体靶标120的一些实施例中，描述成R1、R2、R3和R4的变量可能各自独立地被上述表2中的氢、碘、氟、溴、甲氧基、硝基基团、氨基基团、和腈基团分子所取代。
图3描述了通式100的示范性组合物300。组合物300包括结合至苄胍修饰的PEG的***四碘甲腺乙酸。组合物300也可称为BG-PEG-TAT或BG-P-TAT。
下面将主要参照图3中所示的示范性组合物，即组合物300来展示本文中所述组合物的合成。类似组合物，即组合物201和组合物202(见图4c-4f)的合成也被提供为实例，并且不限制本发明于此类组合物。
实例1a：示范性组合物300的合成
该实例提供了制备图3中所示组合物300的取样方法。组合物300被称为BG-PEG-TAT或BG-P-TAT。组合物300具有的化学名称为2-(4-(4-(1-(20-(4-(胍基甲基)苯氧基)-3，6，9，12,15，18-六氧二十烷基)-1H-1,2,3-***-4-基)甲氧基)-3,5-二碘苯氧基)-3，5-二碘苯基)乙酸，或[4-(4-{1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-胍基甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-1H-[1，2,3]***-4-基甲氧基}-3,5-二碘-苯氧基)-3,5-二碘-苯基]-乙酸。组合物300的分子量为1284.44g/mol。
所有市售的化学制品无需进一步纯化而使用。干燥所有溶剂，使用激活的分子筛(0.3nm或0.4nm，取决于溶剂的类型)来获得无水溶剂。所有反应(如非特别包含作为反应物、溶剂或共溶剂的水)均在Ar或N2气氛下，在烘干的玻璃器皿中进行。所有新的化合物均提供令人满意的1H HMR和质谱分析结果。熔点在电热MEL-TEMP熔点测定仪上测定，接着在Thomas HOOVER Uni-mel毛细管熔点测定仪上测定。在Thermo Electron NicoletAvatar330FT-IR设备上记录红外光谱。紫外光谱是从SHIMADZU UV-1650P紫外-可见分光光度计上获得。全部溶液态NMR试验都在伦斯勒理工学院(RPI，Troy，NY)生物技术跨学科研究中心，由配备有z轴梯度(Bruker BioSpin，Billerica，MA)低温冷却探针(TCI)的BrukerAdvance II 800MHz分光仪执行。使用的所有管的外直径为5mm。NMR数据将参照三氯甲烷(CDCl3；7.27ppm1H，77.20ppm 13C)或DMSO-d6(＝2.50ppm，38.92ppm 13C)作为内部标准。化学位移δ以ppm为单位；重数表示为s(单峰)、d(双峰)、t(三峰)、q(四峰)、m(多重峰)和br(宽泛)；耦合常数J用Hz表示。在种有荧光指示剂的硅胶板上进行薄层色谱。可视化是通过紫外光(254nm和/或365nm)和/或通过在钼酸铈铵或硫酸溶液中染色实现的。跟随J.Org.Chem.43，14，1978，2923-2925中指示步骤，用230-400目硅胶执行快速柱层析。在应用生物***API4000 LC/MS/MS或应用生物***QSTAR XL质谱仪上执行高分辨率质谱分析。
该实例使用丙炔化四碘甲腺乙酸(PGT)。在公开号为2017/0348425，标题为《与αvβ3整联蛋白甲状腺拮抗剂结合的不可裂解的聚合物》的美国专利中描述了由四碘甲腺乙酸制备PGT或其衍生物，其内容通过引用并入本发明。
图4a描述了组合物300的合成路径概述。
图4b描述了来自图4a的合成路径的详细示意图。图4a显示了合成组合物300的方案，以通过链接化学，将四碘甲腺乙酸类似物结合到苄胍修饰的PEG作为实例。可使用其他合成路径。
下面将更详细描述图4b中所示组合物300的合成方案的各个步骤，其中中间产物用在链接化学方案中所示的数字表示。
异源双功能的PEG的合成。虽然异源双功能的连接体是市售的，但是出于本实例的目的，使用下列合成路线进行制备：
产物2，即[(4-羟苯基)-甲基]氨基甲酸叔丁酯2的合成。
根据先前公开的保护方法{1)ACS Medicinal Chemistry Letters，8(10)，1025-1030；2017.2)European Journal of Medicinal Chemistry,126，384-407；2017.3)Tetrahedron Letters，47(46)，8039-8042；3006}来合成[(4-羟苯基)-甲基]氨基甲酸叔丁酯，其内容在此通过引用的方式并入。在室温下，产物1，4-羟苯基胺(0.62g，5mmol)随着搅拌缓慢加入至二碳酸二叔丁酯(1.2g，5.1mmol)溶液中。在搅拌反应混合物8小时后，通过柱层析[SiO2：EtOAc/己烷(1：4)]，将油状残留物纯化，以得到0.82g无色油状物N-Boc-4-羟基苄胺，产率71％。
产物3的合成将叔丁氧羟基-4-羟基苄胺醚化成溴代-叠氮修饰的PEG(400)3
在室温、搅拌下，将CsCO3(867mg，2.67mmol，3eq)添加至溶解于CAN(25mL)的叔丁氧羰基-4-羟基苄胺(300mg，0.896mmol，1eq)溶液中。将反应混合物搅拌30分钟后，将溴代-叠氮修饰的PEG(400)(445mg，1.05mmol，1.2eq)添加至混合物中，然后升温直至回流24小时。过滤，移除过量CsCO3。在减压下，移除溶剂，然后通过柱层析[SiO2：EtOAc/己烷(5：5)]纯化油状残留物，以得到黄色油状物产物3。产量：433mg，87％。
产物4的合成。BOC去保护
在室温下，将产物3(100mg，0.179mmol，3eq)溶解于3ml的无水1，4-二氧己环中，添加3ml的HCl(4N，溶于二氧己环)并搅拌。24小时后，在减压下移除溶剂，纯化油状残留物，以定量得到黄色油状产物4(产量：73g，90％)
产物5的合成。产物4的胍基化反应
将产物4(85mg，0.17mmol，1eq)N，N’-双-Boc-1H-吡唑-1-甲脒(54mg，17mg，1eq)溶解于3ml至4ml无水二乙碳二亚胺“DCM”，然后将三乙胺“TEA”(48μl，0.35mmol，2eq)添加至溶液中。在室温下搅拌反应混合物12小时。完成反应后，在减压下移除溶剂，残留物溶解于EtOAc(30ml)。用％5HCl(25ml)和卤水(25ml)清洗，接着干燥(Mg2SO4)。在减压下，移除溶剂，获得产物5，通过柱层析[SiO2：EtOAc/己烷(2：8)]纯化，产量：92mg，80％。
产物6的合成
将产物5(100mg，1eq)和leq的PGT溶解于THF中，搅拌5分钟，然后将溶于2ml水的0.5eq抗坏血酸钠和0.5eq硫酸铜添加至混合物中，在65℃下搅拌24小时。24小时后，在减压下，移除溶剂，纯化产物6，产率：65％。
组合物300，即2-(4-(4-((1-(20-(4-(胍基甲基)苯氧基)-3，6，9，12,15，18-六氧二十烷基)-1H-1，2，3-***-4-基)甲氧基)-3,5-二碘苯氧基)-3,5-二碘苯基)乙酸)的合成
将产物6(50mg)溶解于3ml无水1，4-二氧己环中，添加3ml HCl(4N，溶于二氧己环)，在40℃下搅拌。24小时后，在减压下，移除溶剂，纯化油状残留物，以得到黄色粉末状的组合物300。
可使用其他合成方法，来得到组合物300或得到其他具有图1中所示的通式100的组合物。
实例1b：其他示范性组合物的合成
图4c和4d描述了其他示范性组合物的合成路径概述，例如使用甲苯磺酸酯基团或乙醛，遵循通式200a的组合物201，和遵循通式200b的组合物202。
组合物201可称为BG-P-MAT、BG-PEG-MAT或通过PEG结合至一氨基四碘甲腺乙酸的苄胍。组合物202可称为BG-P-DAT、BG-PEG-DAT或通过PEG结合至二氨基四碘甲腺乙酸的苄胍。如本文中所描述的，可使用苄胍衍生物或其他去甲肾上腺素转运体靶标。如本文中所描述的，也可使用四碘甲腺乙酸衍生物或其他甲状腺整联蛋白拮抗剂，包括但并不限于三碘甲腺乙酸和三碘甲腺乙酸衍生物。
图4e和4f描述了来自图4c和图4d的合成路径详细示意图。图4e和4f显示了组合物201和202的合成方案，其作为通过链接化学将四碘甲腺乙酸结合至苄胍修饰的PEG的另一实例。此外，可使用其他合成路径。
使用方法
本文中公开的组合物(包括但并非限制于示范性组合物，如组合物300、组合物201、和组合物202)在治疗癌症细胞和肿瘤，特别是治疗神经内分泌瘤，例如成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤中表现出新型的双靶向。此外，当与单独使用或单独给药的甲状腺整联蛋白拮抗剂或去肾上腺素转运体靶标，即没有结合成单个组合物相比较，组合物显示对抗神经内分泌瘤肿瘤细胞增强的疗效。
还可将组合物用于对癌细胞/肿瘤成像。例如，可使用本文中所描述的组合物，对成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤成像。成像可能满足诊断和/或治疗监控。此外，可将组合物同时用于治疗和成像。例如，组合物可显示出在靶向的癌细胞/肿瘤中增加保留，使得能够强化治疗且更有效成像。
实例2：对雌性裸鼠皮下移植瘤的影响
使用移植到雌性裸鼠的成神经细胞瘤SKNF2细胞，测试组合物300(BG-P-TAT)的疗效。
移植十五只(15)雌性裸鼠两次，每次植入106个细胞。将SKNF2细胞系用于皮下异种移植。
移植八(8)天后，小鼠被划分成四组，接受下列治疗15天：
组别 治疗化合物 剂量
组1 对照-PBS
组2 组合物300(BG-PEG-TAT) 1mg/kg
组3 组合物300(BG-PEG-TAT) 3mg/kg
组4 组合物300(BG-PEG-TAT) 10mg/kg
在治疗十五(15)天，收集肿瘤，以便评估组织病理学，并收集下列结果：
图5显示对照和组合物300(BG-PEG-TAT)的治疗对移植有SKNF2细胞系的小鼠体重的影响。如图所示，所有组的体重是一致的。数据表明每日用1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的不同剂量的组合物300(BG-PEG-TAT)进行每日治疗持续15天，与对照动物相比动物体重没有影响。
图6显示组合物300(BG-PEG-TAT)治疗与对照对移植有SKNF2细胞系的小鼠的肿瘤体积的影响。如图所示，在治疗15天后，对照组显示出肿瘤体积从大约825mm3增长至1050mm3。接受用组合物300(BG-PEG-TAT)治疗的所有组显示肿瘤大小减小。此外，接受用组合物300(BG-PEG-TAT)治疗的组显示肿瘤大小呈剂量依赖性减小，采用10mg/kg的组显示肿瘤大小从大约825mm3减小至100mm3。
图7a-7b包括来自每个治疗组的小鼠的照片，在其中可以在视觉上比较皮下肿瘤70。如图7a中所示，对照组显示大且清晰可见的肿瘤70。对照动物还显示异常的盘旋(头部旋转)79，这在所有治疗组中都没有。异常的盘旋被认为是肿瘤对中枢神经***的影响。
如图7b中所示，治疗组在10mg/kg剂量下，显示肿瘤70大小呈明显的剂量依赖性减小，直至完全消失。如图所示，在10mg/kg治疗组中，在位于肿瘤位置70’处没有任何可见的肿瘤。
图8显示对照与组合物300(BG-PEG-TAT)治疗对移植有SKNF2细胞系的小鼠的肿瘤重量的影响。可以看到，与对照组相比，治疗组显示肿瘤重量呈剂量依赖性减少。数据显示在剂量为1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg下，肿瘤收缩分别为60％、80％和100％。
图9a和图9b显示对照与组合物300(BG-PEG-TAT)治疗对移植有SKNF2细胞系的小鼠的脉管***和肿瘤大小的影响。如图所示，对照组显示出随着血管形成的增加，肿瘤70的大小显著增加。对照组肿瘤70的血管化区域90清晰可见。相反，治疗组显示肿瘤70的大小呈剂量依赖性减小，包括在剂量为10mg/kg下的肿瘤收缩。如图所示，还清楚地减少了肿瘤脉管***。实际上，如图9b所示，对于10mg/kg的组，在植入肿瘤70’处(见图7b)只有坏死的皮肤75需要去除以进行组织病理组织学检查；此剂量的治疗证明肿瘤收缩。
图10显示对照与组合物300(BG-PEG-TAT)治疗对移植有SKNF2细胞系的小鼠的肿瘤细胞活性的影响。如图所示，治疗组显示出肿瘤细胞活性呈剂量依赖性减小。对照中，显示细胞活性为70％-75％，肿瘤中心为20％-30％的坏死。相反，以1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的不同剂量下分别进行组合物300(BG-PEG-TAT)每日治疗，治疗15天，显示出细胞活性丧失分别至50％、20％和0.00％。在治疗15天后，10mg/kg剂量组证明全都没有可视肿瘤细胞。
图11显示对照与组合物300(BG-PEG-TAT)治疗对移植有SKNF2细胞系的小鼠的肿瘤坏死的影响。可以看出，治疗组显示肿瘤细胞坏死呈剂量依赖性增加。10mg/kg组证明肿瘤细胞坏死率接近100％，3mg/kg组表明肿瘤细胞坏死率大约为80％，1mg/kg组证明肿瘤细胞坏死率大约为50％。
实例3：比较实例
图12a和12b显示与采用组合物300(BG-PEG-TAT)治疗相比较，对照和采用BG、BG衍生物、例如TAT衍生物的甲状腺整联蛋白拮抗剂，及其组合物(联合给药)治疗对移植有SKNF2细胞系的小鼠的肿瘤细胞坏死的影响。
总之，与组合物300(BG-PEG-TAT)相比较，已知的***细胞的甲状腺整联蛋白拮抗剂获得实质上较差的结果。例如，每日以3mg/kg皮下给药***四碘甲腺乙酸衍生物，持续三(3)周，显示出肿瘤生长降低大约为40％-50％，且肿瘤活性降低大约为40％-50％。类似地，显示出***四碘甲腺乙酸衍生物对肿瘤生长降低大约40％-50％，且使肿瘤活性降低大约40％-50％。此外，即使每日以3mg/kg皮下给药两种***四碘甲腺乙酸衍生物的组合进行联合治疗，持续三(3)周也仅实现将肿瘤生长和肿瘤活性降低40％-50％。使用苄胍和苄胍衍生物治疗获得类似的结果。此外，即使苄胍和甲状腺素整联蛋白拮抗剂进行联合治疗也无法表明增加的疗效超过40％-50％的关口。
相反，采用组合物300(BG-PEG-TAT)的治疗导致肿瘤减少80％，其中残余的肿瘤活性降低了80％。
比较实例3a：TAT衍生物对肿瘤重量的影响：
在神经内分泌瘤，例如成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤的情况中，就肿瘤生长速率和癌活性抑制方面而言，αvβ3整联蛋白受体拮抗剂(甲状腺整联蛋白拮抗剂)显示有限的功效(40％-50％)。例如，图12b的图表包括当与对照组(磷酸盐缓冲液“PBS”)相比较时，***四碘甲腺乙酸衍生物(被称为TAT)对肿瘤体重的影响。被测试的特定衍生物为β环糊精***四碘甲腺乙酸。如图所示，3mg/kg剂量导致肿瘤重量大约降低40％-50％。
比较实例3b：苄胍及其衍生物对肿瘤重量的影响
类似地，在神经内分泌瘤，例如成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤的情况中，就肿瘤生长速率和癌活性抑制方面而言，苄胍和其衍生物显示有限的功效(40％-50％)。例如，图12a中的图表包括当与对照组(PBS)相比较时，苄胍(BG)和苄胍衍生物(例如MIBG和结合苄胍的聚合物(特别是PLGA-PEG-BG，被称为聚合物-BG))对肿瘤体重的影响。尽管治疗化合物最大量(90％-100％)被摄入到成神经细胞瘤和其他神经内分泌瘤中，但其表现出有限的成神经细胞瘤的抗癌疗效。
比较实例3c：分开的去甲肾上腺素转运体靶标和甲状腺整联蛋白拮抗剂的联合给药的影响
此外，包括如苄胍或其衍生物的去甲肾上腺素转运体靶标与如***四碘甲腺乙酸衍生物甲状腺整联蛋白拮抗剂的共同给药的联合治疗对成神经细胞瘤生长和活性的抑制不超过40％-50％。例如，如图12b中所示，通过使用任一化合物单独进行治疗(BG+TAT)显示，苄胍联合四碘甲腺乙酸衍生物的一起给药(BG+TAT)没有超过40％-50％的疗效。此外，β环糊精***四碘甲腺乙酸为已使用的四碘甲腺乙酸衍生物。
比较实例3d：组合物300(BG-P-TAT)(通过PEG结合至TAT的苄胍)的影响
此外，与图12b中所示的对照组和其他类型治疗相比较，采用组合物300(BG-P-TAT)治疗导致肿瘤重量显著提高的效果。组合物300实现了肿瘤大约80％的减少。此外，残留肿瘤的活性下降了80％。实际上，组合物300(结合至BG的TAT)显示出显著增加的疗效，甚至超过了分开给药TAT和BG(BG+TAT)的联合给药。
在下列表3中总结来自图12a和12b的比较实例：
表3
实例4：在无胸腺的雌性小鼠中皮下移植肿瘤的成像
对无胸腺的雌性小鼠移植两次，每次106个细胞/移植。SKNF1细胞系用于皮下异种移植。
组1由三只小鼠构成，采用PEG-TAT-染料(Cy5)治疗。组2由三只小鼠构成，采用PEG-BG-染料(Cy5)治疗。组3由三只小鼠构成，采用TAT-PEG-BG-染料(Cy5)治疗，其中TAT和BG用PEG连接体共价连接，作为化合物300。治疗组如下所示：
在给药后1小时、2小时、4小时、6小时和24小时进行荧光成像(Cy5)。图13a和13b中示出成像结果，其中肿瘤位置用黄色圈出，Cy5染料呈现为红色。如这些图中所示，当TAT和BG共价连接时，荧光信号有急剧增加，当与单独的***四碘甲腺乙酸衍生物或单独的苄胍衍生物相比较时，组合物300显示SKNF1成神经细胞瘤内的摄取和在肿瘤内的保留时间均显著提高。
成神经内分泌瘤肿瘤细胞用于所述治疗实例中。对于本领域技术人员可以理解这些实例是用于治疗其他肿瘤类型的有效模型，特别是其他神经内分泌瘤肿瘤的有效模型。此外，可通过公开的组合物治疗任何表示出去甲肾上腺素转运体的活性增加的肿瘤或疾病状态，其中期望甲状腺整联蛋白调节抗血管生成的活性。
根据这些实例，本文中所述的组合物显示对肿瘤细胞，特别是神经内分泌瘤的疗效增加。例如通过注射、局部、舌下、口服和其他给药路线，可使用这些组合物治疗神经内分泌瘤，例如成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤。
其他示范性化合物
如上所述，基于一般结构100的组合物可能包括在R1-R8的变量和/或在连接体130中的变量，例如在间隔基132、聚合物131、和/或Y部分中的变量。下面将更详细地讨论包括这些变量的示范性实施例。这些示范性实施例并不旨在将本发明限制为具体提出的任何实施例。相反，为了说明的目的，描述了各种实施例，并且并不打算详尽描述各种实施例或将各种实施例限于所公开的实施例。对于本领域普通技术人员而言，许多修改和变化将是显而易见的，而不会偏离所述实施例的范围和精神。
图14描述了通式100的示范性组合物7a。组合物7a包括结合至苄胍修饰的PEG的***四碘甲腺乙酸，其中选择碘基团作为苄胍芳香环上的取代基。组合物7a可能还被称为dI-BG-PEG-TAT或dI-BG-P-TAT。
图15描述了通式100的示范性组合物7b。组合物7b包括结合至苄胍修饰的PEG的***四碘甲腺乙酸，其中选择甲氧基基团作为苄胍芳香环上的取代基。组合物7b可能还被称为dM-BG-PEG-TAT or dM-BG-P-TAT。
图16描述了通式100的示范性组合物15。组合物15包括结合至苄胍修饰的PEG的四碘甲腺乙酸，其中Y部分的氨基是哌嗪。组合物15可能还被称为BG-PEG-PAT或BG-P-PAT，其中PAT称为哌嗪四碘甲腺乙酸。
下面演示这些组合物的合成。
实例5：组合物7a和组合物7b的合成
如方案1所述，完成dI-BG-P-TAT(组合物7a)和dM-BG-P-TAT(组合物7b)的合成。用二碳酸二叔丁酯保护了碘和甲氧基取代的4-羟基苄胺的氨基基团。化合物2a和化合物2b用1H-NMR进行了表征。在1.49ppm处观察到的峰属于叔丁氧基羰基(Boc)质子。在接下来的反应中，化合物2a和化合物2b在回流条件下，且K2CO3和ACN存在的情况下，与市售的Br-PEG6-N3反应，得到化合物3a和化合物3b，产率分别为90％和85％。化合物3a和化合物3b的1H-NMR谱显示PEG质子峰在3.40-3.97ppm之间。接着，在4N HCl(在二氧己环中)中去保护氨基基团，通过4a和4b的1H NMR谱在1.48和1.49ppm处的Boc质子信号消失来证实产物。在下面的步骤中，N,N′-双-Boc-1H-吡唑-1-甲脒与化合物4a和化合物4b反应，得到Boc保护的胍类化合物5a和胍类化合物5b。化合物5a和化合物5b的1H-NMR谱分别在1.49-1.52ppm和150-1.52ppm处清晰地显示出峰值，这两个峰可以归属于两个不同的Boc基团的质子。
方案1：化合物7a和化合物7b的合成图。a)Boc2O，6h；b)K2CO3,ACN，Br-PEG6-N3，回流，24h；c)HCl(4N，在二氧己环中)，室温，4h；d)DCM,TEA,N,N′-双-Boc-1H-吡唑-1-甲脒，室温，12h；e)PGT，THF：水4：1，硫酸钠，抗坏血酸钠，室温，24h；f)HCl(4N，在二氧己环中)，室温，24h。方案1如图17所示。
接着，含叠氮的化合物5a和化合物5b与丙炔化四碘甲腺乙酸(末端含炔的四碘甲腺乙酸，PGT36)结合，通过点击反应形成***环，得到化合物6a和化合物6b。使用在THF：水(4：1)中的CuSO4/抗坏血酸钠(0.3eq：0.6eq)，室温下原位生成Cu+。化合物6a和化合物6b的1H-NMR谱分别在8.59和8.60ppm处出现了***环质子的特征单峰。最后，用4NHCl(在二氧己环中)除去Boc保护基团，用甲醇：水(70：30)，反相柱层析纯化产物，得到化合物7a和化合物7b。化合物7a和化合物7b的1H-NMR(图S21、S23)，13C-NMR和质谱证实了这些化合物的结构。
实例6：组合物15的合成
如方案2中所述，完成BG-P-PAT 15的合成。首先，用Boc基团对4-羟基苄基胺的氨基基团进行保护。接着，Br-PEG7-OH在回流温度下，且在K2CO3和ACN存在的情况下，与9的酚羟基反应得到10，并用1H-NMR对其进行表征，观察在3.6-3.8ppm处的PEG质子峰。
方案2：化合物15的合成图。a)Boc2O，6h；b)K2CO3，ACN，Br-PEG7-OH回流，24h；c)对甲苯磺酰氯(Tos-Cl)，DCM，TEA，0℃-室温，2h；d)化合物19(见方案3)，ACN，K2CO360℃，18h；e)HCl(4N，在二氧己环中)，室温，4h；f)DCM，TEA，N,N′-双-Boc-1H-吡唑-1-甲脒，室温，12h；G)二氧己环：水；浓HCl，室温，24h。方案2如图18所示。
使用不同的方法引入PEG上的四碘甲腺乙酸单元(方案3)。首先，四碘甲腺乙酸16的羧酸基团在MeOH和SOCl2中转为为甲酯，来获得17。然后在ACN中与4-(3-(甲磺酰氧基)丙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯盐酸盐18和作为碱的Cs2CO3反应，再用HCl (4 N，在二氧己环中)溶液处理以去保护Boc基团。所得化合物19的结构用1H-NMR进行了表征。在7.32和8.04ppm处观察到四碘甲腺乙酸的芳香族质子，在2.77和2.94ppm处可以观察到哌嗪质子。
方案3.化合物19的合成图。a)SoCl2，MeOH；b)17，ACN，Cs2CO3，60℃，18h；c)4N HCl在二氧己环中，2h。方案3如图19所示。
在K2CO3和ACN存在下，将PEG-OH 10进行甲苯磺酰化反应后，将化合物19(方案2)引入PEG单体，得到化合物12。化合物12的1H-NMR谱图(图S40)证实了该结构，分别在7.18-7.79和6.88-7.20处观察到四碘甲腺乙酸和N-Boc苄胺的芳香质子峰。在对化合物12进行N-Boc去保护后，以DCM和TEA中的N,N′-双-Boc-1H-吡唑-1-甲脒作为碱，化合物13的游离胺引入Boc保护的胍基，得到化合物14。最后用溶于二氧己环：水中的浓盐酸水解甲酯和Boc保护基团，生成所需的化合物15。化合物15的1H-NMR(图S46)和质谱证实了其结构。最终合成产物7a、7b和15的纯度通过HPLC确定，均为>95％。
化合物dI-BG-P-TAT(7a)、dM-BG-P-TAT(7b)以及BG-P-PAT(15)对纯化的整联蛋白αvβ3受体显示了相对较高的结合亲和力，而与IC50为10.3nM的BG-P-TAT相比较，这些化合物具有较低的ICa0值，分别为1.1nM、0.5nM、0.3nM。因此，相对于BG-P-TAT，化合物15BG-P-PAT显示的结合亲和力增长了大约30倍。图20显示了对纯化后的整联蛋白αvβ3受体的各自的结合百分率。
另外，该化合物在体外细胞摄取(SK-N-F1神经母细胞瘤细胞)中的表现与BG-P-TAT的类似。摄取以图表的方式在图21A和21B中显示。
对化合物7a、化合物7b和化合物15还进行了分子对接研究。分子对接结果显示分子在结合位点呈弯曲结构。相互作用和对接分析表明，化合物15与整联蛋白β3亚基具有最佳的相互作用速率，具有-14.4kcal/mol的高结合能，并形成9个氢键；而化合物7a和化合物7b与整联蛋白β3亚基的结合能分别为-6.1kcal/mol和-7.8kcal/mol，化合物7a形成6个氢键(与αv结构域形成1个氢键，与β3结构域形成5个氢键)，化合物7b形成6个氢键(与αv结构域形成1个氢键，与β3结构域形成4个氢键，与Mn原子形成1个氢键)。化合物7a、化合物7b和化合物15的能量值，以及参与相互作用的结合能和残基列于表4。化合物15对αvβ3的结合亲和力相比接近的类似物BG-P-TAT高30倍，这可能是由于化合物15的BG部分与Asp-127和Asp-126之间有额外的氢键。这可能是由于BG-P-PAT中连接体链较长，使得BG-P-PAT的BG部分比BG-P-TAT中的BG更容易进入该结构域。同样哌嗪氮的额外氢键也会增加BG-P-PAT对αvβ3结合亲和力。
表4：化合物与整联蛋白αvβ3的结合能
使用方法
实例7：对雌性裸鼠皮下植入肿瘤的影响
组合物7a(dI-BG-P-TAT)、组合物7b(dM-BG-P-TAT)和组合物15(BG-P-PAT)的功效通过植入雌性裸鼠中的成神经细胞瘤SKNF1细胞进行测试，类似于上述组合物300(BG-P-TAT)的示例。
在以3mg/kg的剂量治疗二十(20)天后(由于皮肤刺激和身体不适，用组合物7a治疗7天)，收集肿瘤以评估组织病理学，并收集以下结果：
图22显示了与对照相比，组合物7a(dI-BG-P-TAT)、组合物7b(dM-BG-P-TAT)、组合物15(BG-P-PAT)对移植有SKNF1细胞系的小鼠肿瘤体积的疗效。如图所示，与对照相比，两个完成的治疗组(组合物7b(dM-BG-P-TAT)和组合物15(BG-P-PAT))肿瘤体积减小。对照组在20天内从175mm3增加到1000mm3，而完成的治疗组的肿瘤体积没有明显增加。
图23显示了与对照相比，组合物7a(dI-BG-P-TAT)、组合物7b(dM-BG-P-TAT)、组合物15(BG-P-PAT)对移植有SKNF1细胞系的小鼠肿瘤重量的疗效。如图所示，与对照相比，完成的治疗组显示肿瘤重量减少。数据显示，对于组合物15(BG-P-PAT)，肿瘤重量减少90％；对于组合物7b(dM-BG-P-TAT)，肿瘤重量减少86％。对于组合物7a(dI-BG-P-TAT)，停止治疗的治疗组也显示肿瘤重量减少了67％。
此外，为了比较未经治疗组和治疗组的肿瘤组织病理学变化，对肿瘤切除、固定、并用苏木精和伊红(H&E)染色。如图所示，与对照相比，在低倍镜下，可清晰看到用化合物7a、化合物7b和化合物15治疗的动物肿瘤的坏死。染色显示大面积坏死、纤维化和细胞碎片，约为98％(组合物15BG-P-PAT)、85％(组合物7b dM-BG-P-TAT)和70％(组合物7a dI-BG-P-TAT)。另一方面，来自未经治疗组的肿瘤大多是活的肿瘤细胞。在高倍镜下(40倍)，用组合物15BG-P-PAT治疗的肿瘤显示大面积坏死被正常组织取代。(同样，化合物7a dI-BG-P-TAT只给药7天，而其他两个方案给药20天)。
成神经细胞瘤被用于所讨论的治疗实例中。本领域技术人员将理解这些实例是用于治疗其他肿瘤类型，特别是其他神经内分泌瘤的有效模型。此外，可通过所公开的组合物来治疗任何显示去甲肾上腺素转运体活性增加的肿瘤或疾病状态，其中甲状腺整联蛋白可期望调节抗血管生成活性。
根据这些实施例，本文所描述的组合物对肿瘤细胞，特别是神经内分泌瘤显示出了增强的功效。这些组合物可用于治疗神经内分泌瘤，如成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤，例如通过注射给药、局部给药、舌下给药、口服和其他给药途径。
为了说明的目的，描述了本发明的各种实施例，但并不打算详尽描述各种实施例或将各种实施例限于所公开的实施例。对于本领域普通技术人员而言，许多修改和变化将是显而易见的，而不会偏离所描述的实施例的范围和精神。选择本文使用的术语是为了最好地解释实施例的原理、实际应用或超过市场上发现关于技术的技术改进，或使本领域普通技术人员能够理解本文公开的实施例。

Claims (20)

1.一种组合物，包括：
通式化合物
或其盐，
其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自由氢、碘、氟、溴、甲氧基基团、硝基基团、氨基基团、和腈基团构成的组；
其中R5、R6、R7和R8各自独立地选自由氢、碘、和烷烃基团构成的组；
n1≥0；
n2≥1；以及
Y包括氨基。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，R5、R6、R7和R8中的至少一个独立地选自由异丙基基团和叔丁基基团构成的组。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，Y选自一氨基、二氨基、***、和哌嗪。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，R1、R2、R3和R4中的至少两个是碘。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，R1、R2、R3和R4中的至少两个是甲氧基基团。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述化合物具有化学式：
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述化合物具有化学式：
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述化合物具有化学式：
9.一种用于双靶向肿瘤细胞的方法，包括：
使用组合物，所述组合物包括通式化合物：
或其盐，
其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自由氢、碘、氟、溴、甲氧基基团、硝基基团、氨基基团、和腈基团构成的组；
其中R5、R6、R7和R8各自独立地选自由氢、碘、和烷烃基团构成的组；
n1≥0；
n2≥1；以及
Y包括氨基。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化合物包括N-苄胍和N-苄胍衍生物中的一个。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述组合物包括甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂，所述甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂选自由三碘甲腺乙酸、三碘甲腺乙酸衍生物、四碘甲腺乙酸、四碘甲腺乙酸衍生物所构成的组。
12.一种化合物，包括：
N-苄胍；
甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂；
其中，N-苄胍和甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂通过连接体连接。
13.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，所述连接体包括聚合物。
14.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，所述聚合物是聚乙二醇PEG。
15.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，所述聚乙二醇PEG具有的分子量为200g/mol至4,000g/mol。
16.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，所述甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂选自由三碘甲腺乙酸、三碘甲腺乙酸衍生物、四碘甲腺乙酸、四碘甲腺乙酸衍生物所构成的组。
17.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，所述组合物具有神经内分泌瘤的治疗功效。
18.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，所述神经内分泌瘤是成神经内分泌瘤、嗜铬细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤中的一种。
19.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，神经内分泌瘤的治疗功效由N-苄胍和甲状腺整联蛋白αvβ3受体拮抗剂两者提供。
20.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，所述组合物通过去甲肾上腺素转运体靶向神经内分泌瘤。
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