CN117405888A - 一种血浆蛋白c免疫层析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血浆蛋白C免疫层析测定技术领域，且公开了一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒及其制备方法，包括试剂盒本体试剂盒本体和检测卡检测卡，试剂盒本体一侧的中间位置处开设有显示槽，显示槽一侧的试剂盒本体上开设有滴药孔，试剂盒本体内部的中间位置处卡设有检测卡。本发明研究摸索了T、C线的最佳划线蛋白比例、结合垫的最佳喷涂蛋白量以及最佳反应时间等，应用荧光微球作探针，建立了良好的血浆蛋白C荧光免疫层析测定方法，具有价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、特异性高、线性范围宽等优点，保证了试剂盒的线性范围、试剂盒的相对特异性，试剂盒的批内及批间差以及试剂盒干扰物质评估均达到合格标准。

Description

一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及血浆蛋白C免疫层析测定技术领域，具体为一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是临床常见的一种妊娠期并发症，其发病与遗传、感染、解剖结构及内分泌异常、免疫调价、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS)等有关。APS发病机制可能与免疫功能异常、内皮细胞损伤、炎症反应血小板活化、血栓形成相关，因此，寻找可有效诊断APS的指标，对降低RSA发生率有重要意义。研究发现，活化蛋白C(activated protein C，APC)在脓毒症患儿血浆中的表达水平降低，其可辅助评估患儿病情严重程度。另外，血浆蛋白C(protein C，PC)是一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，主要在肝脏中合成，它在凝血酶或凝血酶-血栓调节蛋白复合物的作用下被转变成活化蛋白C。活化蛋白C与其辅因子蛋白S形成复合物，有灭活Va和Viiia及增加纤溶的活性，因此具有抗凝作用。PC作为抗凝物质，其在妊娠早期先兆流产患者中表达水平异常，PC可能通过影响机体凝血状态，从而在疾病发展中发挥重要作用。
目前，对蛋白C进行定量检测的方法可分为三类：酶免法、aptt凝固法和发色底物法。其中，酶免法其整个检测过程时间较长，无法满足急诊病人和临床及时诊断的需要。而aptt凝固法用蛇毒激活PC后，加入到待测血浆中，其中PC的含量对应着其血浆凝固时间的延长的比例，该方法能够特异性检测蛋白C含量，但对结果的影响因素较多，检验人员的经验往往直接影响到检测结果的准确性和重复性。发色底物法早期采用凝血酶-凝血酶调节蛋白作为激活剂，但因为血浆中存在PC抑制剂和干扰物质，其不能直接检测血浆中的PC活性，而需要把PC从血浆中分离出来，这不仅会浪费大量人力物力，检测速度也较慢。国内市售大部分的PC活性测定试剂盒(发色底物法)主要是进口试剂盒，其价格昂贵，采货周期较长，并且多为冻干粉形态，制作工艺繁琐，成本高且试剂的瓶间差也会因冻干被拉大，冻干粉试剂使用前均需要复溶，并且静置一段时间后才能使用，不利于客户的操作；该类PC活性测定试剂盒，盒内不附赠复溶剂，客户自行选用的复溶剂质量无法把控，对测试结果带来了一定的影响；试剂灵敏度差，线性范围窄，特异性差，导致其检测结果的重复性较差，并且抗干扰能力差，结果易受各种因素的影响，无法反应人体内真实的蛋白C活性水平。
因此本发明提供一种基于荧光免疫层析法的蛋白C活性测定试剂盒，其价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、特异性高、线性范围宽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒，包括试剂盒本体试剂盒本体和检测卡检测卡，所述试剂盒本体一侧的中间位置处开设有显示槽，所述显示槽一侧的试剂盒本体上开设有滴药孔，所述试剂盒本体内部的中间位置处卡设有检测卡，所述检测卡由样本垫、第一结合垫、第二结合垫、NC膜和吸水纸组装而成。
作为本发明进一步的方案：所述试剂盒本体一侧的一端开设有手持凹陷槽，所述手持凹陷槽内壁粗糙设置。
作为本发明进一步的方案：所述样本垫、第一结合垫、第二结合垫、NC膜和吸水纸按照从右到左的顺序分布，所述第一结合垫的部分覆盖在第二结合垫上。
一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1:样本垫、第一结合垫和第二结合垫的处理；
S2:第一结合垫和第二结合垫的喷涂；
S3:NC膜的划线；
S4:检测卡的组装；
S5:检测；
S6:试剂盒本体的性能验证。
作为本发明进一步的方案：所述S1的具体步骤为：
S1.1：称取1.8～3.6g的NaH2PO4，18.00～28.12g的Na2HPO4·12H2O，0.10～0.30g的tween20，0.25～0.5g蔗糖，5～10g的酪蛋白，用蒸馏水进行混合后配制成样本垫及第一结合垫和第二结合垫处理液；
S1.2：在2～8℃度环境内，无菌托盘内装满样本垫及第一结合垫和第二结合垫处理液，将样本垫及第一结合垫和第二结合垫浸泡在处理液内，浸泡时间为8～12h；
S1.3：将浸泡完成后的样本垫及第一结合垫和第二结合垫放置于37℃真空干燥箱中烘干6～8h。
作为本发明进一步的方案：所述S2的具体步骤为：
S2.1：荧光微球1(180～200nm)及荧光微球2(180～300nm)偶连；
S2.1a：取0.018～0.025mL荧光微球及0.018～0.025mL时间分辨微球悬浮液加到有1ml偶联缓冲液的2.0mL离心管中，在2～8℃水浴中超声混匀，在2～8℃、15000g下离心10min，去除上清，此步骤重复3次；
S2.1b：加入6～8μL EDC溶液，漩涡混匀，再加入28～35μLNHS溶液，在2～8℃水浴超声混匀：
S2.1c：将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，避光活化15-30min：
S2.1d：在15℃、20000g下离心10～40min，去除上清：
S2.1e：加入1.5mL偶联缓冲液，2～8℃水浴下超声混匀，在2～8℃、15000下离心10min，去除上清，重复洗涤1～2次：
S2.1f：加入0.5mL偶联缓冲液，2～8℃水浴下超声混匀：
S2.1g：将待标记抗体25～50μg加至0.5mL偶联缓冲液中，为偶联液：
S2.1h：将加有抗体的偶联液加至混匀后的微球中，将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，避光偶联2～3h：
S2.1i：向离心管中加入0.5mL微球封闭液，漩涡混匀，将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，封闭1h：
S2.1j：在2～8℃、20000g下离心12～15min，去除上清：
S2.1k：加入2mL微球洗涤液，超声混匀，在2～8℃、15000下离心10min，重复洗涤1次：
S2.1l：最终向离心管中加0.5～1mL微球保存液，冰浴超声混匀后获得抗体微球标记物1和抗体微球标记物2，2-8℃避光保存备用；
其中，上述微球偶连缓冲液中含有2～8mM吗琳乙磺酸(MES)，0.25％～0.5％ProClin300，pH：6.2±0.5；
微球封闭液中含有5～10mM硼酸，0.5％～0.75％的BSA，0.20％～0.35％乙醇胺；
微球洗涤液中含有pH7.5±0.0520～35mM的Tris，1.5％～2％的BSA，1％～1.5％Tween-20；
S2.2:在一定量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)内加入0.2％～0.5％的蔗糖、0.5％～1.0％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％～1％的甘氨酸、0.25％～0.5％的吐温20、0.5％～1％的ProClin300；
S2.3:将抗体微球标记物1及抗体微球标记物2用喷涂液稀释至10～15ug/ml后，按照体积比1:1～1:4的比例混合；将混合后的微球在冰水浴中超声分散后，用喷金划膜仪将S2.1中的混合荧光微球喷涂至1.5cm～1.8cm的第一结合垫和第二结合垫上；将喷涂有微球的结合垫放置在37度的干燥箱内，干燥6～8h，获得干燥的第一结合垫和第二结合垫。
作为本发明进一步的方案：所述S3的具体步骤为：
S3.1:在一定量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)内加入0.15％～2％的蔗糖；
S3.2：将待划线的血浆蛋白C抗体用划线液配置成1.5～2mg/ml的T线划线液，将羊抗鼠IGg用划线液配置成1.5～2mg/ml的C线划线液；
S3.3：T、C线划线液配制完成后，用喷金滑膜仪划线，待划线好后，将NC膜(504)放置在室温条件下干燥20～24h。
作为本发明进一步的方案：所述S4的具体步骤如下：
S4.1：将样本垫、第一结合垫、第二结合垫、NC膜和吸水纸按顺序组装。
作为本发明进一步的方案：所述S5的具体步骤如下：
S5.1：取待测血清75～90ul，滴加进滴药孔内，待10～15min后，用干式荧光免疫分析仪进行检测获得数据。
作为本发明进一步的方案：所述S6的具体步骤如下：
S6.1：取高值血清10ug/ml，用已知的0值血清对高值血清进行倍比稀释，得到5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml的样本，用已知的这六个样本分别进行点样，每个样本重复3次；
S6.2：用建立的荧光免疫层析方法检测50份不同抗体效价的血清样本(来自于医院的真实样本，其中阳性样本35例，阴性样本15例)，其结果与医院所给出的真实的病人情况做对比，相对特异性和总符合率，其计算公式如下：相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％；
S6.3：用实验室试制的同一批次的血浆蛋白C荧光免疫层析检测试剂盒，分别于第1、2、3、5、7天分别检测已知背景血清30份，其中阴性血清10份，强阳性血清10份，弱阳性血清10份，每份血清做3个重复，计算标准差和变异系数，分析其批内重复性；
S6.4：用3个不同批次(批号分别为20230402、20230413、20230505)实验室试制的血浆蛋白C荧光免疫层析检测试剂盒，分别检测已知背景血清30份，其中阴性血清10份，强阳性血清10份，弱阳性血清10份，每份血清重复3次；
S6.5：配制干扰实验样本：用血红蛋白配制20mg/ml，40mg/ml，80mg/ml三个浓度，用甘油三脂配制20mg/ml，40mg/ml，80mg/ml三个浓度，用胆红素配制5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml三个浓度。取一定数量的临床样本混合，分别在1ml的混合样本中加入100ul的干扰样本，配制成含不同浓度干扰物质的干扰实验样本，在另外一份混合样本中加入100ul的PBS缓冲液作为基础样本。取80ul干扰样本或基础样本，加入到本发明试纸条的样本孔。反应15分钟后使用干式免疫荧光分析仪读取NC膜上T，C线荧光信号并计算测量值T/C，并代入标准品拟合曲线计算其浓度值，并计算干扰样本与基础样本的浓度偏差。
本发明的有益效果：
本发明中的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒及其制备方法，研究摸索了T、C线的最佳划线蛋白比例、结合垫的最佳喷涂蛋白量以及最佳反应时间等，应用荧光微球作探针，建立了良好的血浆蛋白C荧光免疫层析测定方法，并保证了试剂盒的线性范围、试剂盒的相对特异性，试剂盒的批内及批间差以及试剂盒干扰物质评估均达到合格标准，具有价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、特异性高、线性范围宽等优点。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明的立体结构示意图。
图2为本发明检测卡的立体结构示意图。
图中：1、试剂盒本体；2、显示槽；3、滴药孔；4、手持凹陷槽；5、检测卡；501、样本垫；502、第一结合垫；503、第二结合垫；504、NC膜；505、吸水纸。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1和图2，本实施例中一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒，包括试剂盒本体试剂盒本体1和检测卡检测卡5，试剂盒本体1一侧的中间位置处开设有显示槽2，显示槽2一侧的试剂盒本体1上开设有滴药孔3，试剂盒本体1内部的中间位置处卡设有检测卡5，检测卡5由样本垫501、第一结合垫502、第二结合垫503、NC膜504和吸水纸505组装而成。
如图1，本实施例中的试剂盒本体1一侧的一端开设有手持凹陷槽4，手持凹陷槽4内壁粗糙设置。
如图2，本实施例中的样本垫501、第一结合垫502、第二结合垫503、NC膜504和吸水纸505按照从右到左的顺序分布，第一结合垫502的部分覆盖在第二结合垫503上。
一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1:样本垫501、第一结合垫502和第二结合垫503的处理；
S2:第一结合垫502和第二结合垫503的喷涂；
S3:NC膜504的划线；
S4:检测卡5的组装；
S5:检测；
S6:试剂盒本体1的性能验证。
本实施例中的S1的具体步骤为：
S1.1：称取1.8～3.6g的NaH2PO4，18.00～28.12g的Na2HPO4·12H2O，0.10～0.30g的tween20，0.25～0.5g蔗糖，5～10g的酪蛋白，用蒸馏水进行混合后配制成样本垫501及第一结合垫502和第二结合垫503处理液；
S1.2：在2～8℃度环境内，无菌托盘内装满样本垫501及第一结合垫502和第二结合垫503处理液，将样本垫501及第一结合垫502和第二结合垫503浸泡在处理液内，浸泡时间为8～12h；
S1.3：将浸泡完成后的样本垫501及第一结合垫502和第二结合垫503放置于37℃真空干燥箱中烘干6～8h。
本实施例中的S2的具体步骤为：
S2.1：荧光微球1(180～200nm)及荧光微球2(180～300nm)偶连；
S2.1a：取0.018～0.025mL荧光微球及0.018～0.025mL时间分辨微球悬浮液加到有1ml偶联缓冲液的2.0mL离心管中，在2～8℃水浴中超声混匀，在2～8℃、15000g下离心10min，去除上清，此步骤重复3次；
S2.1b：加入6～8μL EDC溶液，漩涡混匀，再加入28～35μLNHS溶液，在2～8℃水浴超声混匀：
S2.1c：将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，避光活化15-30min：
S2.1d：在15℃、20000g下离心10～40min，去除上清：
S2.1e：加入1.5mL偶联缓冲液，2～8℃水浴下超声混匀，在2～8℃、15000下离心10min，去除上清，重复洗涤1～2次：
S2.1f：加入0.5mL偶联缓冲液，2～8℃水浴下超声混匀：
S2.1g：将待标记抗体25～50μg加至0.5mL偶联缓冲液中，为偶联液：
S2.1h：将加有抗体的偶联液加至混匀后的微球中，将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，避光偶联2～3h：
S2.1i：向离心管中加入0.5mL微球封闭液，漩涡混匀，将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，封闭1h：
S2.1j：在2～8℃、20000g下离心12～15min，去除上清：
S2.1k：加入2mL微球洗涤液，超声混匀，在2～8℃、15000下离心10min，重复洗涤1次：
S2.1l：最终向离心管中加0.5～1mL微球保存液，冰浴超声混匀后获得抗体微球标记物1和抗体微球标记物2，2-8℃避光保存备用；
其中，上述微球偶连缓冲液中含有2～8mM吗琳乙磺酸(MES)，0.25％～0.5％ProClin300，pH：6.2±0.5；
微球封闭液中含有5～10mM硼酸，0.5％～0.75％的BSA，0.20％～0.35％乙醇胺；
微球洗涤液中含有pH7.5±0.0520～35mM的Tris，1.5％～2％的BSA，1％～1.5％Tween-20；
S2.2:在一定量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)内加入0.2％～0.5％的蔗糖、0.5％～1.0％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％～1％的甘氨酸、0.25％～0.5％的吐温20、0.5％～1％的ProClin300；
S2.3:将抗体微球标记物1及抗体微球标记物2用喷涂液稀释至10～15ug/ml后，按照体积比1:1～1:4的比例混合；将混合后的微球在冰水浴中超声分散后，用喷金划膜仪将S2.1中的混合荧光微球喷涂至1.5cm～1.8cm的第一结合垫502和第二结合垫503上；将喷涂有微球的结合垫放置在37度的干燥箱内，干燥6～8h，获得干燥的第一结合垫502和第二结合垫503。
本实施例中的S3的具体步骤为：
S3.1:在一定量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)内加入0.15％～2％的蔗糖；
S3.2：将待划线的血浆蛋白C抗体用划线液配置成1.5～2mg/ml的T线划线液，将羊抗鼠IGg用划线液配置成1.5～2mg/ml的C线划线液；
S3.3：T、C线划线液配制完成后，用喷金滑膜仪划线，待划线好后，将NC膜(504)放置在室温条件下干燥20～24h。
本实施例中的S4的具体步骤如下：
S4.1：将样本垫501、第一结合垫502、第二结合垫503、NC膜504和吸水纸505按顺序组装。
本实施例中的S5的具体步骤如下：
S5.1：取待测血清75～90ul，滴加进滴药孔3内，待10～15min后，用干式荧光免疫分析仪进行检测获得数据。
本实施例中的S6的具体步骤如下：
S6.1：取高值血清10ug/ml，用已知的0值血清对高值血清进行倍比稀释，得到5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml的样本，用已知的这六个样本分别进行点样，每个样本重复3次；将数据进行处理后，数据见表1-1，线性曲线见表1-2，从线性图可知，线性相关系数R＞0.99，试剂盒的线性是符合标准的。
表1-1校准品T/C
倍比稀释理论浓度值(ug/ml) 计算浓度值1 计算浓度值2 计算浓度值3 均值
0 0.0011 0.0009 0.0011 0.0010
0.25 0.2312 0.2431 0.2352 0.2365
1.25 1.2345 1.2526 1.2392 1.2421
2.5 2.4362 2.4152 2.4321 2.4278
5.0 4.9562 4.9413 4.9561 4.9512
10.0 9.8654 9.8624 9.8522 9.8600
表1-2线形图
S6.2：用建立的荧光免疫层析方法检测50份不同抗体效价的血清样本(来自于医院的真实样本，其中阳性样本35例，阴性样本15例)，其结果与医院所给出的真实的病人情况做对比，相对特异性和总符合率，其计算公式如下：相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％；
用建立的荧光免疫层析方法检测50份不同抗体效价的血清样本，检测结果为阳性36份，阴性14份，这个结果与医院所给的病人的真实情况较为符合，具体数据见表2-1，相对特异性为：93.33％，符合试剂盒要求。
表2-1 50份血清的检测结果
S6.3：用实验室试制的同一批次的血浆蛋白C荧光免疫层析检测试剂盒，分别于第1、2、3、5、7天分别检测已知背景血清30份，其中阴性血清10份，强阳性血清10份，弱阳性血清10份，每份血清做3个重复，计算标准差和变异系数，分析其批内重复性；
测定结果如表3.1-1、3.1-2、3.1-3所示，从表结果可知，30份血清的变异系数均小于15％，这表示同一批次的试剂盒批内重复性较好。
表3.1-1批内重复性检测结果
表3.1-2批内重复性检测结果
表3.1-3批内重复性检测结果
S6.4：用3个不同批次(批号分别为20230402、20230413、20230505)实验室试制的血浆蛋白C荧光免疫层析检测试剂盒，分别检测已知背景血清30份，其中阴性血清10份，强阳性血清10份，弱阳性血清10份，每份血清重复3次；
结果见表3.2-1、3.2-2、3.2-3，从表结果可知，30份血清的变异系数均小于15％，这表示3个批次试剂盒的批间重复性较好。
表3.2-1批间重复性检测结果
表3.2-2批间重复性检测结果
表3.2-3批间重复性检测结果
S6.5：配制干扰实验样本：用血红蛋白配制20mg/ml，40mg/ml，80mg/ml三个浓度，用甘油三脂配制20mg/ml，40mg/ml，80mg/ml三个浓度，用胆红素配制5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml三个浓度。取一定数量的临床样本混合，分别在1ml的混合样本中加入100ul的干扰样本，配制成含不同浓度干扰物质的干扰实验样本，在另外一份混合样本中加入100ul的PBS缓冲液作为基础样本。取80ul干扰样本或基础样本，加入到本发明试纸条的样本孔。反应15分钟后使用干式免疫荧光分析仪读取NC膜上T，C线荧光信号并计算测量值T/C，并代入标准品拟合曲线计算其浓度值，并计算干扰样本与基础样本的浓度偏差；
如4-1、4-2、4-3所示，从表中数据可知样本中血红蛋白浓度小于40mg/ml时，对检测结果不产生影响，样本中甘油三脂浓度小于40mg/ml时，对检测结果不产生影响，样本中胆红素浓度小于2mg/ml时，对检测结果不产生影响。
表4-1血红蛋白浓度偏差计算
表4-2甘油三脂浓度偏差计算
表4-3胆红素浓度偏差计算
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (10)

1.一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒，包括试剂盒本体试剂盒本体(1)和检测卡检测卡(5)，其特征在于：所述试剂盒本体(1)一侧的中间位置处开设有显示槽(2)，所述显示槽(2)一侧的试剂盒本体(1)上开设有滴药孔(3)，所述试剂盒本体(1)内部的中间位置处卡设有检测卡(5)，所述检测卡(5)由样本垫(501)、第一结合垫(502)、第二结合垫(503)、NC膜(504)和吸水纸(505)组装而成。
2.根据权利要求1所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒及其制备方法，其特征在于，所述试剂盒本体(1)一侧的一端开设有手持凹陷槽(4)，所述手持凹陷槽(4)内壁粗糙设置。
3.根据权利要求1所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒及其制备方法，其特征在于，所述样本垫(501)、第一结合垫(502)、第二结合垫(503)、NC膜(504)和吸水纸(505)按照从右到左的顺序分布，所述第一结合垫(502)的部分覆盖在第二结合垫(503)上。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:样本垫(501)、第一结合垫(502)和第二结合垫(503)的处理；
S2:第一结合垫(502)和第二结合垫(503)的喷涂；
S3:NC膜(504)的划线；
S4:检测卡(5)的组装；
S5:检测；
S6:试剂盒本体(1)的性能验证。
5.根据权利要求4所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S1的具体步骤为：
S1.1：称取1.8～3.6g的NaH2PO4，18.00～28.12g的Na2HPO4·12H2O，0.10～0.30g的tween20，0.25～0.5g蔗糖，5～10g的酪蛋白，用蒸馏水进行混合后配制成样本垫(501)及第一结合垫(502)和第二结合垫(503)处理液；
S1.2：在2～8℃度环境内，无菌托盘内装满样本垫(501)及第一结合垫(502)和第二结合垫(503)处理液，将样本垫(501)及第一结合垫(502)和第二结合垫(503)浸泡在处理液内，浸泡时间为8～12h；
S1.3：将浸泡完成后的样本垫(501)及第一结合垫(502)和第二结合垫(503)放置于37℃真空干燥箱中烘干6～8h。
6.根据权利要求4所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S2的具体步骤为：
S2.1：荧光微球1(180～200nm)及荧光微球2(180～300nm)偶连；
S2.1a：取0.018～0.025mL荧光微球及0.018～0.025mL时间分辨微球悬浮液加到有1ml偶联缓冲液的2.0mL离心管中，在2～8℃水浴中超声混匀，在2～8℃、15000g下离心10min，去除上清，此步骤重复3次；
S2.1b：加入6～8μL EDC溶液，漩涡混匀，再加入28～35μLNHS溶液，在2～8℃水浴超声混匀：
S2.1c：将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，避光活化15-30min：
S2.1d：在15℃、20000g下离心10～40min，去除上清：
S2.1e：加入1.5mL偶联缓冲液，2～8℃水浴下超声混匀，在2～8℃、15000下离心10min，去除上清，重复洗涤1～2次：
S2.1f：加入0.5mL偶联缓冲液，2～8℃水浴下超声混匀：
S2.1g：将待标记抗体25～50μg加至0.5mL偶联缓冲液中，为偶联液：
S2.1h：将加有抗体的偶联液加至混匀后的微球中，将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，避光偶联2～3h：
S2.1i：向离心管中加入0.5mL微球封闭液，漩涡混匀，将离心管放置于水浴震荡箱上，37℃，30～40r/min，封闭1h：
S2.1j：在2～8℃、20000g下离心12～15min，去除上清：
S2.1k：加入2mL微球洗涤液，超声混匀，在2～8℃、15000下离心10min，重复洗涤1次：
S2.1l：最终向离心管中加0.5～1mL微球保存液，冰浴超声混匀后获得抗体微球标记物1和抗体微球标记物2，2-8℃避光保存备用；
其中，上述微球偶连缓冲液中含有2～8mM吗琳乙磺酸(MES)，0.25％～0.5％ProClin300，pH：6.2±0.5；
微球封闭液中含有5～10mM硼酸，0.5％～0.75％的BSA，0.20％～0.35％乙醇胺；
微球洗涤液中含有pH7.5±0.0520～35mM的Tris，1.5％～2％的BSA，1％～1.5％Tween-20；
S2.2:在一定量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)内加入0.2％～0.5％的蔗糖、0.5％～1.0％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％～1％的甘氨酸、0.25％～0.5％的吐温20、0.5％～1％的ProClin300；
S2.3:将抗体微球标记物1及抗体微球标记物2用喷涂液稀释至10～15ug/ml后，按照体积比1:1～1:4的比例混合；将混合后的微球在冰水浴中超声分散后，用喷金划膜仪将S2.1中的混合荧光微球喷涂至1.5cm～1.8cm的第一结合垫(502)和第二结合垫(503)上；将喷涂有微球的结合垫放置在37度的干燥箱内，干燥6～8h，获得干燥的第一结合垫(502)和第二结合垫(503)。
7.根据权利要求4所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S3的具体步骤为：
S3.1:在一定量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)内加入0.15％～2％的蔗糖；
S3.2：将待划线的血浆蛋白C抗体用划线液配置成1.5～2mg/ml的T线划线液，将羊抗鼠IGg用划线液配置成1.5～2mg/ml的C线划线液；
S3.3：T、C线划线液配制完成后，用喷金滑膜仪划线，待划线好后，将NC膜(504)放置在室温条件下干燥20～24h。
8.根据权利要求4所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S4的具体步骤如下：
S4.1：将样本垫(501)、第一结合垫(502)、第二结合垫(503)、NC膜(504)和吸水纸(505)按顺序组装。
9.根据权利要求4所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S5的具体步骤如下：
S5.1：取待测血清75～90ul，滴加进滴药孔(3)内，待10～15min后，用干式荧光免疫分析仪进行检测获得数据。
10.根据权利要求4所述的一种血浆蛋白C免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S6的具体步骤如下：
S6.1：取高值血清10ug/ml，用已知的0值血清对高值血清进行倍比稀释，得到5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml的样本，用已知的这六个样本分别进行点样，每个样本重复3次；
S6.2：用建立的荧光免疫层析方法检测50份不同抗体效价的血清样本(来自于医院的真实样本，其中阳性样本35例，阴性样本15例)，其结果与医院所给出的真实的病人情况做对比，相对特异性和总符合率，其计算公式如下：相对特异性(％)＝{阴性数/(阴性数+假阳性数)}×100％；
S6.3：用实验室试制的同一批次的血浆蛋白C荧光免疫层析检测试剂盒，分别于第1、2、3、5、7天分别检测已知背景血清30份，其中阴性血清10份，强阳性血清10份，弱阳性血清10份，每份血清做3个重复，计算标准差和变异系数，分析其批内重复性；
S6.4：用3个不同批次(批号分别为20230402、20230413、20230505)实验室试制的血浆蛋白C荧光免疫层析检测试剂盒，分别检测已知背景血清30份，其中阴性血清10份，强阳性血清10份，弱阳性血清10份，每份血清重复3次；
S6.5：配制干扰实验样本：用血红蛋白配制20mg/ml，40mg/ml，80mg/ml三个浓度，用甘油三脂配制20mg/ml，40mg/ml，80mg/ml三个浓度，用胆红素配制5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml三个浓度。取一定数量的临床样本混合，分别在1ml的混合样本中加入100ul的干扰样本，配制成含不同浓度干扰物质的干扰实验样本，在另外一份混合样本中加入100ul的PBS缓冲液作为基础样本。取80ul干扰样本或基础样本，加入到本发明试纸条的样本孔。反应15分钟后使用干式免疫荧光分析仪读取NC膜上T，C线荧光信号并计算测量值T/C，并代入标准品拟合曲线计算其浓度值，并计算干扰样本与基础样本的浓度偏差。
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