CN117405474B - 一种复合质控品及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复合质控品及其制备方法和应用，所述复合质控品包括多种抗原、pH缓冲液以及保护剂，所述pH缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷和氯化钠，所述保护剂包括动物血清、牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、吐温80、表面活性剂S9以及抑肽酶，其中，所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇的质量比为1.2~1.8:1:1~2。本发明的复合质控品具有良好的稳定性，效价保留率高，在2～8℃存放15个月性能稳定，用于实验室检测***的质量控制时操作简单，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断生化检测技术领域，具体涉及一种复合质控品及其制备方法和应用。
背景技术
血栓形成前的高凝状态的准确判断是血栓预防的前提，抗凝有效性的精准评估是血栓预防的关键，亦是临床预防血栓的突出问题。新血栓四项为临床精准化抗凝提供直接证据。新血栓四项包含：凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物TAT、纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物PIC、血栓调节蛋白TM、组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物t-PAI-C。
目前，新血栓四项的质控品多不稳定，已上市的新血栓四项的质控品都为单项质控品，分别有冻干质控和液体质控两种。在实验室中，操作者使用时较为繁琐，需要每个项目分别质控，分开复溶或开瓶上样。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好且效价保留率高的复合质控品及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供一种复合质控品，所述复合质控品包括多种抗原、pH缓冲液以及保护剂，所述pH缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷和氯化钠，所述保护剂包括动物血清、牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、吐温80、表面活性剂S9以及抑肽酶，其中，所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇的质量比为1.2~1.8:1:1~2。
根据一些具体实施方式，所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇的质量比为1.3~1.7:1:1.2~1.8。
根据一些进一步地实施方式，所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇的质量比为1.4~1.6:1:1.3~1.7，进一步为1.4~1.6:1:1.4~1.6，例如1.5:1:1.5。
根据一些具体实施方式，所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的总浓度为80g/L~120g/L，例如，80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L或120g/L。
根据一些具体实施方式，所述动物血清在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为25mL/L~35mL/L，例如25mL/L、26mL/L、27mL/L、28mL/L、29mL/L、30mL/L、31mL/L、32mL/L、33mL/L、34mL/L或35mL/L。
根据一些具体实施方式，所述动物血清可以为马血清、牛血清、猪血清、小鼠血清等中的一种或多种。
根据一些具体实施方式，所述牛血清白蛋白在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为40 g/L ~60 g/L，例如40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L或60 g/L。
根据一些具体实施方式，所述吐温80在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为1.5mL/L ~2.5mL/L，例如1.5mL/L、1.6mL/L、1.7mL/L、1.8mL/L、1.9mL/L、2.0mL/L、2.1mL/L、2.2mL/L、2.3mL/L、2.4mL/L或2.5mL/L。
根据一些具体实施方式，所述表面活性剂S9在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为0.05mL/L~0.15mL/L，例如0.05mL/L、0.06mL/L、0.07mL/L、0.08mL/L、0.09mL/L、0.10mL/L、0.11mL/L、0.12mL/L、0.13mL/L、0.14mL/L或0.15mL/L。
根据一些具体实施方式，所述抑肽酶在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为0.5mg/L ~1.5mg/L，例如0.5mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L、0.8mg/L、0.9mg/L、1.0mg/L、1.1mg/L、1.2mg/L、1.3mg/L、1.4mg/L或1.5mg/L。
根据一些具体实施方式，所述保护剂还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠、PC950、PC300、PC500、苯酚、对羟基苯甲酸中的一种或多种。
根据一些进一步地实施方式，所述防腐剂为叠氮钠和PC950，所述叠氮钠在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为0.1g/L ~1g/L，所述PC950在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为0.1 mL/L ~1mL/L。
根据一些具体实施方式，所述三(羟甲基)氨基甲烷在所述pH缓冲液中的浓度为4.8g/L ~7.2g/L，例如4.8g/L、4.9g/L、5.0g/L、5.1g/L、5.2g/L、5.3g/L、5.4g/L、5.5g/L、5.6g/L、5.7g/L、5.8g/L、5.9g/L、6.0g/L、6.1g/L、6.2g/L、6.3g/L、6.4g/L、6.5g/L、6.6g/L、6.7g/L、6.8g/L、6.9g/L、7.0g/L、7.1g/L或7.2g/L。
根据一些具体实施方式，所述氯化钠在所述pH缓冲液中的浓度为5.8g/L ~11.6g/L，例如5.8g/L、5.9g/L、6.0g/L、6.1g/L、6.2g/L、6.3g/L、6.4g/L、6.5g/L、6.6g/L、6.7g/L、6.8g/L、6.9g/L、7.0g/L、7.1g/L、7.2g/L、7.3g/L、7.4g/L、7.5g/L、7.6g/L、7.7g/L、7.8g/L、7.9g/L、8.0g/L、8.1g/L、8.2g/L、8.3g/L、8.4g/L、8.5g/L、8.6g/L、8.7g/L、8.8g/L、8.9g/L、9.0g/L、9.1g/L、9.2g/L、9.3g/L、9.4g/L、9.5g/L、9.6g/L、9.7g/L、9.8g/L、9.9g/L、10.0g/L、10.1g/L、10.2g/L、10.3g/L、10.4g/L、10.5g/L、10.6g/L、10.7g/L、10.8g/L、10.9g/L、11.0g/L、11.1g/L、11.2g/L、11.3g/L、11.4g/L、11.5g/L或11.6g/L。
根据一些具体实施方式，所述pH缓冲液的pH为7~7.5。
根据一些具体实施方式，所述多种抗原为纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物抗原、组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗原、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗原以及血栓调节蛋白抗原。
根据一些具体实施方式，所述复合质控品中各抗原的添加量根据各厂家试剂盒的检测需要，并且根据每批次抗原的效价来确定抗原的添加量，可配制低值、中值、高值等不同抗原浓度的复合质控品。
根据一些具体实施方式，所述复合质控品为冻干粉。将上述复合质控品制备成冻干粉，有利于延长质控品的保质期。配制好的液态的复合质控品也可以直接使用，但出于稳定性考虑，液态复合质控品优选现配现用。
本发明第二方面提供一种上述复合质控品的制备方法，包括如下步骤：
（1）配制pH缓冲液：将所述三(羟甲基)氨基甲烷、所述氯化钠与水混合，并用盐酸调节pH至7~7.5；
（2）将所述pH缓冲液、所述多种抗原以及所述保护剂，混合均匀。
根据一些具体实施方式，所述制备方法还包括将所述步骤（2）配制的混合液冻干成冻干粉的步骤。
本发明第三方面提供一种上述复合质控品在制备用于凝血检测的试剂盒中的应用。
本发明第四方面提供一种凝血检测试剂盒，其包括上述复合质控品。
所述复合质控品的使用方法为：
1）复合质控品溶解：取出1瓶质控品冻干粉，室温放置10-15min使所述质控品冻干粉恢复室温，用纯化水0.5ml溶解所述质控品冻干粉，反转混合10~20次，直至所述质控品冻干粉全部溶解，加盖后室温放置10min，并注意在反转过程中不要产生气泡，待内容物完全溶解后再使用，小心取下橡胶塞，避免内容物喷出；
2）质控品检测：选取三个实验室，将质控品作为待检标本，采用凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒(磁微粒化学发光法）、血栓调节蛋白检测试剂盒(磁微粒化学发光法）、纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）、组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）对质控品中相应物质含量进行检测，每个实验室对每个项目重复检测20次，共计每个项目60次，记录检测结果；
3）比较测定值与质控品定值范围，判断结果是否在控。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的复合质控品具有良好的稳定性，效价保留率高，在2～8℃存放15个月性能稳定，用于实验室检测***的质量控制时操作简单，具有良好的临床应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下实施例和对比例中，室温是指25±5℃。以下实施例和对比例中，若如特殊说明，所述的“%”为质量百分比。
以下实施例和对比例中，若无特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品，或者按照本领域常规方法制备得到的产品。例如抑肽酶购自罗氏的10236624001货号，纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物抗原、组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗原、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗原以及血栓调节蛋白抗原分别购自上海费玛生物科技有限公司的M006G01/2、M008G01/2、M007G01/2、M009G01/2货号。
实施例1
1、配制pH缓冲液：
称取三(羟甲基)氨基甲烷 5.94g、氯化钠8.82g，溶于纯化水中，用盐酸调节pH值至7.2±0.05，加水定容至1L，4℃保存备用。
2、配制混合液：
称取一定质量的纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物抗原、一定质量的组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗原、一定质量的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗原以及一定质量的血栓调节蛋白抗原，加入pH缓冲液混合均匀；
然后加入30mL马血清、60g牛血清白蛋白、30g海藻糖、20g蔗糖、30g甘露醇、2mL吐温80、0.1mL表面活性剂S9、1mg抑肽酶、0.5g叠氮钠以及0.5mL PC950，混合均匀后，用pH缓冲液定容至1L；使用0.2μm孔径滤纸过滤，得到混合液。
3、制备冻干粉
将上述混合液分装到冻干瓶中，0.5mL/瓶，将分装好的溶液置入冷冻干燥机内冻干，然后保存。
冻干步骤为：-50℃预冷冻12h，冻干机减压抽真空至1 Pa以下，-40℃ 1Pa以下冷维持1小时，-30℃ 1 Pa以下冷维持4小时，-20℃ 1Pa以下冷维持3小时，-10℃ 1Pa以下冷维持3小时，-5℃ 1Pa以下冷维持2小时，升温至0℃维持2h，升温至5℃维持2h，升温至15℃维持2h，升温至25℃维持6h，封盖，放气至常压，取出即得冻干新血栓四项复合质控品。2-8℃冰箱保存。
实施例2
与实施例1基本相同，不同之处在于：实施例2中的牛血清白蛋白的添加量为40g。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处在于：实施例3中的海藻糖的添加量为45g，蔗糖的添加量为30g，甘露醇的添加量为45g。
对比例1
与实施例1基本相同，不同之处在于：对比例1的pH缓冲液中不含有氯化钠。
对比例2
与实施例1基本相同，不同之处在于：对比例2的pH缓冲液采用50mmol/L的PBS缓冲液。
对比例3
与实施例1基本相同，不同之处在于：对比例3中的海藻糖的添加量为10g，蔗糖的添加量为10g，甘露醇的添加量为50g。
对比例4
与实施例1基本相同，不同之处在于：对比例4中的牛血清白蛋白的添加量为40g，海藻糖的添加量为45g，蔗糖的添加量为30g，甘露醇的添加量为45g，并且不添加表面活性剂S9。
测试方法：
1、质控品中各抗原的定值及效价保留率的测定：
各实施例和对比例的新血栓四项复合质控品的定值范围由以下方法获取：
1）复合质控品溶解：取出1瓶质控品冻干粉，室温放置10-15min使质控品冻干粉恢复室温，用纯化水0.5mL溶解质控品冻干粉，反转混合10~20次，直至质控品冻干粉全部溶解，加盖后室温放置10min，并注意在反转过程中不要产生气泡，待内容物完全溶解后再使用，小心取下橡胶塞，避免内容物喷出；
2）质控品检测：选取三个实验室，将复溶后的复合质控品以及各实施例和对比例配制的混合液（即未进行冻干前的混合液）分别作为待检标本，采用凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒(磁微粒化学发光法）、血栓调节蛋白检测试剂盒(磁微粒化学发光法）、纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）、组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）对质控品中相应物质含量进行检测，每个实验室随机抽取质控品 25 瓶，在适用的测量程序上每天检测 5瓶，连续完成 5 天实验，每天的测试需要重新定标，每个项目的每个水平共得到75个测试数据，经分析得到质控品中各抗原的定值；计算上述试验所得质控品中抗原浓度测定值的平均值和标准差（SD）。
式中：
：75次测定浓度的算术平均值；
Xi：每次测定浓度值。
质控范围为平均值±3SD。
蛋白效价保留率的计算方法为冻干后的定值/冻干前的定值×100%。
各实施例和对比例的检测结果见下表1。
从表1可见，实施例1至3以及对比例4的蛋白效价保留率均在85%以上，且实施例1和实施例2的蛋白效价保留率更佳，可达95%以上。实施例3的蛋白效价保留率略差于实施例1。对比例1和对比例2的pH缓冲液不佳，对比例3的海藻糖、蔗糖和甘露醇的用量不合适，导致对比例1至3的蛋白效价保留率明显降低。
2、稳定性评价
将各实施例及对比例的复合质控品分别在 2～8℃条件下贮存，分别在贮存3个月、6个月、9个月、12个月、15个月时，对质控品按照上述方法进行结果测试，每个样品重复测试3次，取平均值。保留率的计算方法为（该月测定的平均值-初始值）/初始值×100%，其中，初始值为上表1中各实施例和对比例冻干后的项目的平均值。结果分别如下表2至表8所示。
从表2至表8可见，实施例2的稳定性略差于实施例1。对比例1和对比例2采用的pH缓冲液不合适，从而导致质控品的稳定性较差。
3、重复性测试
按照上述方法分别对各实施例和对比例的质控品进行结果测试，重复测试10次，计算测量值的平均值（）和标准差（SD），按如下公式计算变异系数（CV），各实施例和对比例的瓶内CV和瓶间CV测试结果见下表9。
从表9可见，实施例1至3以及对比例1的质控品的重复性优于对比例2至4。并且，对比例4的质控品虽然在蛋白效价保留率以及稳定性方面尚可，但其重复性不佳，均匀性差，并且经观察对比例4冻干后的质控品，发现其物理形状不佳。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (12)
1.一种复合质控品，其特征在于：所述复合质控品包括多种抗原、pH缓冲液以及保护剂，所述pH缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷和氯化钠，所述pH缓冲液的pH为7~7.5，所述保护剂包括动物血清、牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、吐温80、表面活性剂S9以及抑肽酶，其中，所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇的质量比为1.2~1.8:1:1~2；所述多种抗原为纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物抗原、组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂1复合物抗原、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物抗原以及血栓调节蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的复合质控品，其特征在于：所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇的质量比为1.3~1.7:1:1.2~1.8。
3.根据权利要求2所述的复合质控品，其特征在于：所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇的质量比为1.4~1.6:1:1.3~1.7。
4.根据权利要求1所述的复合质控品，其特征在于：所述三(羟甲基)氨基甲烷在所述pH缓冲液中的浓度为4.8g/L ~7.2g/L；
和/或，所述氯化钠在所述pH缓冲液中的浓度为5.8g/L ~11.6g/L。
5.根据权利要求1所述的复合质控品，其特征在于：
所述海藻糖、所述蔗糖、所述甘露醇在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的总浓度为80g/L~120g/L；
和/或，所述动物血清在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为25mL/L~35mL/L；
和/或，所述牛血清白蛋白在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为40 g/L ~60 g/L；
和/或，所述吐温80在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为1.5mL/L~2.5mL/L；
和/或，所述表面活性剂S9在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为0.05mL/L~0.15mL/L；
和/或，所述抑肽酶在所述多种抗原、所述pH缓冲液以及所述保护剂形成的混合液中的浓度为0.5mg/L ~1.5mg/L。
6.根据权利要求1所述的复合质控品，其特征在于：所述保护剂还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠、PC950、PC300、PC500、苯酚、对羟基苯甲酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的复合质控品，其特征在于：所述动物血清为马血清、牛血清、猪血清、小鼠血清中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的复合质控品，其特征在于：所述复合质控品为冻干粉。
9.一种如权利要求1至7中任一项所述的复合质控品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）配制pH缓冲液：将所述三(羟甲基)氨基甲烷、所述氯化钠与水混合，并用盐酸调节pH至7~7.5；
（2）将所述pH缓冲液、所述多种抗原以及所述保护剂，混合均匀。
10.根据权利要求9所述的复合质控品的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括将所述步骤（2）配制的混合液冻干成冻干粉的步骤。
11.一种如权利要求1至8中任一项所述的复合质控品在制备用于凝血检测的试剂盒中的应用。
12.一种凝血检测试剂盒，其特征在于：其包括如权利要求1至8中任一项所述的复合质控品。
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