CN117388490A - 基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒 - Google Patents
基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,涉及免疫分析检测技术领域,包括抗原标记的磁微粒、吖啶磺酰胺标记的抗体、样本稀释液和质控品;所述磁微粒标记的结核分枝杆菌特异抗原包括16KD,38KD和Ag85A,羧基磁珠标记的抗原中蛋白16KD,38KD与Ag85A质量比为(1~3):1:(1~3)。本发明通过选择以羧基磁微粒标记抗原、以吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG,一方面,通过调整磁微粒偶联、封闭条件以及调整体系稳定剂组成,有效地降低血液样本中假阳性因素;另一方面,通过采用结核分枝杆菌特异蛋白三种抗原(16KD,38KD和Ag85A)混合的手段,提高检测的特异度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析检测技术领域,具体涉及基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒。
背景技术
结核病(tuberculosis,TB)是继艾滋病(AIDS)之后人类第二大杀手,是以呼吸***感染为主的慢性传染病,被列为我国的重大传染病之一。2020年官方确定的全球结核病死亡人数为130万,几乎是艾滋病死亡人数68万的两倍。其中,结核分枝杆菌感染是引起的主要原因,可侵及许多脏器,以肺部结核感染最为常见。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是一种抗酸阳性棒状杆菌,大小约为1~4×0.4μm,无鞭毛、无芽孢、不能产生内外毒素,且专性需氧,培养要求高,生长缓慢。人体感染结核菌后不一定发病,当抵抗力降低或细胞介导的***反应增高时,才可能引起临床发病。
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,排菌者为其重要的传染源,若能及时诊断,并合理治疗,大多可获临床痊愈。结核病近年来在全球的发病率逐年上升,特别是发现了由结核分枝杆菌引起的肺炎有增多的趋势,已成为值得关注的公共卫生问题。Hillemann等用Capilia TB产品检测MPB64抗原,在172例结核杆菌阳性的临床标本的检测中,阳性检出率为92%,特异性达到100%。
目前结核分枝杆菌诊断主要检测方法有结核菌素试验(PPD test)、涂片、结核菌γ干扰素释放试验、分枝杆菌培养、结核分枝杆菌抗原检测等。临床数据显示,不同检测方法对结核分枝杆菌的检出率均有一定效果,同时也发现,对于相同的送检标本组织,采用不同的检测方法会出现存在明显差异的检测结果。由于缺乏有效的疫苗,缺乏高特异性和敏感性的诊断试剂,以及耐药性结核病的不断涌现等原因,因此能够快速有效的诊断对于结核病的控制和传播至关重要。临床研究表明IgG在结核病患者中的阳性检出率和疾病程度及患者的免疫状态密切相关,患者病程越长,病变程度越严重,越容易诱导免疫应答,导致IgG等免疫球蛋白增多。
化学发光免疫分析(Chemilumineshcence immunoassay,CLIA)是化学发光与免疫分析相结合的方法。在免疫的反应***中,发光物质标记的抗原和抗原反应会形成免疫复合物。在化学发光***中,发光物质经过催化剂和氧化剂的作用后,从基态跃迁至激发态,后又回到基态并发射光子,光子的强度可以利用发光信号检测器进行检测,并与待测物质的浓度成一定的关系。吖啶酯类化合物作为常见用于标记的化学发光物,可通过NaOH和H2O2的作用而瞬时发光。吖啶酯化合物作为标记物可使化学发光免疫分析体系变得标记效率高、快速、简单、无需加入催化剂,并且本底值低。若测定的样本中含有特异蛋白,可与患者血清中的特异性IgE抗原形成固相复合物,由吖啶酯的发光值确定结核分枝杆菌抗原浓度,从而诊断TB。
发明内容
本发明的目的在于提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,以解决上述背景技术中提出的问题。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:
第一方面,本发明提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,包括抗原标记的磁微粒、吖啶磺酰胺标记的抗体、样本稀释液和质控品;
所述磁微粒标记的结核分枝杆菌特异抗原包括16KD,38KD和Ag85A。
本发明技术方案的进一步改进在于:羧基磁珠标记的抗原中蛋白16KD,38KD与Ag85A质量比为(1~3):1:(1~3)。
本发明技术方案的进一步改进在于:所述样本稀释液中包含牛血清白蛋白、类风湿因子吸附剂、抑菌剂、尿素或阻断剂中的任意一种或至少两种的组合。
本发明技术方案的进一步改进在于:所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品,所述阳性质控品为含人源化结核分枝杆菌抗体的缓冲液。
本发明技术方案的进一步改进在于:所述结核分枝杆菌抗体检测试剂盒中还包括激发液和洗涤液。
第二方面,本发明提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒的制备方法,该试剂盒的制备方法包括:
步骤一、制备磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原:
(1)取羧基磁微粒,磁分离(1~2min),弃去上清;随后取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)溶液重新分散磁微粒,振荡5~10min后磁分离,弃去上清,重复三次;
(2)取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)重新分散上述磁微粒,并加入偶联活化试剂EDC,室温振荡30~50min;磁分离,弃去上清;
(3)加入抗原用MES偶联缓冲液溶液稀释,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清,随后取封闭液母液(5%BSA)对体系进行封闭,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清;
(4)取洗涤缓冲液TBS-T重新分散上述磁微粒,振荡5~10min后,磁分离弃去上清,反复三次;用磁微粒存储液洗涤一次,重新分散抗原偶联磁微粒于磁微粒存储液中,2~8℃保存备用;
步骤二、制备吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体:
取0.2mg羊抗人IgG抗体置于玻璃器皿内,用0.1M CBS(pH9.0~12.0)缓冲液将羊抗人IgG抗体稀释到0.5~1mg/mL;取2mg/mL的NSP-SA-NHS溶液加入到上述抗体稀释液中,混匀,避光置于室温60~90min;
再加入10%赖氨酸溶液,混匀,避光置于室温30~40分钟;用0.02M PBS缓冲液在4℃环境中过夜透析,得到吖啶磺酰胺标记的抗体母液;
其中吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体的工作浓度为0.5~1μg/mL;
步骤三、将所述磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原、吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG、样本稀释液和质控品分别包装,得到所述结核分枝杆菌抗体检测试剂盒。
第三方面,本发明还提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒的使用方法,该试剂盒的使用方法包括如下步骤:在待测样品中加入磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原,进行第一次孵育,洗涤,再加吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG进行第二次孵育,洗涤,而后检测得到检测结果。
本发明中采用两步两清洗法检测待测样品,即将样品和磁珠标记抗原混合孵育洗涤,再加入吖啶磺酰胺标记抗体孵育洗涤和两步一清洗法(直接将样品、羧基磁珠标记的抗原和吖啶磺酰胺标记抗体混合孵育洗涤),两步法两清洗的检测效果较好。
优选的,待测样品为血清或血浆;同一样本不同样本类型(血浆/血清)检测发光值的相对偏差绝对值小于10%,认为血浆和血清检测结果相同。
待测样品经过样品稀释液稀释;用样本稀释液将样本分别稀释25倍、50倍、100倍、200倍、400倍;用化学发光法检测经稀释的样本,可知样品稀释倍数为100倍时,区分度最大。
本发明中,分别以样品的加液量为50、75和100μL、磁微粒标记抗原加液量为25、50和75μL、磁微粒加液量为30、40和50μL、第一步反应时间为4、6、8、10min、最佳吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG浓度1、0.5、0.25、0.125μg/mL、第二步反应时间为4、6、8、10min、洗涤次数为1、2、3、4次,测试最佳的反应条件。
待测样品稀释倍数为1:(90~150);
所述抗原标记羧基磁珠量为40μg/mL、羧基磁珠抗原标记量为40~60μg/mL;
优选的,所述吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG的工作浓度为0.5~1μg/mL;例如可以是0.5μg/mL、0.75μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL等,优选为1μg/mL。
优选的,第一次孵育的时间为5~15min;例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、12min、14min或15min等,优选为10min。
优选的,第二次孵育的时间为5~15min,例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、12min、14min或15min等,优选为10min。
优选的,所述检测结果中指数I≥1.0,则待测样本为阳性;
所述检测结果中指数I<1.0,则待测样本为阴性。
本发明的数值范围不仅包括上述列举的点值,还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
由于采用了上述技术方案,本发明相对现有技术来说,取得的技术进步是:
1、本发明提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,选择以羧基磁微粒标记抗原、以吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG,一方面,通过调整磁微粒偶联、封闭条件以及调整体系稳定剂组成,有效地降低血液样本中假阳性因素;另一方面,通过采用结核分枝杆菌特异蛋白三种抗原(16KD,38KD和Ag85A)混合的手段,提高检测的特异度。
2、本发明提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,采用16KD,38KD和Ag85A作为结核分枝杆菌特异蛋白的抗原,重组蛋白具有原始蛋白序列的优势表位,亲水指数、抗原指数、表面可能性均较高,能够显著提高检测的灵敏度。
3、本发明提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,检测试剂盒的灵敏度和精密度高。自动化设备与人为手工操作相比精确度要高,加样时间、反应时间更加精确,这极大地提高了检测的准确性和重复性,体系简单,本底值低。相较于鲁米诺及其衍生物等发光物质,本体系采用的吖啶酯分子量小,易与蛋白结合且标记稳定性高,发光强度大释放迅速,不需要催化剂和增强剂,在含有H2O2的碱性环境中即可发光,从而降低了成本,操作简便,快速。本体系结合全自动化学发光测定仪,操作人员只需要完成上样和设定程序,其余均由仪器自动完成;另一方面,本体系检测速度更快,40min即可出结果。
附图说明
图1为本发明的试剂盒制备流程示意图;
图2为本发明的试剂盒使用流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明:
本发明提供三个方面的内容:
第一方面,如图1-2所示,本发明提供了基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,包括抗原标记的磁微粒、吖啶磺酰胺标记的抗体、样本稀释液和质控品;
磁微粒标记的结核分枝杆菌特异抗原包括16KD,38KD和Ag85A。
其中羧基磁珠标记的抗原中蛋白16KD,38KD与Ag85A质量比为(1~3):1:(1~3),样本稀释液中包含牛血清白蛋白、类风湿因子吸附剂、抑菌剂、尿素或阻断剂中的任意一种或至少两种的组合,质控品包括阳性质控品和阴性质控品,阳性质控品为含人源化结核分枝杆菌抗体的缓冲液,结核分枝杆菌抗体检测试剂盒中还包括激发液和洗涤液。
第二方面,如图1-2所示,本发明提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒的制备方法,该试剂盒的制备方法包括:
步骤一、制备磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原:
(1)取羧基磁微粒,磁分离(1~2min),弃去上清;随后取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)溶液重新分散磁微粒,振荡5~10min后磁分离,弃去上清,重复三次;
(2)取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)重新分散上述磁微粒,并加入偶联活化试剂EDC,室温振荡30~50min;磁分离,弃去上清;
(3)加入抗原用MES偶联缓冲液溶液稀释,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清,随后取封闭液母液(5%BSA)对体系进行封闭,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清;
(4)取洗涤缓冲液TBS-T重新分散上述磁微粒,振荡5~10min后,磁分离弃去上清,反复三次;用磁微粒存储液洗涤一次,重新分散抗原偶联磁微粒于磁微粒存储液中,2~8℃保存备用;
步骤二、制备吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体:
取0.2mg羊抗人IgG抗体置于玻璃器皿内,用0.1M CBS(pH9.0~12.0)缓冲液将羊抗人IgG抗体稀释到0.5~1mg/mL;取2mg/mL的NSP-SA-NHS溶液加入到上述抗体稀释液中,混匀,避光置于室温60~90min;
再加入10%赖氨酸溶液,混匀,避光置于室温30~40分钟;用0.02M PBS缓冲液在4℃环境中过夜透析,得到吖啶磺酰胺标记的抗体母液;
其中吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体的工作浓度为0.5~1μg/mL;
步骤三、将磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原、吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG、样本稀释液和质控品分别包装,得到结核分枝杆菌抗体检测试剂盒。
第三方面,如图1-2所示,本发明提供基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒的使用方法,该试剂盒的使用方法包括如下步骤:将待检样本、抗原标记的磁微粒一并加入到反应杯中,进行孵育和磁洗涤,再加入吖啶磺酰胺标记抗体,进行二次孵育和磁洗涤,而后检测得到检测结果。
其中待测样品为血清或血浆;
待测样品经过样品稀释液稀释;
待测样品稀释倍数为1:(90~150);
抗原标记羧基磁珠量为40μg/mL、羧基磁珠抗原标记量为40~60μg/mL;
吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG的工作浓度为0.5~1μg/mL;
第一次孵育的时间为5~15min;
第二次孵育的时间为5~15min,检测结果中指数I≥1.0,则待测样本为阳性;检测结果中指数I<1.0,则待测样本为阴性。
实施例1
本实施提供基于磁微粒化学发光的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,具体包括:
羧基磁珠标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原、吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体、样本稀释液,阳性质控品、阴性质控品、样本稀释液和洗涤液。
其中,基于磁微粒化学发光的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒的制备方法包括:
(1)制备磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原:
1)取羧基磁微粒,磁分离(1~2min),弃去上清;随后取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)溶液重新分散磁微粒,振荡5~10min后磁分离,弃去上清,重复三次;
2)取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)重新分散上述磁微粒,并加入偶联活化试剂EDC,室温振荡30~50min;磁分离,弃去上清;
3)加入抗原用MES偶联缓冲液溶液稀释,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清,随后取封闭液母液(5%BSA)对体系进行封闭,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清;
4)取洗涤缓冲液TBS-T重新分散上述磁微粒,振荡5~10min后,磁分离弃去上清,反复三次;用磁微粒存储液洗涤一次,重新分散抗原偶联磁微粒于磁微粒存储液中,2~8℃保存备用。
(2)吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体的制备方法为:
取0.2mg羊抗人IgG抗体置于玻璃器皿内,用0.1M CBS(pH9.0~12.0)缓冲液将羊抗人IgG抗体稀释到0.5~1mg/mL;取9.1μL2mg/mL的NSP-SA-NHS溶液加入到上述抗体稀释液中,混匀,避光置于室温60~90min;
再加入1.33μL的10%赖氨酸溶液,混匀,避光置于室温30~40分钟;用0.02M PBS缓冲液在4℃环境中过夜透析,得到吖啶磺酰胺标记的抗体母液;
吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体的工作浓度为0.5~1μg/mL。
实施例2
本实施例提供两种不同的检测步骤,具体包括:
(1)两步两清洗法:100μL参考品加入40μL磁珠标记抗原孵育10min,洗涤;加100μL吖啶磺酰胺标记抗体孵育10min,洗涤;加激发液检测发光值。
(2)两步一清洗法:100μL参考品加入40μL磁珠标记抗原孵育、100μL吖啶磺酰胺标记抗体孵育10min,洗涤;加激发液检测发光值。检测区分度,结果如表1所示:
其中,参考品为标准样品,是试剂盒研发过程中使用的待测样品,编号为N1、N2、N3、P1、P2和P3;从上表可知,两步两清洗法的区分度较大,故选择两步两清洗法作为操作步骤。
实施例3
本实施例提供基于磁微粒化学发光的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,与实施例2的区别在于,吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG的工作浓度为0.5~1μg/mL,例如可以是0.5μg/mL、0.75μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL进行验证。
同样的,对实施例1中提供的不同方案进行区分度测试,此处出于篇幅和简明的考虑,不再列出。
试验例1:精密度评估
开展为期20天的测试,取高、中、低值的样本,用2个机型检测,每个样品每天做3个重复,间隔不少于2个小时,要用适当的方法储存样本。计算各样本的重复性、室内精密度及批间精密度。
检测结果如下表2所示:
从上表数据分析结果可知,机型SMART 6500检测中阳性样本、强阳性样本和阳性质控品的重复性、室内精密度和批间精密度CV均小于等于10%,符合要求(重复性CV<10%,批间CV<15%);临界阳性样本的阳性检出率≥95%,符合要求;阴性样本及阴性质控品的阴性检出率应为100%,符合要求;
同样的,机型SMART 500S的检测结果同样符合要求,此处出于篇幅和简明的考虑,不再列出。
试验例2:可能产生干扰的物质对检测结果的影响
临床样本中的血红蛋白主要是样本发生了溶血现象,包括病理性溶血与技术性溶血。非显性溶血是指血红蛋白含量小于0.5mg/mL,这种溶血肉眼是观察不出来的。轻度溶血的血红蛋白浓度为0.5-3mg/mL,中度溶血的血红蛋白浓度为3.1-5mg/mL,重度溶血的血红蛋白浓度>5mg/mL。实验证明,血红蛋白浓度达到7mg/mL时,临近阴性、临近阳性以及高值阳性的浓度值相对偏差绝对值未超过10%,所以对检测结果无干扰。
正常人血清中胆红素范围为2-8mg/L(婴儿一周时的胆红素范围为10-120mg/L),根据EP 07第三版中提到最高干扰检测浓度为150mg/L。从表中看出,当样本中胆红素浓度达到300mg/L时,临近阴性、临近阳性以及高值阳性的浓度值相对偏差绝对值未超过10%,所以对检测结果无干扰。检测结果如下表3所示:
临床样本中甘油三酯正常最高限度为1.7mmoL/L,根据EP 07第三版中提到最高干扰检测浓度为2.83mmoL/L。从表中看出,当样本中甘油三酯浓度达到7.5mmoL/L时,临近阴性、临近阳性以及高值阳性的浓度值相对偏差绝对值未超过10%,所以对检测结果无干扰。
试验例3:对不同时间段采样后的样本进行检测
体外诊断(IVD)试剂的稳定性反映了其随着时间推移保持一致性能特性的能力。评估实验步骤如下:将结核分枝杆菌抗体检测试剂分别储存于4℃和37℃下,分别于第1、2、4、6天取出前述研究的IgG抗体检测试剂,分别检测阴性样本1#、阳性样本10#,每个样品重复检测4次。通过计算4℃和37℃的I值计算结果确定试剂变化趋势且结果如下表4所示:
由上表可知,4℃和37℃的I值分析得来结核分枝杆菌抗体检测试剂盒在4℃和37℃都是相对稳定的。
综上,本发明选择以羧基磁微粒标记抗原、以吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG,一方面,通过调整磁微粒偶联、封闭条件以及调整体系稳定剂组成,有效地降低血液样本中假阳性因素;另一方面,通过采用结核分枝杆菌特异蛋白三种抗原(16KD,38KD和Ag85A)混合的手段,提高检测的特异度,检测试剂盒的灵敏度和精密度高,自动化设备与人为手工操作相比精确度要高,加样时间、反应时间更加精确,这极大地提高了检测的准确性和重复性,体系简单,本底值低。相较于鲁米诺及其衍生物等发光物质,本体系采用的吖啶酯分子量小,易与蛋白结合且标记稳定性高,发光强度大释放迅速,不需要催化剂和增强剂,在含有H2O2的碱性环境中即可发光,从而降低了成本,操作简便,快速。本体系结合全自动化学发光测定仪,操作人员只需要完成上样和设定程序,其余均由仪器自动完成;另一方面,本体系检测速度更快,40min即可出结果。
上文一般性的对本发明做了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对于技术领域的一般技术人员是显而易见的。因此,在不脱离本发明思想精神的修改或改进,均在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:包括抗原标记的磁微粒、吖啶磺酰胺标记的抗体、样本稀释液和质控品;
所述磁微粒标记的结核分枝杆菌特异抗原包括16KD,38KD和Ag85A。
2.根据权利要求1所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:羧基磁珠标记的抗原中蛋白16KD,38KD与Ag85A质量比为(1~3):1:(1~3)。
3.根据权利要求1所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:所述样本稀释液中包含牛血清白蛋白、类风湿因子吸附剂、抑菌剂、尿素或阻断剂中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品,所述阳性质控品为含人源化结核分枝杆菌抗体的缓冲液。
5.根据权利要求1所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:所述结核分枝杆菌抗体检测试剂盒中还包括激发液和洗涤液。
6.根据权利要求1所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒的制备方法包括:
步骤一、制备磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原:
(1)取羧基磁微粒,磁分离(1~2min),弃去上清;随后取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)溶液重新分散磁微粒,振荡5~10min后磁分离,弃去上清,重复三次;
(2)取偶联缓冲液MES(pH=5.0~7.0)重新分散上述磁微粒,并加入偶联活化试剂EDC,室温振荡30~50min;磁分离,弃去上清;
(3)加入抗原用MES偶联缓冲液溶液稀释,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清,随后取封闭液母液(5%BSA)对体系进行封闭,室温震荡反应1.5~2.5h;磁分离,弃去上清;
(4)取洗涤缓冲液TBS-T重新分散上述磁微粒,振荡5~10min后,磁分离弃去上清,反复三次;用磁微粒存储液洗涤一次,重新分散抗原偶联磁微粒于磁微粒存储液中,2~8℃保存备用;
步骤二、制备吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体:
取0.2mg羊抗人IgG抗体置于玻璃器皿内,用0.1M CBS(pH9.0~12.0)缓冲液将羊抗人IgG抗体稀释到0.5~1mg/mL;取2mg/mL的NSP-SA-NHS溶液加入到上述抗体稀释液中,混匀,避光置于室温60~90min;
再加入10%赖氨酸溶液,混匀,避光置于室温30~40分钟;用0.02M PBS缓冲液在4℃环境中过夜透析,得到吖啶磺酰胺标记的抗体母液;
其中吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体的工作浓度为0.5~1μg/mL;
步骤三、将所述磁微粒标记的结核分枝杆菌特异蛋白抗原、吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG、样本稀释液和质控品分别包装,得到所述结核分枝杆菌抗体检测试剂盒。
7.根据权利要求1所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒的使用方法包括如下步骤:将待检样本、抗原标记的磁微粒一并加入到反应杯中,进行孵育和磁洗涤,再加入吖啶磺酰胺标记抗体,进行二次孵育和磁洗涤,而后检测得到检测结果。
8.根据权利要求7所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:待测样品为血清或血浆;
待测样品经过样品稀释液稀释;
待测样品稀释倍数为1:(90~150);
所述抗原标记羧基磁珠量为40μg/mL、羧基磁珠抗原标记量为40~60μg/mL;
所述吖啶磺酰胺标记羊抗人IgG的工作浓度为0.5~1μg/mL;
第一次孵育的时间为5~15min;
第二次孵育的时间为5~15min。
9.根据权利要求8所述的基于磁微粒化学发光法的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒,其特征在于:所述检测结果中指数I≥1.0,则待测样本为阳性;
所述检测结果中指数I<1.0,则待测样本为阴性。
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