CN117384770B - 一种连续流生产单细胞蛋白的方法 - Google Patents

一种连续流生产单细胞蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种连续流生产单细胞蛋白的方法，所述方法包括：（1）在主培养基存在下，将解脂耶氏酵母进行发酵培养；（2）发酵培养至菌体OD值为400~450，放料，放料结束后，向其中加入辅培养基，继续发酵培养；（3）重复步骤（2），将放料得到的物料进行离心，得到所述单细胞蛋白；所述主培养基的碳源包括乙酸盐和无水葡萄糖；所述主培养基中，乙酸盐的质量浓度为14~20g/L，无水葡萄糖的质量百分含量为3~5%；本发明中，所述方法能够连续生产单细胞蛋白，还能够提高单细胞蛋白的产量。

Description

一种连续流生产单细胞蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物材料的制备技术领域，具体涉及一种连续流生产单细胞蛋白的方法。
背景技术
连续式发酵法又称连续式培养法，指在分批式液体深层培养至微生物对数生长后期时，以一定的流速向发酵罐中连续添加灭菌的新鲜液体培养基，同时以相同的流速自发酵罐中排出发酵液的发酵方法。连续式发酵法的特点如下：可以减少分批法培养与发酵中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等作业时间，节省了人力物力，降低了成本，提高了生产效率；且设备体积缩小，投资减少，同时可采用多级连续培养与发酵，设备配置更完善合理，便于机械化、自动化控制，属于稳定状态下的培养与发酵的方法，为微生物在恒定状态下高速生长提供了良好的环境，便于进行微生物生理生化和遗传特性的研究。
由于连续长时培养与发酵，易发生菌种变异、退化、杂菌污染等问题。且培养随发酵的环境条件，包括温度、pH、培养物浓度、产物浓度、溶解氧、氧化还原电位等不发生变化，因此，可以无限延长分批法培养中微生物的对数生长期，保持微生物稳定的生长速率和比生长速率，维持发酵罐中的细胞浓度、总菌体量和培养液的体积恒定不变。连续培养与发酵生产的产品性能稳定。但是，如果操作不当，新加入的培养基与原来的培养基不易完全混合，影响培养与发酵过程。
在半连续发酵中，根据醪液的流加方式不同，又可分为两种方法。第一种方法是将一组数个发酵罐连接起来，使前三个罐保持连续发酵状态。开始投产时，将第一只罐接入酒母，然后向该罐连续流加糖化醪并使该罐始终处于主发酵状态。待第一罐加满后，醪液流入第二罐，此时分别向第一、第二两罐流加糖化醪，并保持两罐始终处于主发酵状态。待第二罐流加满后，自然流入第三罐。第三罐流加满后，流入第四罐。第四罐满灌后，则由第三罐改流第五罐，第五罐满灌后改流至第六罐，依次类推。第四、第五、第六罐等罐发酵结束后，送去蒸馏。发酵罐空出后清洗灭菌，再重复以上操作。前面三个发酵罐连续一段时间后停止流加糖化醪，让其发酵，直至送去蒸馏，同样要清洗灭菌。此时可取其他二三个空罐用作前三个罐，加入酒母流加糖化醪。开始新的周期。该方法的特点是使前三罐处于连续主发酵状态，而后面则处于后发酵状态。
第二种方法是由7-8个罐组成一组罐，每个罐之间用溢流管由上一罐上部通入下一罐底部相串连：生产时，先制备发酵罐体积1/3的酒母，加入第一只发酵罐，随后在保持主发酵状态下，流加糖化醪，满罐后，通过溢流管流入第二罐，待第二罐醪液加至1/3体积时，糖化醪改为流加至第二罐。第二罐加满后，流入第三罐，然后重复第二罐操作，直至末罐，最后从首罐至末罐逐个将成熟发酵醪蒸馏。半连续式发酵法的优点是省去了酒母制备；缩短了发酵时间；设备利用率较高；但缺点是对无菌操作要求高。
目前，补料分批发酵已经广泛应用于氨基酸、生长激素、抗生素、维生素、酶蛋白、有机溶剂、有机酸、核苷酸、高聚物等等。补料分批发酵的主要优势包括：解除底物和过程的抑制作用，尽可能达到最优的发酵状态，提高产物的转化率等。
连续培养在工业上主要用于生产微生物细胞、一级代谢产物及与能量产生和细胞增殖有关的代谢产物，如酵母、单细胞蛋白、酒精以及处理工业污水等。但由于相对而言，工业化的膜装备技术以及对生产过程细菌的变异及污染情况等等，使得目前这个技术在其它领域尚不能形成突破，但从发展角度，依然值得不断探索。
单细胞蛋白在饲料和食品工业中有着极其重要的作用, 其开发和生产在我国更具有广阔的前景。相对陆生动植物蛋白源漫长的生产周期，SCP可以规模化、工厂化快速生产，并可以“变废为宝”，促进循环经济的发展。相关的研究也表明，SCP在水产饲料中替代鱼粉或鱼油具有一定的可行性。
因此，开发一种单细胞蛋白产量高、避免资源浪费，节约成本，能够连续生产单细胞蛋白的方法，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，所述方法能够连续生产单细胞蛋白，还能够提高单细胞蛋白的产量，且避免了资源浪费和废弃物的产生。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，所述方法包括：
（1）在主培养基存在下，将解脂耶氏酵母进行发酵培养；（2）步骤（1）发酵培养至菌体OD值为400~450，放料，放料结束后，向其中加入辅培养基，继续发酵培养；（3）重复步骤（2），将放料得到的物料进行离心，得到所述单细胞蛋白；所述主培养基的氮源包括乙酸盐和无水葡萄糖；所述主培养基中，乙酸盐的质量浓度为14~20g/L（例如可以为14 g/L、14.2g/L、14.5 g/L、14.8 g/L、15 g/L、15.2 g/L、15.5 g/L、15.8 g/L、16 g/L、16.2 g/L、16.5g/L、16.8 g/L、17 g/L、17.2 g/L、17.5 g/L、17.8 g/L、18 g/L、18.2 g/L、18.5 g/L、18.8g/L、19 g/L、19.2 g/L、19.5 g/L、19.8 g/L、20 g/L等），无水葡萄糖的质量百分含量为3~5%（例如可以为3 %、3.2 %、3.4 %、3.6 %、3.8 %、4 %、4.2 %、4.4 %、4.6 %、4.8 %、5 %等）。
本发明中，通过在特定配方主培养基存在下对解脂耶氏酵母发酵培养，然后培养至一定时期进行放料和补加辅助培养基，重复该步骤，从而实现单细胞蛋白的连续生产，并且本发明提供的方法得到的单细胞蛋白产量高，且避免了资源浪费和废弃物的产生，并且在特定时间段补加辅助培养基，能够在相对较短的发酵时间内得到高产量的单细胞蛋白。
本发明中，所述菌体OD值为400~450，例如可以为400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450等。
本发明中，所述菌体OD值小于400，会导致单细胞蛋白的产量降低；大于450，会导致发酵时间延长。
优选地，所述乙酸盐包括乙酸钠。
优选地，步骤（1）所述主培养基还包括如下组分：酵母粉2.2~3wt%（例如可以为2.2wt%、2.3 wt%、2.4 wt%、2.5 wt%、2.6 wt%、2.7 wt%、2.8 wt%、2.9 wt%、3 wt%等）、维生素B1100~200mg/L（例如可以为100 mg/L、105 mg/L、110 mg/L、115 mg/L、120 mg/L、125 mg/L、130 mg/L、135 mg/L、140 mg/L、145 mg/L、150 mg/L、155 mg/L、160 mg/L、165 mg/L、170mg/L、175 mg/L、180 mg/L、185 mg/L、190 mg/L、195 mg/L、200 mg/L等）、烟酸150~250mg/L（例如可以为150 mg/L、155 mg/L、160 mg/L、165 mg/L、170 mg/L、175 mg/L、180 mg/L、185mg/L、190 mg/L、195 mg/L、200 mg/L、205 mg/L、210 mg/L、215 mg/L、220 mg/L、225 mg/L、230 mg/L、235 mg/L、240 mg/L、245 mg/L、250 mg/L等）、吡哆醇250~350mg/L（例如可以为250 mg/L、255 mg/L、260 mg/L、265 mg/L、270 mg/L、275 mg/L、280 mg/L、285 mg/L、290mg/L、295 mg/L、300 mg/L、305 mg/L、310 mg/L、315 mg/L、320 mg/L、325 mg/L、330 mg/L、335 mg/L、340 mg/L、345 mg/L、350 mg/L等）、生物素30~50mg/L（例如可以为30 mg/L、32mg/L、34 mg/L、36 mg/L、38 mg/L、40 mg/L、42 mg/L、44 mg/L、46 mg/L、48 mg/L、50 mg/L等）、泛酸钙700~900mg/L（例如可以为700 mg/L、710 mg/L、720 mg/L、730 mg/L、740 mg/L、750 mg/L、760 mg/L、770 mg/L、780 mg/L、790 mg/L、800 mg/L、810 mg/L、820 mg/L、830mg/L、840 mg/L、850 mg/L、860 mg/L、870 mg/L、880 mg/L、890 mg/L、900 mg/L）、核黄素150~250mg/L（例如可以为150 mg/L、155 mg/L、160 mg/L、165 mg/L、170 mg/L、175 mg/L、180 mg/L、185 mg/L、190 mg/L、195 mg/L、200 mg/L、205 mg/L、210 mg/L、215 mg/L、220mg/L、225 mg/L、230 mg/L、235 mg/L、240 mg/L、245 mg/L、250 mg/等）、肌醇5~7g/L（例如可以为5g/L、5.2g/L、5.4g/L、5.6g/L、5.8g/L、6g/L、6.2g/L、6.4g/L、6.6g/L、6.8g/L、7g/L等）、对氨基苯甲酸100~200mg/L（例如可以为100 mg/L、105 mg/L、110 mg/L、115 mg/L、120mg/L、125 mg/L、130 mg/L、135 mg/L、140 mg/L、145 mg/L、150 mg/L、155 mg/L、160 mg/L、165 mg/L、170 mg/L、175 mg/L、180 mg/L、185 mg/L、190 mg/L、195 mg/L、200 mg/L等）。
优选地，步骤（1）所述主培养基还包括如下组分：硼酸350~500mL/L（例如可以为350 mL/L、360 mL/L、370 mL/L、380 mL/L、390 mL/L、400 mL/L、410 mL/L、420 mL/L、430mL/L、440 mL/L、450 mL/L、460 mL/L、470 mL/L、480 mL/L、490 mL/L、500 mL/L等）、硫酸锰100~200mg/L（例如可以为100 mg/L、105 mg/L、110 mg/L、115 mg/L、120 mg/L、125 mg/L、130 mg/L、135 mg/L、140 mg/L、145 mg/L、150 mg/L、155 mg/L、160 mg/L、165 mg/L、170mg/L、175 mg/L、180 mg/L、185 mg/L、190 mg/L、195 mg/L、200mg/等）、硫酸锌 250~400mg/L（例如可以为250 mg/L、255 mg/L、260 mg/L、265 mg/L、270 mg/L、275 mg/L、280 mg/L、285 mg/L、290 mg/L、295 mg/L、300 mg/L、305 mg/L、310 mg/L、315 mg/L、320 mg/L、325mg/L、330 mg/L、335 mg/L、340 mg/L、345 mg/L、350 mg/L、355 mg/L、360 mg/L、365 mg/L、370 mg/L、375 mg/L、380 mg/L、385 mg/L、390 mg/L、395 mg/L、400 mg/L等）、 锰酸钠 150~250mg/L（例如可以为150 mg/L、155 mg/L、160 mg/L、165 mg/L、170 mg/L、175 mg/L、180mg/L、185 mg/L、190 mg/L、195 mg/L、200 mg/L、205 mg/L、210 mg/L、215 mg/L、220 mg/L、225 mg/L、230 mg/L、235 mg/L、240 mg/L、245 mg/L、250 mg/L等）、碘化钾 0.005~0.015mg/L（例如可以为0.005 mg/L、0.006 mg/L、0.007 mg/L、0.008 mg/L、0.009 mg/L、0.01 mg/L、0.011 mg/L、0.012 mg/L、0.013 mg/L、0.014 mg/L、0.015 mg/L等）、氯化钙0.005~0.015g/L（0.005 g/L、0.006 g/L、0.007 g/L、0.008 g/L、0.009 g/L、0.01 g/L、0.011 g/L、0.012 g/L、0.013 g/L、0.014 g/L、0.015 g/L等）、硫酸镁 0.02~0.08g/L（例如可以为0.02 g/L、0.025 g/L、0.03 g/L、0.035 g/L、0.04 g/L、0.045 g/L、0.05 g/L、0.055g/L、0.06 g/L、0.065 g/L、0.07 g/L、0.075 g/L、0.08 g/L等）和氯化钠 0.2~0.8 g/L（例如可以为0.2 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L、0.35 g/L、0.4 g/L、0.45 g/L、0.5 g/L、0.55 g/L、0.6 g/L、0.65 g/L、0.7 g/L、0.75 g/L、0.8 g/L等）。
本发明中，所述主培养基通过各组分以特定含量复配，使得单细胞蛋白的产量高且发酵时间短；并非本发明限定的主培养基组成，会导致单细胞蛋白产量降低，或发酵时间延长。
优选地，所述主培养基的pH值为6~8，例如可以为6、6.5、7、7.5、8等。
本发明中，通过采用28%氨水和50%乙酸调节主培养基的pH值。
优选地，步骤（1）所述解脂耶氏酵母为依次经过一级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）、二级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、三级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基进行扩增培养得到的。
优选地，经一级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基扩增培养得到的菌体OD值为5~8，例如可以为5、5.2、5.4、5.6、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8等。
优选地，经二级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基扩增培养得到的菌体OD值为12~18，例如可以为12、13、14、15、16、17、18等。
优选地，经三级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基扩增培养得到的菌体OD值为40~65，例如可以为40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64等。
优选地，步骤（1）所述发酵培养在发酵罐中进行。
本发明中，将解冻后的解脂耶氏酵母冻存液接种到一级YPD摇瓶中，温度为30~37℃，转速为160~200转/分钟，培养至OD生长到5.2-7.6后，接种到二级YPD培养基，培养至菌体OD值为12~18，然后接种到三级YPD培养基中培养至菌体OD值为40~65，然后接种到发酵罐中进行发酵培养。
优选地，步骤（2）所述辅培养基包括乙酸钠15~30g/L（例如可以为15g/L、16 g/L、17 g/L、18 g/L、19 g/L、20 g/L、21 g/L、22 g/L、23 g/L、24 g/L、25 g/L、26 g/L、27 g/L、28 g/L、29 g/L、30g/L等）、酵母基础氮源（YNB）10~30g/L（例如可以为10 g/L、11 g/L、12g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L、16 g/L、17 g/L、18 g/L、19 g/L、20 g/L、21 g/L、22 g/L、23g/L、24 g/L、25 g/L、26 g/L、27 g/L、28 g/L、29 g/L、30 g/L等）、硫酸锌 600~800mg/L（例如可以为600 mg/L、610 mg/L、620 mg/L、630 mg/L、640 mg/L、650 mg/L、660 mg/L、670mg/L、680 mg/L、690 mg/L、700 mg/L、710 mg/L、720 mg/L、730 mg/L、740 mg/L、750 mg/L、760 mg/L、770 mg/L、780 mg/L、790 mg/L、800 mg/L等）、 锰酸钠 450~550mg/L（例如可以为450 mg/L、460 mg/L、470 mg/L、480 mg/L、490 mg/L、500 mg/L、510 mg/L、520 mg/L、530mg/L、540 mg/L、550 mg/L等）、碘化钾 0.03~0.05mg/L（例如可以为0.03 mg/L、0.032 mg/L、0.034 mg/L、0.036 mg/L、0.038 mg/L、0.04 mg/L、0.042 mg/L、0.044 mg/L、0.046 mg/L、0.048 mg/L、0.05 mg/L等）、氯化钙 0.06~0.08g/L（例如可以为0.06 g/L、0.062 g/L、0.064 g/L、0.066 g/L、0.068 g/L、0.07 g/L、0.072 g/L、0.074 g/L、0.076 g/L、0.078 g/L、0.08 g/L等）、硫酸镁 0.08~0.1g/L（例如可以为0.08 g/L、0.081 g/L、0.082 g/L、0.083g/L、0.084 g/L、0.085 g/L、0.086 g/L、0.087 g/L、0.088 g/L、0.089 g/L、0.09 g/L、0.091 g/L、0.092 g/L、0.094 g/L、0.096 g/L、0.098 g/L、0.1 g/L等）、氯化钠 0.6~0.8g/L（例如可以为0.6 g/L、0.62 g/L、0.64 g/L、0.66 g/L、0.68 g/L、0.7 g/L、0.72 g/L、0.74g/L、0.76 g/L、0.78 g/L、0.8 g/L等）、磷酸氢二钾0.2~1.5 g/L（例如可以为0.2 g/L、0.3g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L、1 g/L、1.1 g/L、1.2 g/L、1.3g/L、1.4 g/L、1.5 g/L等）和磷酸二氢钾 0.5~3 g/L（例如可以为0.5 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2 g/L、2.2 g/L、2.4 g/L、2.6 g/L、2.8 g/L、3 g/L等）。
本发明中，所述辅培养基通过各组分以特定含量复配，使得单细胞蛋白的产量高且发酵时间短。
本发明中，所述主培养基和辅培养基各组分质量浓度或质量百分含量均以水的体积为1L计。
优选地，步骤（2）所述放料的体积为总体积的0.4~0.5倍，例如可以为0.4倍、0.42倍、0.44倍、0.46倍、0.48倍、0.5倍等。
优选地，步骤（2）所述加入辅培养基的体积为放料前总体积的0.4~0.45倍，例如可以为0.4倍、0.41倍、0.42倍、0.44倍、0.45倍等。
本发明中，所述离心的设备包括碟式离心机，离心时的进料速度为0.5~2L/min，每个半个小时进行排渣，得到菌渣和上清液；将所述上清液回流至发酵液中再次离心，经至少三次离心后，除菌过滤，得到的上清液可以再次配制辅助培养基，避免资源浪费。
本发明中，碟式离心机在进料前还包括对其进行清洗的步骤，清洗的转速为9000~10000rpm，水压为0.1~0.2 MPa，清洗时间为10~30s，然后设置排渣周期和排渣时间，开始进料；初始进料速度控制在2L/min以下，等到上清液正常流出后再调整流量。降低进料速度可降低上清液中固形物含量，流量越小分离效果越好；随时留意设备排渣情况，根据物料性质调整排渣周期和排渣时间；排渣周期代表排渣的频率，排渣时间代表一次排渣量大小；物料中固体含量越高，排渣周期应越短，排渣时间越长；延长排渣周期可降低固渣含水量；如果初始进料速度过大，物料在转鼓内停留时间太短，分离效果不理想，可以提前手动排渣，将转鼓清空，然后降低进料速度，继续分离；排出的渣泥可以与物料混合后二次分离。
优选地，步骤（3）所述离心后，还包括将离心得到的菌渣经稀释、低温处理，喷雾干燥的步骤。
优选地，所述稀释包括将得到的菌渣与水混合，至菌体干重浓度为60~80 g/L，例如可以为60 g/L、62 g/L、64 g/L、66 g/L、68 g/L、70 g/L、72 g/L、74 g/L、76 g/L、78 g/L、80 g/L等。
优选地，所述低温处理的温度为2~5℃，例如可以为2℃、3℃、4℃、5℃等；时间为12~16h，例如可以为12 h、13 h、14 h、15 h、16h等。
本发明中，低温处理有助于菌体释放蛋白，提高单细胞蛋白中粗蛋白的含量。
优选地，所述喷雾干燥的进料速度为4.5~6L/h，例如可以为4.5 L/h、4.6 L/h、4.7L/h、4.8 L/h、4.9 L/h、5 L/h、5.1 L/h、5.2 L/h、5.3 L/h、5.4 L/h、5.5 L/h、5.6 L/h、5.7L/h、5.8 L/h、5.9 L/h、6 L/h等；进风温度为120~160℃，例如可以为120℃、130℃、140℃、150℃、160℃等；频率为320~380Hz，例如可以为320 Hz、330 Hz、340 Hz、350 Hz、360 Hz、370 Hz、380 Hz等。
优选地，单细胞蛋白的壁材包括甲基纤维素、藻酸盐或磷酸钙中的至少一种；
优选地，收获单细胞蛋白的间隔时间为20~40 min，例如可以为20 min、22 min、24min、26 min、28 min、30 min、32 min、34 min、36 min、38 min、40 min等。
作为本发明优选的技术方案，所述方法包括：
（1）在主培养基存在下，将菌体OD值为40~65的解脂耶氏酵母接种到发酵罐中进行发酵培养；所述主培养基包括乙酸钠14~20g/L、无水葡萄糖3~5wt%、酵母粉2.2~3wt %、维生素B1 100~200mg/L、烟酸150~250mg/L、吡哆醇250~350mg/L、生物素30~50mg/L、泛酸钙700~900mg/L、核黄素150~250mg/L、肌醇5~7g/L、对氨基苯甲酸100~200mg/L、硼酸350~500mL/L、硫酸锰 100~200mg/L、硫酸锌 250~400mg/L、 锰酸钠 150~250mg/L、碘化钾 0.005~0.015mg/L、氯化钙 0.00 5~0.015g/L、硫酸镁 0.02~0.08g/L和氯化钠 0.2~0.8 g/L；
（2）步骤（1）发酵培养至菌体OD值为400~450，放料，放料结束后，向发酵罐中加入辅培养基，继续发酵培养；所述辅培养基包括乙酸钠15~30g/L、酵母基础氮源10~30g/L、硫酸锌 600~800mg/L、 锰酸钠 450~550mg/L、碘化钾 0.03~0.05mg/L、氯化钙 0.06~0.08g/L、硫酸镁 0.08~0.1g/L、氯化钠 0.6~0.8g/L、磷酸氢二钾0.2~1.5 g/L和磷酸二氢钾 0.5~3 g/L；
（3）重复步骤（2），将放料得到的物料进行离心，将得到的菌渣用水稀释至菌体干重浓度为60~80 g/L后，置于2~5℃下12~16h，然后进行喷雾干燥，喷雾干燥的进料速度为4.5~6L/h，进风温度为120~160℃，频率为320~380Hz，以甲基纤维素、藻酸盐或磷酸钙中的至少一种为壁材，每间隔20~40 min收获单细胞蛋白，最终得到所述单细胞蛋白。
本发明中，所述离心可以将每次放料得到的发酵液进行离心，也可以将连续生产得到的发酵液进行统一离心，通过不断地放料和补料（即补加辅培养基），从而实现单细胞蛋白的连续生产，本发明的生产周期为至少连续发酵30天。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中，通过采用特定配方的主培养基对解脂耶氏酵母进行发酵培养，然后培养至一定时期进行放料和补加辅助培养基，重复该步骤，从而实现单细胞蛋白的连续生产，并且本发明提供的方法得到的单细胞蛋白产量高，避免了资源浪费和废弃物的产生，并且在特定时间段补加辅助培养基，能够在相对较短的发酵时间内得到高产量的单细胞蛋白；本发明提供的方法单细胞蛋白的单位产量≥25g/L/h。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明以下具体实施方式中，干重、产量和粗蛋白含量的测试方法如下：
（1）单细胞蛋白的干重：单位为g/L
称取1.00 L发酵液，8000转/min离心10 min，得到菌体后加入1 L水重悬均匀，再次8000转/min离心10 min，得到湿菌体，称重其质量为m1；从m1中取5.000 g按照国标GB/T6435-2014《饲料中水分的测定》的方法在103±2℃进行烘干，得到干菌体，称其重量m2（精确到4位小数）。
菌体干重DCW = m2/5.000× m1/1.00
（2）产量：单位为g/(L·h)
产量=单细胞蛋白的干重÷高密度发酵的时间（发酵周期）。
（3）粗蛋白含量
按照国标GB/T 6432-2018《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》，经过消煮、氨蒸馏、滴定得到粗蛋白含量（质量分数）。
本发明以下具体实施方式中，解脂耶氏酵母菌种，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：CICC 32291；配制培养基的各个组分均为市售化学品。
种子液的培养：将解冻后的解脂耶氏酵母冻存液接种到一级YPD摇瓶中，条件为温度32℃，转速为180转/分钟，培养至OD生长到6.4后，接种到二级YPD培养基中，生长为温度32℃，转速为180转/分钟，培养至OD生长到15后，接种到三级YPD培养基中，生长为温度32℃，转速为180转/分钟，培养至OD值生长到52后，得到扩增培养的解脂耶氏酵母，备用。
本发明中，术语“OD值”是指发酵液的OD值，经过稀释采用紫外分光光度法测试得到（稀释至紫外分光光度计能够检测到的最低有效数值），具体为：使用紫外分光光度计（Alpha-1106，上海谱元仪器有限公司）检测发酵液600 nm下的OD值。
实施例1
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）在主培养基存在下，将扩增培养后的解脂耶氏酵母接种到1000L发酵罐中进行发酵培养；所述主培养基的体积为400 L，包括乙酸钠18g/L、无水葡萄糖4wt%、酵母粉2.5wt%、维生素B1 150mg/L、烟酸200mg/L、吡哆醇300mg/L、生物素40mg/L、泛酸钙800mg/L、核黄素200mg/L、肌醇6g/L、对氨基苯甲酸150mg/L、硼酸420mL/L、硫酸锰 150mg/L、硫酸锌320mg/L、 锰酸钠 200mg/L、碘化钾 0.01mg/L、氯化钙 0.01g/L、硫酸镁 0.05g/L和氯化钠0.5g/L；主培养基的pH值为7.4；
（2）步骤（1）发酵培养至菌体OD值为420，放料，放料体积为300L，放料结束后，向发酵罐中加入300L辅培养基，继续发酵培养；所述辅培养基包括乙酸钠22g/L、酵母基础氮源20g/L、硫酸锌 700mg/L、 锰酸钠 500mg/L、碘化钾 0.04mg/L、氯化钙 0.07g/L、硫酸镁0.09g/L、氯化钠 0.7g/L、磷酸氢二钾0.8 g/L和磷酸二氢钾 1.6 g/L；
（3）重复步骤（2），连续生产单细胞蛋白，将放料得到的物料进行碟式离心，离心得到的上清液经三次离心后，除菌过滤，可用于再次配制辅助培养基；离心得到的菌渣用水稀释至菌体干重浓度为70 g/L后，置于4℃下16h，然后进行喷雾干燥，喷雾干燥的进料速度为5L/h，进风温度为140℃，频率为340Hz，以磷酸钙为壁材，每间隔30 min收获单细胞蛋白，即得到所述单细胞蛋白。
实施例2
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）在主培养基存在下，将扩增培养后的解脂耶氏酵母接种到1000L发酵罐中进行发酵培养；所述主培养基的体积为400 L，包括乙酸钠16g/L、无水葡萄糖3wt%、酵母粉2.2wt%、维生素B1 120mg/L、烟酸240mg/L、吡哆醇340mg/L、生物素32mg/L、泛酸钙750mg/L、核黄素160mg/L、肌醇5.5g/L、对氨基苯甲酸120mg/L、硼酸480mL/L、硫酸锰 120mg/L、硫酸锌260mg/L、 锰酸钠 240mg/L、碘化钾 0.013mg/L、氯化钙 0.014g/L、硫酸镁 0.02g/L和氯化钠 0.2g/L；主培养基的pH值为6.8；
（2）步骤（1）发酵培养至菌体OD值为400，放料，放料体积为350L，放料结束后，向发酵罐中加入300L辅培养基，继续发酵培养；所述辅培养基包括乙酸钠28g/L、酵母基础氮源12g/L、硫酸锌 650mg/L、 锰酸钠 540mg/L、碘化钾 0.03mg/L、氯化钙 0.08g/L、硫酸镁0.1g/L、氯化钠 0.6g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L和磷酸二氢钾 2.8g/L；
（3）重复步骤（2），连续生产单细胞蛋白，将放料得到的物料进行碟式离心，离心得到的上清液经三次离心后，除菌过滤，可用于再次配制辅助培养基；离心得到的菌渣用水稀释至菌体干重浓度为60 g/L后，置于4℃下12h，然后进行喷雾干燥，喷雾干燥的进料速度为5.5L/h，进风温度为150℃，频率为360Hz，以甲基纤维素为壁材，每间隔30 min收获单细胞蛋白，即得到所述单细胞蛋白。
实施例3
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）在主培养基存在下，将扩增培养后的解脂耶氏酵母接种到1000L发酵罐中进行发酵培养；所述主培养基的体积为400 L，包括乙酸钠20g/L、无水葡萄糖5wt%、酵母粉2.8wt%、维生素B1 180mg/L、烟酸150mg/L、吡哆醇260mg/L、生物素48mg/L、泛酸钙850mg/L、核黄素240mg/L、肌醇6.5g/L、对氨基苯甲酸180mg/L、硼酸360mL/L、硫酸锰 180mg/L、硫酸锌380mg/L、 锰酸钠 160mg/L、碘化钾 0.08mg/L、氯化钙 0.008g/L、硫酸镁 0.08g/L和氯化钠 0.8g/L；主培养基的pH值为7.2；
（2）步骤（1）发酵培养至菌体OD值为400，放料，放料体积为350L，放料结束后，向发酵罐中加入300L辅培养基，继续发酵培养；所述辅培养基包括乙酸钠16g/L、酵母基础氮源28g/L、硫酸锌 760mg/L、 锰酸钠 480mg/L、碘化钾 0.05mg/L、氯化钙 0.06g/L、硫酸镁0.08g/L、氯化钠 0.8g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L和磷酸二氢钾 0.5g/L；
（3）重复步骤（2），连续生产单细胞蛋白，将放料得到的物料进行碟式离心，离心得到的上清液经三次离心后，除菌过滤，可用于再次配制辅助培养基；离心得到的菌渣用水稀释至菌体干重浓度为80 g/L后，置于4℃下14h，然后进行喷雾干燥，喷雾干燥的进料速度为4.5L/h，进风温度为120℃，频率为380Hz，以甲基纤维素为壁材，每间隔30 min收获单细胞蛋白，即得到所述单细胞蛋白。
实施例4
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，所述主培养基的体积为400 L，包括乙酸钠18g/L、无水葡萄糖4wt%、酵母粉4wt %、维生素B180mg/L、烟酸130mg/L、吡哆醇220mg/L、生物素60mg/L、泛酸钙600mg/L、核黄素120mg/L、肌醇4g/L、对氨基苯甲酸80mg/L、硼酸600mL/L、硫酸锰 220mg/L、硫酸锌 420mg/L、 锰酸钠260mg/L、碘化钾 0.017mg/L、氯化钙 0.002g/L、硫酸镁 0.01g/L和氯化钠 0.1g/L，其它步骤均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，所述主培养基的体积为400 L，包括乙酸钠18g/L、无水葡萄糖4wt%、酵母粉2wt %、维生素B1220mg/L、烟酸260mg/L、吡哆醇360mg/L、生物素20mg/L、泛酸钙950mg/L、核黄素260mg/L、肌醇8g/L、对氨基苯甲酸220mg/L、硼酸300mL/L、硫酸锰 80mg/L、硫酸锌 240mg/L、 锰酸钠140mg/L、碘化钾 0.002mg/L、氯化钙 0.017g/L、硫酸镁 0.1g/L和氯化钠 1g/L，其它步骤均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，所述辅培养基包括乙酸钠32g/L、酵母基础氮源8g/L、硫酸锌 550mg/L、 锰酸钠 440mg/L、碘化钾 0.02mg/L、氯化钙 0.1g/L、硫酸镁 0.12g/L、氯化钠 0.5g/L、磷酸氢二钾0.1 g/L和磷酸二氢钾 0.4g/L，其它步骤均与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，所述辅培养基包括乙酸钠12g/L、酵母基础氮源35g/L、硫酸锌 850mg/L、 锰酸钠 580mg/L、碘化钾 0.07mg/L、氯化钙 0.04g/L、硫酸镁 0.06g/L、氯化钠 0.9g/L、磷酸氢二钾1.7 g/L和磷酸二氢钾 3.2g/L，其它步骤均与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，所述主培养基中没有硼酸，调整其它组分用量使得其它组分的配比，培养基总量不变，其它步骤均与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，将所述主培养基中硫酸锌替换为等量的六水合氯化钴，其它步骤均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中发酵培养至菌体OD值为350，放料，其它步骤均与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，所述主培养基中，乙酸钠的质量浓度为12g/L，调整无水葡萄糖的含量使得乙酸钠与无水葡萄糖的总质量不变，其它步骤均与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，所述主培养基中，乙酸钠的质量浓度为24g/L，其它步骤均与实施例1相同。
本发明实施例1~10、对比例1~3提供的方法得到的单细胞蛋白的产量及粗蛋白含量如表1所示。
表1
由表1可知，本发明提供的连续流生产单细胞蛋白的方法，通过控制主培养基的配方，并且发酵至一定时期进行放料和补料，同时控制补加的培养基采用特定配方，通过持续进行放料和补料，可以使得单细胞蛋白的不间断生产，并且采用本发明提供的方法使得单细胞蛋白的单位产量高，利用1000L发酵罐4每小时能连续生产350L发酵液，产出至少42kg单细胞蛋白产品；极大的减少了废弃物的产生和再利用了资源。
由实施例1与实施例4~9比较可知，本发明提供的方法，主培养基和辅培养基并非特定的组成，会导致单细胞蛋白的产量和粗蛋白含量降低。
由实施例1与对比例1~3比较可知，本发明提供的方法， OD值为350放料，未生长到最大速率，导致产量低，粗蛋白含量低；乙酸钠不在限定的范围内，会导致菌体生长缓慢或抑制菌体生长，都会导致产量和粗蛋白含量降低。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种连续流生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）在主培养基存在下，将解脂耶氏酵母进行发酵培养；
（2）步骤（1）发酵培养至菌体OD值为400~450，放料，放料结束后，向其中加入辅培养基，继续发酵培养；
（3）重复步骤（2），将放料得到的物料进行离心，得到所述单细胞蛋白；
步骤（1）所述主培养基包括乙酸钠14~20g/L、无水葡萄糖3~5%、酵母粉2.2~3wt%、维生素B1 100~200mg/L、烟酸150~250mg/L、吡哆醇250~350mg/L、生物素30~50mg/L、泛酸钙700~900mg/L、核黄素150~250mg/L、肌醇5~7 g/L、对氨基苯甲酸100~200mg/L、硼酸350~500mL/L、硫酸锰 100~200mg/L、硫酸锌 250~400mg/L、锰酸钠150~250mg/L、碘化钾 0.005~0.015mg/L、氯化钙0.00 5~0.015g/L、硫酸镁0.02~0.08g/L和氯化钠0.2~0.8 g/L；
步骤（2）所述辅培养基包括乙酸钠15~30g/L、酵母基础氮源10~30g/L、硫酸锌600~800mg/L、 锰酸钠 450~550mg/L、碘化钾0.03~0.05mg/L、氯化钙0.06~0.08g/L、硫酸镁0.08~0.1g/L、氯化钠0.6~0.8g/L、磷酸氢二钾0.2~1.5 g/L和磷酸二氢钾0.5~3 g/L；
步骤（3）所述离心后，还包括将离心得到的菌渣经稀释、低温处理，喷雾干燥的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述主培养基的pH值为6~8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述解脂耶氏酵母为依次经过一级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、二级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、三级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基进行扩增培养得到的；
经一级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基扩增培养得到的菌体OD值为5~8；
经二级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基扩增培养得到的菌体OD值为12~18；
经三级酵母浸出粉胨葡萄糖培养基扩增培养得到的菌体OD值为40~65；
步骤（1）所述发酵培养在发酵罐中进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述放料的体积为总体积的0.4~0.5倍；
步骤（2）所述加入辅培养基的体积为放料前总体积的0.4~0.45倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释包括将得到的菌渣与水混合，至菌体干重浓度为60~80 g/L；
所述低温处理的温度为2~5℃，时间为12~16h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述喷雾干燥的进料速度为4.5~6L/h，进风温度为120~160℃，频率为320~380Hz。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单细胞蛋白的壁材为甲基纤维素、藻酸盐或磷酸钙中的至少一种；
收获单细胞蛋白的间隔时间为20~40 min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）在主培养基存在下，将菌体OD值为40~65的解脂耶氏酵母接种到发酵罐中进行发酵培养；所述主培养基包括乙酸钠14~20g/L、无水葡萄糖3~5wt%、酵母粉2.2~3wt %、维生素B1100~200mg/L、烟酸150~250mg/L、吡哆醇250~350mg/L、生物素30~50mg/L、泛酸钙700~900mg/L、核黄素150~250mg/L、肌醇5~7g/L、对氨基苯甲酸100~200mg/L、硼酸350~500mL/L、硫酸锰 100~200mg/L、磷酸锌250~400mg/L、 锰酸钠 150~250mg/L、碘化钾 0.005~0.015mg/L、氯化钙0.005~0.015g/L、硫酸镁 0.02~0.08g/L和氯化钠0.2~0.8 g/L；
（2）步骤（1）发酵培养至菌体OD值为400~450，放料，放料结束后，向发酵罐中加入辅培养基，继续发酵培养；所述辅培养基包括乙酸钠15~30g/L、酵母基础氮源10~30g/L、硫酸锌600~800mg/L、 锰酸钠 450~550mg/L、碘化钾 0.03~0.05mg/L、氯化钙0.06~0.08g/L、硫酸镁 0.08~0.1g/L、氯化钠0.6~0.8g/L、磷酸氢二钾0.2~1.5 g/L和磷酸二氢钾0.5~3 g/L；
（3）重复步骤（2），将放料得到的物料进行离心，将得到的菌渣用水稀释至菌体干重浓度为60~80 g/L后，置于2~5℃下12~16h，然后进行喷雾干燥，喷雾干燥的进料速度为4.5~6L/h，进风温度为120~160℃，频率为320~380Hz，以甲基纤维素、藻酸盐或磷酸钙中的至少一种为壁材，每间隔20~40 min收获单细胞蛋白，最终得到所述单细胞蛋白。
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