CN108624506A - 微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法 - Google Patents

微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法，包括如下步骤：1)微藻和酵母细胞的纯培养，分别得到微藻种子液和酵母种子液；2)将沼液预处理获得的上清液进行稀释、调配，获得混合培养的沼液培养基；3)将微藻种子液和酵母的种子液按比例接种于沼液培养基，建立混合培养体系；4)排出经净化后的沼液采收微生物生物质。该方法处理沼液的同时，实现高蛋白生物质的回收，最大限度减少废弃物的排放，达到资源回收与转化、节能、减排、增效的目的，实现循环经济、变废为宝、绿色生产。

Description

微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及微藻和酵母混合培养技术，主要涉及一种通过微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法。
背景技术
沼液是沼气生产的副产物，其处理和再利用一直是沼气工业发展的主要瓶颈。为了规避沼液直接用于农业灌溉存在的生态风险及处理量有限的问题，常利用好氧生物处理方法降低沼液中氮、磷、有机物等成分，但是该方法产生的大量活性污泥及CO2等很难再利用，造成二次污染和碳排放，不符合资源化循环利用的要求。
沼液氮磷营养充足，可满足微藻生长的氮磷需求，且微藻生长可以使沼液达到理想的氮磷去除效果。向体系中加入微藻可以利用的无机碳源和简单有机碳源(醋酸盐、甘油等)可以促进微藻的生长及氮磷去除效果。另外，通过与能利用有机物、释放CO2的异养微生物共培养可强化有机污染物的进一步降解和碳源的供应，如某些油脂酵母(如Yarrowialipolytic)除了可以利用体系中原有的有机物进行生长外，还可以利用廉价有机碳源(如生物柴油生产产生的粗甘油副产物)进行微生物油脂的生产并释放CO2。微藻-油脂酵母混合培养相较于单培养体系，在污染物去除以及微生物生物质积累方面具有明显的优势。
目前，微藻和酵母混合培养的研究受到广泛的关注：例如公开号为CN200910237936.5的中国专利申请，公开了一种利用混合培养酵母和藻类生产油脂的方法；公开号为CN03105314.9的中国专利申请，公开了一种藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法。上述研究在阐述油脂及虾青素生产方面的应用，但是至今还没有利用微藻和酵母混合培养技术处理沼液的研究。因此，开发一种基于微藻和酵母混合培养的沼液处理联产微生物生物质的方法对解决沼液的资源化利用问题实属必要。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种微藻和酵母混合培养处理沼液并产生微生物生物质的方法，处理沼液的同时实现生物质的回收，最大限度减少氮磷的排放。
本发明的技术目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明所述微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法，包括如下步骤：
1)微藻和酵母细胞的纯培养，分别得到微藻种子液和酵母种子液；
2)将沼液预处理获得的上清液进行稀释、调配，获得混合培养的沼液培养基；
3)将微藻种子液和酵母的种子液按比例接种于沼液培养基，建立混合培养体系；
4)排出经净化后的沼液，采收微生物生物质。
优选地，本发明步骤1)中所述微藻为小球藻、栅藻或胶球藻等绿藻；优选地，所述微藻为光合自养或兼养的小球藻菌株，可选自普通小球藻、蛋白核小球藻、椭圆小球藻、原壳小球藻中的一种；所述酵母细胞选自以甘油为碳源的好氧菌株，可选自亚罗解脂酵母、粘红酵母、斯式油脂酵母、深红酵母、发夫红酵母、热带假丝酵母中的一种。本发明所述小球藻优选为普通小球藻或蛋白核小球藻，所述酵母选自亚罗解脂酵母。
更优选地，步骤1)中纯培养条件为：温度25-30℃，光照强度40-80μmol photons/m2/s，转速150-200转/分，培养天数5-8天。
具体地，本发明步骤2)中所述沼液的预处理包括如下步骤：自然沉降并离心，置于光生物反应器中消毒杀菌。
更为具体地，本发明步骤2)中所述沼液上清液中的总氮含量在436mg/L以上，氨氮含量为385mg/L以上，总磷含量为58mg/L以上，COD含量为1278mg/L以上，pH值为7.3-8.5。
优选地，本发明步骤2)中所述稀释指使用自来水、天然水体水或培养过程回水进行稀释，稀释比例为1:1至1:5之间；所述调配指将稀释后沼液的pH值调节至7.0±0.5，并补充碳源。
优选地，本发明所述碳源是指纯甘油或粗甘油(生物柴油副产物)，且最终的浓度为1-5g/L。
优选地，本发明步骤3)中所述混合培养条件为：温度25-30℃，光照强度40-80μmolphotons/m2/s，转速150-200转/分，培养天数5-8天。
优选地，本发明步骤3)中所述接种比例是指微藻与酵母细胞数比例(3-5):1，所述酵母细胞的起始浓度为0.1-1×107细胞/mL。
优选地，本发明步骤4)中所述微生物生物质是通过如下步骤获得：采收藻液、干燥得到生物质干粉；采收培养液的触发条件为：当NH3-N(mg/L)和TP(mg/L)含量低于5mg/L时。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，所述微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法具有如下优势：
1)、该方法无活性污泥产生，引入的甘油(或粗甘油)可转化为微生物生物质，无残留；
2)、在处理沼液的同时实现生物质的回收，最大限度减少氮磷排放，达到资源回收和转化、减排、增效的目的，实现循环经济、变废为宝、绿色生产。
附图说明
图1是本发明微藻和酵母单培养及混合培养下沼液中生物量变化积累情况图。
具体实施方式
本发明以奶牛场的沼液为例，也适用于所有类型的沼液。本发明实施具体步骤如下：
(1)将奶牛场沼液进行预处理：经自然沉降和离心，以去除沼液中的固形物，从而降低光的通透性，有利于微藻的混养生长。然后置于光生物反应器中(包括摇瓶、柱状光生物反应器、平板光生物反应器、管道光生物反应器及开放池)，进行消毒杀菌处理。
经预处理所获得的上清液，总氮含量在436mg/L以上，氨氮含量为385mg/L以上，总磷含量为58mg/L以上，COD含量为1278mg/L以上，pH值为7.3-8.5。
对处理后的沼液进行稀释、调配，以满足微藻和酵母的生长需求。稀释为使用自来水或天然水体水或及培养过程回水对经预处理获得的上清液进行稀释，其稀释比例为1:1至1:5之间；所述的调配指通过加入1N的HCl溶液调节pH值至7.0±0.5，并加入最终的浓度为1-5g/L甘油或粗甘油作为碳源。
(2)在装有经预处理的奶牛场沼液的光生物反应器中接种处于对数生长的微藻和酵母细胞进行混合培养。微藻与酵母需满足特定的接种比例：小球藻和酵母细胞数浓度比例(3-5):1，酵母细胞起始浓度为0.1-1×107细胞/mL。
所用酵母菌株为可以利用甘油为碳源的好氧菌株(亚罗解脂酵母、粘红酵母、斯式油脂酵母、深红酵母、发夫红酵母、热带假丝酵母中的一种)，小球藻为光合自养或兼养菌株(普通小球藻、蛋白核小球藻、椭圆小球藻、原壳小球藻中的一种)。优选的，普通小球藻/蛋白核小球藻和亚罗解脂酵母混合培养处理沼液的效果较为理想。
混合培养为：温度25-30℃，光照强度40-80μmol photons/m2/s，转速150-200转/分，培养4-8天。当NH3(mg/L)和TP(mg/L)含量低于5mg/L时可进行采收。
(3)培养结束后，通过超滤装置采收藻细胞制备浓缩液，离心得到湿泥，并干燥得到生物质干粉。此工艺可将沼液中氮磷等营养物质连同加入体系的低价值甘油转化为微生物生物质，获得微生物生物质含有蛋白、油脂、碳水化合物，可作为单细胞蛋白、单细胞油脂及化工产品的原料，实现了氮磷减排、沼液净化和废水的资源化利用。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
利用牛场沼液进行微藻-酵母混合培养(甘油浓度2g/L)
1.1藻种活化及种子液制备
从活化的BG11培养基固体平板上挑取一个普通小球藻(Chlorella vulgaris)单藻落，接种到装有BG11培养基的250mL三角瓶中，装液量为100mL。置于温度为28℃，光强为40μmol photons/m2/s、150转/分的恒温摇床中培养6天，培养过程中通入2％的无菌CO2。从活化的YPD培养基固体平板上挑取一个亚罗解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)单菌落，接种到装有YPD培养基的250mL三角瓶中，装液量为100mL。置于温度为28℃，150转/分的恒温摇床中培养24小时。
1.2沼液的预处理及接种
将牛场沼液经沉降、离心预处理后，加入等体积自来水稀释，用1N的盐酸调节pH至7.04，经过0.22μm无菌滤膜过滤后后，装入250mL三角瓶中，装液量为100mL，然后加入无菌甘油使得其终浓度为2g/L。将普通小球藻种子液和亚罗解脂酵母的种子液种到培养体系中，使培养起始的藻细胞浓度为24.5×106细胞/mL，酵母为8.05×106细胞/mL。初始时培养液指标为：TN 218mg/L、NH3-N 192.5mg/L、TP 29mg/L。
1.3培养方法
混合培养为：温度27℃，光照强度40μmol photons/m2/s，转速170转/分，培养6天。
1.4测试方法
1.3.1废水中TN、NH3-N、TP含量测定
使用美国HACH公司的专用试剂盒，TN、NH3-N、TP的测定范围分别为0-150mg/L、0-50mg/L、0-3.5mg/L。按照试剂盒标准操作步骤。每个样品重复测定三次后取平均值，测定读数乘以样品稀释倍数，即为待测水样中TN、NH3-N、TP含量。
1.5生物量测定
当NH3-N(mg/L)和TP(mg/L)含量低于5mg/L时，将培养液经离心，所得湿泥用去离子水重悬，重复离心获得生物量。将生物量转移至预称重的1.5mL离心管中，高速离心(12000转/分离心5分钟)，去除上清液，放入60℃烘箱烘干并称重。
1.6结果分析
以TN、NH3-N、TP去除率为指标，反映废水的净化情况。如表1所示，培养前后混合培养的TP去除率可达到100％，TN、NH3-N去除率分别为88.26％、99.74％。
表1：微藻和酵母单培养和混合培养下沼液净化效果对比
表2：微藻和酵母单培养和混合培养获得的生物质对比
生物质产率(g/L/d) 最大生物量浓度(g/L)
单藻培养 0.13±0.010 0.85±0.098
单酵母培养 0.09±0.003 0.92±0.005
混合培养 0.21±0.026 1.62±0.196
表3：微藻和酵母单培养和混合培养获得的生物质营养对比
单培养和混合培养体系中生物量的变化规律及最终产率情况如图1和表2。分析可知经过144h培养，混合培养获得的最大生物质浓度(1.62g/L)，大于单藻培养体系(0.85g/L)和单酵母培养体系(0.92g/L)，混合培养体系的生物质产率(0.21g/L/d)大于单藻培养(0.13g/L/d)和单酵母(0.09g/L/d)培养体系。
单培养和混合培养体系获得的生物质的营养分析及产出情况如表3，分析可知，混合培养获得油脂和蛋白的产量(0.31g/L和0.51g/L)，大于单藻培养体系(0.28g/L和0.22g/L)和单酵母培养体系(0.04g/L和0.18g/L)。综合考虑氮磷的去除、生物质产出、油脂及蛋白产出，混合培养体系相较于单培养体系具有明显优势。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种微藻和酵母混合培养净化沼液联产微生物生物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)微藻和酵母细胞的纯培养，分别得到微藻种子液和酵母种子液；
2)将沼液预处理获得的上清液进行稀释、调配，获得混合培养的沼液培养基；
3)将微藻种子液和酵母的种子液按比例接种于沼液培养基，建立混合培养体系；
4)排出经净化后的沼液采收微生物生物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述微藻为小球藻、栅藻或胶球藻；优选地，所述微藻为光合自养或兼养的小球藻菌株，选自普通小球藻、蛋白核小球藻、椭圆小球藻、原壳小球藻中的一种；所述酵母细胞选自以甘油为碳源的好氧菌株，选自亚罗解脂酵母、粘红酵母、斯式油脂酵母、深红酵母、发夫红酵母、热带假丝酵母中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，步骤1)中，纯培养条件为：温度25-30℃，光照强度40-80μmol photons/m2/s，转速150-200转/分，培养天数5-8天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述沼液的预处理包括如下步骤：
自然沉降并离心，置于光生物反应器中消毒杀菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述沼液上清液中的总氮含量在436mg/L以上，氨氮含量为385mg/L以上，总磷含量为58mg/L以上，COD含量为1278mg/L以上，pH值为7.3-8.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述稀释指使用自来水、天然水体水或培养过程回水进行稀释，稀释比例为1:1至1:5之间；所述调配指将稀释后沼液的pH值调节至7.0±0.5，并补充碳源。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳源是指纯甘油或粗甘油，且最终的浓度为1-5g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述混合培养条件为：温度25-30℃，光照强度40-80μmol photons/m2/s，转速150-200转/分，培养天数5-8天。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述接种比例是指微藻与酵母细胞数比例(3-5):1，所述酵母细胞的起始浓度为0.1-1×107细胞/mL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述微生物生物质是通过如下步骤获得：采收藻液、干燥得到生物质干粉；采收培养液触发条件为：当NH3-N(mg/L)和TP(mg/L)含量低于5mg/L时。
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