CN117384299B - 靶向bcma和/或fcrh5的嵌合抗原受体、car-t细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体、CAR‑T细胞及其应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明以BCMA以及FCRH5蛋白为靶点，制备一种靶向BCMA和/或FCRH5的纳米抗体，并进一步获得人源化纳米抗体，构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，能够特异性识别和清除B细胞成熟抗原蛋白阳性肿瘤细胞，特别适用于多发性骨髓瘤的治疗，为多发性骨髓瘤等B细胞成熟抗原蛋白阳性肿瘤免疫治疗提供了一个有前景的治疗手段。

Description

靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体、CAR-T细胞及其应用
本申请为申请号2022113551793、申请日2022年11月1日、发明名称“一种靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体、CAR-T细胞及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
多发性骨髓瘤(MM)是一种不可治愈的浆细胞恶性肿瘤，其特征是骨髓中异常浆细胞的生长异常和完整的单克隆免疫球蛋白的过度生产，最终导致临床表现包括骨骼病变、肾功能衰竭、贫血和高钙血症。B细胞成熟抗原(BCMA)或CD269抗原，是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一。由185个氨基酸残基组成的III型跨膜蛋白，属TNF受体超家族，其配体属于TNF超家族，如增殖诱导配体(APRIL)、B淋巴细胞刺激因子(BAFF)，BCMA与其配体结合后，可激活B细胞的增殖和存活。BCMA特异地高表达于浆细胞和多发性骨髓瘤细胞表面，而在造血干细胞和其他正常组织细胞中均不表达，BCMA也会从细胞表面脱落，形成可在循环中检测到的可溶性BCMA，其水平越高，临床预后越差。因此BCMA可以作为MM的靶向性治疗的理想靶点。
几乎所有MM患者在初始治疗或挽救治疗后最终都会复发，目前仍需要研究新的靶点和治疗方法。FcRH5是一种含有Ig结构域的I型膜蛋白，仅在B细胞谱系中表达。FcRH5基因位于1q21.4中的染色体断点附近，FcRH5蛋白表达于前B细胞(pre-B cell)开始的各种B细胞谱系，与其他B细胞特异性标志物不同，FcRH5蛋白在扁桃体、脾脏和骨髓浆细胞中保持表达。研究者对收集来的大量肿瘤和正常细胞样品进行了分析，发现FcRH5蛋白表达于所有多发性骨髓瘤细胞和正常浆细胞上，且二者间在表达水平上无显著区别，但都高于正常的B细胞。由于浆细胞的异常增殖，多发性骨髓瘤患者浆细胞中的FcRH5表达要大大高于正常个体。Cevostamab(RG 6160)是一种基于IgG的人源化双特异性抗体，可与骨髓瘤细胞上FcRH5的近膜结构域和T细胞上的CD3结合。双结合促进T细胞活化和有效杀死骨髓瘤细胞。罗氏(Roche)首次公布的靶向复发或难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)的抗体药cevostamab临床安全性和有效性数据。结果显示，在既往接受过多种疗法治疗的R/R MM患者中，cevostamab表现出显著疗效，并具有可控的安全性。
基于抗体的细胞免疫疗法对血液恶性肿瘤患者具有显著的临床有益效果，以BCMA为靶点的CAR-T已用于多发性骨髓瘤的临床试验。虽然目前的多发性骨髓瘤疗法通常会产生缓解，但是几乎所有患者最终都会复发。为了防止BCMACAR-T治疗后BCMA阴性复发，双特异性抗原靶点的CAR-T也许是一个治疗选择。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体、CAR-T细胞及其应用。本发明以BCMA和FCRH5蛋白为靶点，制备靶向BCMA的纳米抗体，并进一步获得人源化纳米抗体，构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，能够特异性识别和清除BCMA或/和FCRH5阳性肿瘤细胞，特别适用于多发性骨髓瘤的治疗，为多发性骨髓瘤等肿瘤免疫治疗提供了一个有前景的治疗手段。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体，其至少包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述抗原结合结构域含有抗BCMA单域抗体和/或抗FCRH5单域抗体；
其中，所述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列选自：
(a1)如SEQ ID NO.5、7、9、11、18、20、22所示的氨基酸序列；或，
(a2)如SEQ ID NO.5、7、9、11、18、20、22所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能的变体；
所述抗FCRH5单域抗体的氨基酸序列选自：
(a3)如SEQ ID NO.24、26、28所示的氨基酸序列；或，
(a4)如SEQ ID NO.24、26、28所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合FCRH5和诱导T细胞信号传导功能的变体；
本发明中通过对大量BCMA及FCRH5抗体进行筛选，从而获得上述抗BCMA单域抗体和抗FCRH5单域抗体，通过其结合在嵌合抗原受体的抗原结合结构域，从而能够显著提高嵌合抗原受体的治疗效果；并进一步对抗BCMA单域抗体和抗FCRH5单域抗体进行人源化处理，且进行双靶点组合，从而从而获得的CAR-T细胞其具有更佳的抗肿瘤靶向性，且具有更高的安全性，提高治疗效果。当进行双靶点组合时，所述抗BCMA单域抗体和抗FCRH5单域抗体之间可以通过柔性连接肽连接，所述柔性连接肽可以为G4S3、G4S5或G4S7，在此不做具体限定。
根据本发明，所述嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、结合BCMA抗原的上述抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、人4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。
本发明的第二个方面，编码如第一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸。
本发明的第三各方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核苷酸。
根据本发明，所述重组表达载体可以为病毒载体。
本发明的第四个方面，提供一种T细胞，所述T细胞是由上述靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。所述T细胞为CAR-T细胞。本发明所采用的针对BCMA和/或FCRH5的CAR-T技术，是一种综合肿瘤单克隆抗体的免疫治疗和肿瘤的过继免疫治疗优点的靶向治疗技术。本发明为B细胞成熟抗原蛋白的表达相关肿瘤特别是多发性骨髓瘤的CAR-T治疗提供了新的治疗手段。
本发明的第五个方面，提供第一方面所述嵌合抗原受体、第二方面所述核苷酸、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述T细胞在如下任意一种或多种中的应用：
(b1)制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞；
(b2)制备肿瘤治疗药物。
其中，所述肿瘤为与B细胞成熟抗原蛋白表达相关的肿瘤疾病，包括但不限于多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病和胶质母细胞瘤等，优选为多发性骨髓瘤。
本发明的第六个方面，提供一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物其活性成分至少包含第四方面所述T细胞。
本发明的第七个方面，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括：
所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述T细胞或药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供通过对大量BCMA和FCRH5的表达抗体进行筛选，获得一系列新的抗BCMA抗体和抗FCRH5抗体，从而能够与BCMA抗原及FCRH5抗原结合，从而实现更佳的肿瘤治疗效果。
上述技术方案提供的抗BCMA蛋白的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，通过靶向肿瘤细胞表面的BCMA蛋白并激活T细胞下游的信号通路，赋予T细胞杀伤带有BCMA靶点肿瘤细胞的能力，特别的，为了防止BCMA CAR-T治疗后BCMA阴性复发，采用一个CAR具有2个特异性的靶点，即BCMA/FCRH5双特异性的CAR，靶向B细胞发育的各个阶段，进而进一步加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，可高效特异地治疗多发性骨髓瘤。
特别需要指出的是，上述嵌合抗原受体中的羊驼的单域抗体(VHH)的特殊结构，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位(只有15KDa)，除了可以识别一些常规表位外，由于其分子量很小，CDR3区较长，成环向外延伸，还可以识别常规抗体无识别抗原表位，此外还有稳定性好，对人的免疫原性弱等优势，增强CAR-T在体内的持续和安全性，降低肿瘤的复发几率，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中BCMA-huFc蛋白的SDS-PAGE图，其中，左图lane M为蛋白MWmarker，Lane 1为5μg BCMA-huFc蛋白；
图2为本发明实施例中FCRH5-huFc蛋白的SDS-PAGE图，其中，左图lane M为蛋白MWmarker，Lane 1为5μg FCRH5-huFc蛋白；
图3为本发明实施例中使用Vector NTI进行序列分析图；
图4为本发明实施例中克隆33-A1、33-A11、33-F10、33-F2与目的蛋白的结合图；
图5为本发明实施例中抗体33-A1、33-A11、33-F10、33-F2-VHH-huFc融合抗体和CHO-K1/CHO-K1-BCMA细胞结合的情况图；
图6为本发明实施例中比较UTD、33-A1-BBZ、33-A11-BBZ、33-F10-BBZ、33-F2-BBZCAR-T细胞的体外杀伤活性图；
图7为本发明实施例中四种BCMA CAR-T细胞的抗肿瘤活性图；
图8为本发明实施例中使用33-A1-VHH、33-A11-VHH抗体作为流动相对单域抗体进行亲和力测定图；
图9为本发明实施例中人源化后BCMA CAR-T细胞的抗肿瘤活性图；
图10为本发明实施例中人源化后BCMA CAR-T细胞以及上市CAR-T产品的抗肿瘤活性图。
图11为本发明实施例中克隆5F7与目的蛋白的结合图；
图12为本发明实施例中使用5F7抗体作为流动相对单域抗体进行亲和力测定图；
图13为本发明实施例中人源化FCRH5 CAR-T细胞的抗肿瘤活性图；
图14为本发明实施例中人源化BCMA/FCRH5 CAR-T细胞的抗肿瘤活性图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其至少包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述抗原结合结构域含有抗BCMA单域抗体和/或抗FCRH5单域抗体；
其中，所述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列选自：
(a1)如SEQ ID NO.5、7、9、11、18、20、22所示的氨基酸序列；或，
(a2)如SEQ ID NO.5、7、9、11、18、20、22所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能的变体。
本发明的又一具体实施方式中，所述如SEQ ID NO.5、7、9、11、18、20、22所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQ ID NO.5、7、9、11、18、20、22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，包括但不限于91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗BCMA单域抗体的核苷酸序列包含具有如SEQ ID NO.6、8、10、12、19、21、23所示的序列。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗BCMA单域抗体的核苷酸序列包含与SEQ IDNO.6、8、10、12、19、21、23所示的序列具有至少85％，例如可以是85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的变体，其表达的蛋白具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。
所述抗FCRH5单域抗体的氨基酸序列选自：
(a3)如SEQ ID NO.24、26、28所示的氨基酸序列；或，
(a4)如SEQ ID NO.24、26、28所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合FCRH5和诱导T细胞信号传导功能的变体；
本发明的又一具体实施方式中，所述如SEQ ID NO.24、26、28所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQ ID NO.24、26、28所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，包括但不限于91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合FCRH5和诱导T细胞信号传导功能。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗FCRH5单域抗体的核苷酸序列包含具有如SEQ ID NO.25、27、29所示的序列。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗BCMA单域抗体的核苷酸序列包含与SEQ IDNO.25、27、29所示的序列具有至少85％，例如可以是85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的变体，其表达的蛋白具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合FCRH5和诱导T细胞信号传导功能。
本发明中通过对大量BCMA及FCRH5抗体进行筛选，从而获得上述抗BCMA单域抗体和抗FCRH5单域抗体，通过其结合在嵌合抗原受体的抗原结合结构域，从而能够显著提高嵌合抗原受体的治疗效果；并进一步对抗BCMA单域抗体和抗FCRH5单域抗体进行人源化处理，且进行双靶点组合，从而从而获得的CAR-T细胞其具有更佳的抗肿瘤靶向性，且具有更高的安全性，提高治疗效果。当进行双靶点组合时，所述抗BCMA单域抗体和抗FCRH5单域抗体之间可以通过柔性连接肽连接，所述柔性连接肽可以为G4S3、G4S5或G4S7，在此不做具体限定。
本发明的又一具体实施方式中，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域和/或CD28跨膜结构域；
优选为CD8跨膜结构域，所述CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明的又一具体实施方式中，所述胞内结构域还可以包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域。
本发明的又一具体实施方式中，所述共刺激信号传导结构域包括但不限于人4-1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或多种的组合，优选为人4-1BB胞内区；所述人4-1BB胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
所述CD3ζ信号传导域其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗原结合结构域和跨膜结构域可通过铰链区进行连接，所述铰链区可以包含IgG1铰链区和/或CD8铰链区；优选的，所述铰链区为CD8铰链区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明的又一具体实施方式中，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽都是可行的，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，因此所述嵌合抗原受体还包括信号肽，优选为CD8α信号肽；所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明的又一具体实施方式中，所述嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、结合BCMA抗原的上述抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、人4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。
本发明的又一具体实施方式中，编码如第一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核苷酸。
根据本发明，所述重组表达载体可以为病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒表达载体或质粒，优选为慢病毒载体。
所述慢病毒载体包含上述靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
所述慢病毒载体的构建方法可采用现有已知方法进行，在实施例中具有详细说明，在此不再赘述。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种T细胞，所述T细胞是由上述靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。所述T细胞为CAR-T细胞。本发明所采用的针对BCMA和/或FCRH5的CAR-T技术，是一种综合肿瘤单克隆抗体的免疫治疗和肿瘤的过继免疫治疗优点的靶向治疗技术。本发明为BCMA阳性肿瘤特别是多发性骨髓瘤的CAR-T治疗提供了新的治疗手段。
所述T细胞具体可以为采用如第一方面所述的靶向BCMA和/或FCRH5的嵌合抗原受体通过其编码的核苷酸序列转染至T细胞中表达获得。
本发明的又一具体实施方式中，所述转染的方式为可通过重组表达载体转染到T细胞，优选为通过病毒载体(包括慢病毒载体)转染到T细胞。
本发明中，所述T细胞具有良好的靶向杀伤作用，同时能够释放相关免疫因子(如IFN-γ、IL-2)，从而具备低毒性高免疫杀伤反应性质。
本发明的又一具体实施方式中，提供第一方面所述嵌合抗原受体、第二方面所述核苷酸、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述T细胞在如下任意一种或多种中的应用：
(b1)制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞；
(b2)制备肿瘤治疗药物。
其中，所述肿瘤为与B细胞成熟抗原蛋白的表达相关的肿瘤疾病，包括但不限于多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病和胶质母细胞瘤等，优选为多发性骨髓瘤。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物其活性成分至少包含第四方面所述T细胞。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括：
所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述T细胞或药物。
所述肿瘤为与B细胞成熟抗原蛋白的表达相关的肿瘤疾病，包括但不限于多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病和胶质母细胞瘤等，优选为多发性骨髓瘤。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.BCMA、FCRH5重组蛋白的制备
(1)BCMAhuFc、FCRH5_huFc表达质粒的构建
体外合成编码人BCMA的胞外段Met1-Ala54(SEQ ID NO:1)的基因，***至含有人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330的真核表达质粒中，中间以“6*His-enterokinasesite(ek)”相连接，形成融合表达蛋白BCMA_huFc(SEQ ID NO.2所示)。体外合成编码人FCRH5的胞外段Gln16-Gly851(SEQ ID NO.3)的基因,***至含有人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330的真核表达质粒中，中间以“6*His-enterokinase site(ek)”相连接，形成融合表达蛋白FCRH5_huFc(SEQ ID NO.4所示)。
(2)BCMA_huFc和FCRH5_huFc病毒包装
a.转染前一天，接种3×105/ml HEK293T细胞于10cm培养皿(本部分后续操作均为两份，一份是BCMA_huFc，另一份是FCRH5_huFc)。
b.转染当天，HEK293T细胞汇合度达到70％左右,吸弃原有培养基，用PBS洗一遍，加入9mlDMEM不完全培养，置于37℃、5％ CO2培养箱，待用。
c.准备PEI-DNA复合物：取1mL DMEM至一个1.5ml无菌离心管中，分别加入7.5μgBCMA_huFc质粒、5.7μg pGP、3.75μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入50.75μL 1μg/μL PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10-15min。
d.转染：将上述DNA-PEI复合物逐滴加入到一个10cm培养皿中，“米”字型轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，培养6～8h后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基(DMEM+10％ FBS)。将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，培养48h。
e.首次收毒：收集培养皿中的培养液至50mL无菌离心管中，置于4℃待用。沿培养皿边缘小心的加入10mL新鲜的完全培养基[DMEM+10％ FBS]，将培养皿置于37℃、5％ CO2培养箱，继续培养24h。将收集的病毒液。
d.二次收毒：收集培养皿中的培养液至首次收毒的50mL无菌离心管中，于4℃，6000x g过夜离心16h。
f.吸弃离心后上清，加入300ulPBS重悬，形成BCMA_huFc和FCRH5_huFc病毒液。
(3)病毒感染表达BCMA_huFc和FCRH5_huFc。
a.用CHO GROW CD1将CHO-S细胞密度调整为1×106/ml，接种于6孔板。
b.将BCMA_huFc病毒液和FCRH5_huFc病毒液逐滴滴加到6孔板内，混匀，置于37℃、5％ CO2、130rpm震荡培养箱中培养。
c.24h后，收集六孔板内细胞培养液，200xg、25℃离心5min。
d.离心结束后，吸弃上清，加入2mL含有puromycine的CHO GROW CD1，重悬后转移至6孔板，置于37℃、5％ CO2、130rpm摇床上培养箱中培养进行筛选(注意设置一个空白CHO-S细胞对照组)。筛选期间维持细胞密度1×106/ml。
f.对照孔内的细胞基本死亡，筛选结束。将CHO-S-BCMA-His-ek-Fc2-Puro细胞株和CHO-S-FCRH5-His-ek-Fc2-Puro细胞株分别扩大培养，期间加入H410KJ CellTurbofeed1增强蛋白表达。连续培养表达4天，收集培养表达上清，用0.45μm针孔滤器过滤，形成过滤样品。
(4)采用protein A填料预装柱进行亲和纯化
a.平衡：PBS冲洗预装柱至UV曲线平衡。
b.上样：将进样管放入过滤样品内进行上样。
c.洗杂：上样结束后用PBS冲洗至曲线平衡；
d.洗脱：用甘氨酸缓冲液(PH3.0)进行洗脱，出峰收集蛋白液，立即用适量Tris-HCl(PH 9.0)溶液中和。
e.使用截流量为10KD的millipore超滤管进行蛋白洗脱液浓缩，使用超微量核酸蛋白检测仪OD280模块检测蛋白浓度。
f.取5ug跑SDS-PAGE，结果如图1，2所示。
2.使用噬菌体展示文库筛选针对BCMA特异的VHH抗体
(1)使用BCMA蛋白(切去huFc tag)免疫羊驼，皮下多点免疫，取外周血测定抗体效价，免疫血清与BCMA重组蛋白可以结合，且随着免疫血清的梯度稀释，OD值成梯度变化，符合建库要求，安排构建噬菌体展示库。
(2)采集免疫羊驼的外周血，提取RNA，制备cDNA样品后，PCR克隆VHH抗体编码基因，构建噬菌体展示库，(库容量8x108，空载率0％，随机挑取15个单克隆进行测序，使用Vector NTI进行序列分析，结果显示各单克隆序列差异大，库多样性较好。(图3)
(3)使用BCMA重组蛋白抗原进行固相淘选，进行2-4轮的噬菌体淘选实验，每轮结束后计算input和output值，在第3轮开始对获取的单克隆噬菌体进行Phage ELISA。
a.用CBS按1μg/mL浓度包被BCMA重组蛋白抗原，4℃过夜。
b.弃去抗原，用3％ MPBS室温封闭2h，此为Sample板；同时用MPBS封闭一块空白ELISA板，此为Negative control板。
c.弃去MPBS，用0.05％ PBST洗涤4次；用0.01％ PBST 1:1稀释单克隆噬菌体上清，每孔100μL，4℃孵育1h。
d.弃去一抗，用0.05％PBST洗涤5次；用0.05％的PBST按1:3000稀释anti-M13antibody-HRP，每孔100μL，4℃孵育1h。
f.弃去二抗，PBST洗涤5次；TMB 37℃显色15min，硫酸酸终止反应，读取OD450。g.计算S/N值，挑选比值较大的样品进行Sanger测序。
h.获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息，进行序列比对，挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体。在候选抗体序列的N端和C端分别通过Overlap PCR引入CMV启动子、信号肽及hu IgG1 Fc标签，将纯化PCR产物瞬时转染293F细胞，收集培养基上清。
I.复苏1×106个处于对数生长期的CHO-K1-BCMA重组细胞株，400xg，4℃离心5min。CHO-K1细胞株作为阴性对照组。弃上清后加入上述100uL培养基上清，4℃孵育30min后，加入1mL PBS洗涤细胞3次，然后用100uL PBS重悬细胞，加入5uL PE标记的Anti humanIgG抗体，室温避光孵育30分钟后，加入1mL PBS洗涤三次，最后用500uL PBS重悬细胞。通过流式细胞仪初步确定候选抗体与目的蛋白的结合情况。结果显示克隆33-A1、33-A11、33-F10、33-F2的培养液CHO-K1与BCMA抗体不结合，而与CHO-K1-BCMA特异性结合，确认是BCMA的特异性抗体。(图4)
33-A1的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:5)所示，基因序列如(SEQ ID NO:6)；33-A11的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:7)所示，基因序列如(SEQ ID NO:8)；33-F10的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:9)所示，基因序列如(SEQ ID NO:10)；33-F2的VHH氨基酸序列如(SEQID NO:11)所示，基因序列如(SEQ ID NO:12)。
3.抗BCMA-VHH_huFc融合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬转表达纯化、活性鉴定
a.将单域抗体编码区基因序列克隆至pFUSE-huIgG1-Fc2载体中，构建真核表达载体。瞬时转染对数生长期的293F细胞。转染5-7天后收集培养上清通过Protein A进行亲和纯化。
b.复苏CHO-K1-BCMA细胞，将纯化的候选单域抗体梯度稀释后与其进行孵育，CHO-K1作为阴性对照组。然后分别加入PE标记的Anti human IgG抗体进行孵育。用细胞流式术进行检测分析，并以MFI数值和抗体浓度绘制曲线。结果显示抗体33-A1、33-A11、33-F10、33-F2-VHH-huFc融合抗体和CHO-K1/CHO-K1-BCMA细胞结合的情况。这四个抗体均随着梯度稀释与靶细胞结合程度逐渐发生偏移，特异性的结合表达BCMA的CHO-K1-BCMA细胞，不结合阴性细胞CHO-K1。(图5)
4.CAR-T细胞的制备和抗肿瘤活性研究
选择33-A1、33-A11、33-F10、33-F2-VHH序列进行CAR-T细胞制备和抗肿瘤活性研究。
(1)靶向BCMA的嵌合抗原受体慢病毒表达载体构建
以pCDH-EF1a质粒为载体，构建表达BCMA抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒。包括pCDH-EF1a-33-A1-BBZ、pCDH-EF1a-33-A11-BBZ、pCDH-EF1a-33-F10-BBZ、pCDH-EF1a-33-F2-BBZ。
33-A1-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:13)、33-A1-VHH(SEQ ID NO:6)、CD8铰链区(SEQ ID NO:14)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:15)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQID NO:16)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:17)组成。
33-A11-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:13)、33-A11-VHH(SEQ ID NO:8)、CD8铰链区(SEQ ID NO:14)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:15)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQID NO:16)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:17)组成。
33-F10-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:13)、33-F10-VHH(SEQ ID NO:10)、CD8铰链区(SEQ ID NO:14)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:15)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:16)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:17)组成。
33-F2-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:13)、33-F2-VHH(SEQ ID NO:12)、CD8铰链区(SEQ ID NO:14)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:15)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQID NO:16)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:17)组成。
上述所有质粒经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到转染级别质粒，用于HEK293F悬浮细胞慢病毒包装实验。
(2)靶向BCMA的嵌合抗原受体慢病毒制备
重组表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等，本实施例所使用的原始重组表达载体为慢病毒载体。
a.用FreeStyle 293培养基将HEK293F细胞密度调整为4.5×106cells/mL，体积为包装体积的90％。暂置37.0℃大容量50振幅CO2叠加式恒温振荡器培养备用。
b.配制质粒/PEI复合物：准备2个无菌离心管，分别加入5％包装体积的FreeStyle293培养基。向第一支离心管中依次加入一定比例的pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pCDH-EF1a-CAR质粒，质粒总量180μg/100mL包装体积，轻轻混匀，室温孵育5min。向另一支离心管中加入PEI溶液，PEI用量(μg)＝质粒总量(μg)*3，轻轻混匀，室温孵育5min。
c.将上述孵育后的PEI稀释液加入到质粒稀释液中，并迅速充分混匀，垂直层流洁净工作台内室温孵育约12min。
d.转染：取出上述准备好的HEK293F细胞，边轻摇边加入制备好的质粒/PEI复合物，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。
e.转染后约16-18h。加入OPM-CHO PFF06，体积为转染体系的10％，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。
f.转染后约48h。3000×g、22.0℃离心15min，收集上清液病毒，用0.65μm针头滤器过滤。
g.核酸酶消化。按100U/mL向上述病毒液添加Super Nuclease溶液，上下颠倒5～8次混匀，4℃过夜处理约16h。
h.6000×g、4℃过夜离心约16h，弃上清。用1％包装体积DPBS(含10％人血白蛋白)重悬。取50ul病毒液检测感染滴度，剩余全部分装后置于-80℃储存。
i.将不同稀释梯度的病毒液感染293T细胞，48h后，用流式细胞术检测被感染的阳性细胞率，并换算为病毒液的感染滴度，以便后续转导T细胞。
(3)CART细胞的制备
一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。本实施例用到的宿主细胞为人外周血T细胞或含有T细胞的细胞群。
a.外周血T细胞分离
将5mL抗凝血样品转移至一个15mL无菌离心管，离心力800×g、离心降速设为最低，将血样室温离心20min。吸弃血清层，向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水，混匀。
向一个新的15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液，然后将生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层，离心力800×g，转速下降速度设为最低，室温离心30min。吸取白色单核细胞层吸至一个新的15mL无菌离心管中，加入等体积的生理盐水，混匀。离心力800×g，离心5min。吸弃上清，加入5mL生理盐水，混匀，取部分细胞悬液进行计数，流式细胞检测CD3+T细胞比例。
根据Dynabeads与CD3+T细胞数目比例为1:1，分离T细胞，取部分细胞悬液计数。
b.T细胞激活
加入T细胞生长培养基(含X-Vivo 15培养基、300IU/mL白介素2、10ng/mL白介素7、5ng/mL白介素15、5ng/mL白介素21)，调整T细胞密度1E6/mL。将细胞置于37℃、5％ CO2培养箱中培养40h。
c.T细胞培转导
从-80℃冰箱中，取出慢病毒，冰上解冻。
从培养箱中取出激活的T细胞，向培养器皿中加入polybrene至终浓度为6μg/mL，加入病毒液(MOI约50)，充分混匀，使用封口膜将培养器皿密封，800×g室温离心1h。
离心后，将培养器皿于37℃、5％ CO2的培养箱中，继续培养24h。
400×g离心10min，弃掉含有病毒的培养基上清，用新鲜T细胞生长培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的培养器皿中，继续培养。维持细胞密度在1-2x106/mL。
d.培养4天后，取部分细胞用流式细胞仪检测T细胞表面CAR分子的表达。离心收集制备的CAR-T细胞和NC-T细胞(对照组)，PBS洗涤一次后弃上清，加入BCMA-huFc蛋白孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，加入PE anti-human IgGFc抗体避光孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，重悬，最后流式细胞仪检测流式细胞仪检测CAR阳性的T细胞比例。CAR分子的表达效率约40％。
(4)靶向BCMA CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性
通过细胞毒实验判断BCMACART细胞的抗肿瘤活性。在比较UTD、33-A1-BBZ、33-A11-BBZ、33-F10-BBZ、33-F2-BBZ CAR-T细胞的体外杀伤活性时，四种CAR T细胞的感染阳性率分别为36.274％、30.025％、41.376％、35.778％。(图6)
a.内源性表达BCMA的U266-Luc细胞作为靶细胞，用RPMI1640完全培养基调整密度为5*105个/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至合适密度，实验组按照效应细胞：靶细胞＝0.125:1，0.25:1，0.5:1，1:1的比例分别加入靶细胞孔内，100μL/孔。同时设置对照组为不加效应细胞组，即靶细胞萤光释放最大孔。每个比例设2个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.根据板布局，每孔转移100uL细胞悬液至全白酶标板，每孔加入100uL D-luciferin，混匀，全程避光操作，且动作要迅速，静置5min。用多功能酶标仪生物发光信号检测***进行检测。细胞毒性计算公式为：％细胞毒性＝[(对照组-实验组)/对照组]*100。结果显示四种CAR-T均有非常显著的抗肿瘤活性，其中33-A1/33-A11抗肿瘤活性最佳，如图7所示。
5.单域抗体人源化设计
(1)采用氨基偶联的方案将BCMA抗原偶联至BiaCore T200芯片上，分别使用33-A1-VHH、33-A11-VHH抗体作为流动相对单域抗体进行亲和力测定，其中，33-A1-VHH的KD＝7.67*10-9M，Kon＝3.131x105 M-1S-1，Koff＝2.402x10-3 S-1，信号呈浓度依赖性；33-A11-VHH抗体KD＝3.439*10-9M，Kon＝4.979x105 M-1S-1，Koff＝1.712x10-3 S-1，信号呈浓度依赖性，可见二者亲和力均达到nM级别。
(2)采用CDR&SDR Grafting及Back mutation对33-A1-VHH和33-A11-VHH进行人源化，每条原始序列分别设计5条人源化序列，以pCDH-EF1a质粒为载体，构建表达人源化BCMA抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒。包括pCDH-EF1a-33-A1-HM1-BBZ、pCDH-EF1a-33-A1-HM2-BBZ、pCDH-EF1a-33-A1-HM3-BBZ、pCDH-EF1a-33-A1-HM4-BBZ、pCDH-EF1a-33-A1-HM5-BBZ，pCDH-EF1a-33-A11-HM1-BBZ、pCDH-EF1a-33-A11-HM2-BBZ、pCDH-EF1a-33-A11-HM3-BBZ、pCDH-EF1a-33-A11-HM4-BBZ、pCDH-EF1a-33-A11-HM5-BBZ。
6.CAR-T细胞的制备和抗肿瘤活性研究
按照第4.部分进行CAR-T细胞制备和抗肿瘤活性研究。其CAR+％依次为70.43％、72.08％、63.11％、62.62％、65.58％、64.96％、64.46％、65.51％、64.74％、64.67％。通过细胞毒实验判断人源化后BCMACART细胞的抗肿瘤活性。结果显示十种CAR-T均有非常显著的抗肿瘤活性，其中33-A11-HM3抗肿瘤活性最佳，其在E:T为1:1时，在U266-Luc抗肿瘤效果已达到88.44％，在MM1.S-Luc抗肿瘤效果已达到91.43％；在E:T为4:1时，在U266-Luc抗肿瘤效果已达到98.05％，在MM1.S-Luc抗肿瘤效果已达到92.75％(其余对比例分别选自CN112251412A、CN 109651511A、CN 112689516A)。CART-33-A1-HM3和CART-33-A11-HM4抗肿瘤效果稍弱。
三条抗体序列命名为BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3，其人源化氨基酸序列如(SEQ IDNO:18)所示、核酸序列(SEQ ID NO:19)所示，人源化氨基酸序列如(SEQ ID NO:20)所示、核酸序列(SEQ ID NO:21)所示，人源化氨基酸序列如(SEQ ID NO:22)所示、核酸序列(SEQ IDNO:23)所示。
将BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3及上市CART产品的抗体序列bb2121重新制备病毒并层析纯化，然后制备CART细胞：bb2121、CART-1、CART-2、CART-3，并进行体外抗肿瘤活性评价。bb2121、CART-1、CART-2、CART-3对表达BCMA的肿瘤细胞MM1.S、RPMI8226、H929均具有很强的抗肿瘤活性，在E:T为0.5:1时，杀伤效率还能达到50％-98％左右。而对不表达BCMA的肿瘤细胞Raji，不具备杀伤活性，bb2121在E:T为8:1时却表现低水平的杀伤效果，说明CART-1、CART-2、CART-3的对抗肿瘤靶向性强，脱靶毒性低(图10)。其中CART-2比bb2121、CART-1、CART-3更优，后续将深入进行临床前研究。
CART与靶细胞共培养后IFN-γ分泌检测
a.U266-Luc、MM1.S-Luc细胞作为靶细胞(含BCMA靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基调整密度为5*105/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，设3个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。
包被capture antibody：使用PBS稀释capture antibody至2μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA-PBS室温封闭1h，300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。
f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【9.38pg/mL-600pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。
g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detectionantibody至125ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin-HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。
k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.
分析数据，CAR-T组比UTD组明显增高，说明CAR-T在表达BCMA的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IFN-γ。
CART与靶细胞共培养后IL-2释放情况
a.U251-Luc、U87-Luc细胞作为靶细胞(含BCMA靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基调整密度为5×105/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5×104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，每个比例设3个复孔。
c.放置37℃、5％ CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。
包被capture antibody：PBS稀释capture antibody至4μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA-PBS室温封闭1h，300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。
f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【15.6pg/mL-1000pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。
g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detectionantibody至100ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin-HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。
g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。
k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.
分析数据，CAR-T组比UTD组明显增高，说明CAR-T在表达BCMA的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IL-2。
7.使用噬菌体展示文库筛选针对FCRH5特异的VHH抗体
(1)使用FCRH5蛋白(切去huFc tag)免疫羊驼，皮下多点免疫，取外周血测定抗体效价，免疫血清与FCRH5重组蛋白可以结合，且随着免疫血清的梯度稀释，OD值成梯度变化，符合建库要求，安排构建噬菌体展示库。
(2)采集免疫羊驼的外周血，提取RNA，制备cDNA样品后，PCR克隆VHH抗体编码基因，构建噬菌体展示库，随机挑取15个单克隆进行测序，使用Vector NTI进行序列分析，结果显示各单克隆序列差异大，库多样性较好。
(3)使用FCRH5重组蛋白抗原进行固相淘选，进行2-4轮的噬菌体淘选实验，每轮结束后计算input和output值，在第3轮开始对获取的单克隆噬菌体进行Phage ELISA。
a.用CBS按1μg/mL浓度包被BCMA重组蛋白抗原，4℃过夜。
b.弃去抗原，用3％ MPBS室温封闭2h，此为Sample板；同时用MPBS封闭一块空白ELISA板，此为Negative control板。
c.弃去MPBS，用0.05％ PBST洗涤4次；用0.01％ PBST 1:1稀释单克隆噬菌体上清，每孔100μL，4℃孵育1h。
d.弃去一抗，用0.05％PBST洗涤5次；用0.05％的PBST按1:3000稀释anti-M13antibody-HRP，每孔100μL，4℃孵育1h。
f.弃去二抗，PBST洗涤5次；TMB 37℃显色15min，硫酸酸终止反应，读取OD450。g.计算S/N值，挑选比值较大的样品进行Sanger测序。
h.获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息，进行序列比对，挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体。在候选抗体序列的N端和C端分别通过Overlap PCR引入CMV启动子、信号肽及hu IgG1 Fc标签，将纯化PCR产物瞬时转染293F细胞，收集培养基上清。
I.复苏1×106个处于对数生长期的CHO-K1-FCRH5重组细胞株，400xg，4℃离心5min。CHO-K1细胞株作为阴性对照组。弃上清后加入上述100uL培养基上清，4℃孵育30min后，加入1mL PBS洗涤细胞3次，然后用100uL PBS重悬细胞，加入5uL PE标记的Anti humanIgG抗体，室温避光孵育30分钟后，加入1mL PBS洗涤三次，最后用500uL PBS重悬细胞。通过流式细胞仪初步确定候选抗体与目的蛋白的结合情况。结果显示克隆只有克隆5F7培养液CHO-K1与BCMA抗体不结合，而与CHO-K1-FCRH5特异性结合，确认是FCRH5的特异性抗体。(图11)
8.抗FCRH5-VHH_huFc融合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬转表达纯化、活性鉴定。
a.将单域抗体编码区基因序列克隆至pFUSE-huIgG1-Fc2载体中，构建真核表达载体。瞬时转染对数生长期的293F细胞。转染5-7天后收集培养上清通过Protein A进行亲和纯化。
b.复苏CHO-K1-FCRH5细胞，将纯化的候选单域抗体梯度稀释后与其进行孵育，CHO-K1作为阴性对照组。然后分别加入PE标记的Anti human IgG抗体进行孵育。用细胞流式术进行检测分析，结果显示抗体5F7随着梯度稀释与靶细胞结合程度逐渐发生偏移，特异性的结合表达FCRH5的CHO-K1-BCMA细胞，不结合阴性细胞CHO-K1。
9.单域抗体人源化设计
(1)采用氨基偶联的方案将FCRH5抗原偶联至BiaCore T200芯片上，使用5F7抗体作为流动相对单域抗体进行亲和力测定，其亲和力均达到nM级别，具体的，KD＝9.416*10- 9M，Kon＝3.2x105M-1S-1，Koff＝3.013x10-3S-1，信号呈浓度依赖性，数据可信。(图12)
(2)采用CDR&SDR Grafting及Back mutation对5F7进行人源化，设计7条人源化序列，以pCDH-EF1a质粒为载体，构建表达人源化FCRH5抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒。包括pCDH-EF1a-5F7-HM1-BBZ、pCDH-EF1a-5F7-HM2-BBZ、pCDH-EF1a-5F7-HM3-BBZ、pCDH-EF1a-5F7-HM4-BBZ、pCDH-EF1a-5F7-HM5-BBZ，pCDH-EF1a-5F7-HM6-BBZ、pCDH-EF1a-5F7-HM7-BBZ。
10.CAR-T细胞制备和抗肿瘤活性研究
(1)按照第4.部分进行CART细胞制备。其CAR+％依次为81.130％、67.878％、78.962％、82.862％、68.276％、83.676％、83.215％。通过细胞毒实验判断人源化后FCRH5CART细胞的抗肿瘤活性。结果显示七种CAR-T均有非常显著的抗肿瘤活性，其中5F7-HM6抗肿瘤效果稍弱，5F7-HM5和5F7-HM7抗肿瘤活性最佳，其在E:T为1:1时，在MM1.S-Luc抗肿瘤效果已达到80.71％；在E:T为4:1时，在MM1.S-Luc抗肿瘤效果已达到94.81％。(图13)后续将进一步进行临床前研究。
(2)5F7-HM5氨基酸序列如(SEQ ID NO:26)所示、核酸序列(SEQ ID NO:27)所示，将5F7-HM5命名为FCRH5-01。5F7-HM7氨基酸序列如(SEQ ID NO:28)所示、核酸序列(SEQ IDNO:29)所示，将5F7-HM7命名为FCRH5-02。
11.BCMA/FCRH5 CAR-T细胞制备和抗肿瘤活性研究
设计12条BCMA/FCRH5。以pCDH-EF1a质粒为载体，将BCMA-2和FCRH5-HM5、FCRH5-HM7进行双靶点组合，构建表达人源化BCMA/FCRH5抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒，见下表。
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按照第4部分将上述12种慢病毒载体制备CART细胞。CAR01、CAR02、CAR03、CAR04、CAR05、CAR06、CAR07、CAR08、CAR09、CAR10、CAR11、CAR12的CAR+％依次为18.796％、75.01％、13.113％、22.728％、27.485％、19.104％、35.582％、23.505％、30.082、20.447％、15.687％、21.906％。通过细胞毒实验判断BCMA/FCRH5 CART细胞的抗肿瘤活性。结果显示十二种BCMA/FCRH5CAR-T均有非常显著的抗肿瘤活性。其中CAR02、CAR06和CAR10对MM1.S-Luc-FCRH5/H929-Luc-FCRH5/RPMI8226-Luc-FCRH5等多种靶细胞的抗肿瘤效果均较强，在效靶比1:1时均能达到90％左右的高抗肿瘤活性，而已上市产品bb2121在效靶比1:1时均能达到40％左右的抗肿瘤活性，BCMA/FCRH5 CART细胞呈现出较大的抗肿瘤活性优势。后续将深入进行临床前研究。(图14)
实施例中涉及的氨基酸及核苷酸序列：
(1)BCMA蛋白序列
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
(2)BCMA_huFc蛋白序列
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNADDDDKMDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
(3)FCRH5蛋白序列
QFARTPRPIIFLQPPWTTVFQGERVTLTCKGFRFYSPQKTKWYHRYLGKEILRETPDNILEVQESGEYRCQAQGSPLSSPVHLDFSSASLILQAPLSVFEGDSVVLRCRAKAEVTLNNTIYKNDNVLAFLNKRTDFHIPHACLKDNGAYRCTGYKESCCPVSSNTVKIQVQEPFTRPVLRASSFQPISGNPVTLTCETQLSLERSDVPLRFRFFRDDQTLGLGWSLSPNFQITAMWSKDSGFYWCKAATMPYSVISDSPRSWIQVQIPASHPVLTLSPEKALNFEGTKVTLHCETQEDSLRTLYRFYHEGVPLRHKSVRCERGASISFSLTTENSGNYYCTADNGLGAKPSKAVSLSVTVPVSHPVLNLSSPEDLIFEGAKVTLHCEAQRGSLPILYQFHHEGAALERRSANSAGGVAISFSLTAEHSGNYYCTADNGFGPQRSKAVSLSVTVPVSHPVLTLSSAEALTFEGATVTLHCEVQRGSPQILYQFYHEDMPLWSSSTPSVGRVSFSFSLTEGHSGNYYCTADNGFGPQRSEVVSLFVTVPVSRPILTLRVPRAQAVVGDLLELHCEAPRGSPPILYWFYHEDVTLGSSSAPSGGEASFNLSLTAEHSGNYSCEANNGLVAQHSDTISLSVIVPVSRPILTFRAPRAQAVVGDLLELHCEALRGSSPILYWFYHEDVTLGKISAPSGGGASFNLSLTTEHSGIYSCEADNGLEAQRSEMVTLKVAVPVSRPVLTLRAPGTHAAVGDLLELHCEALRGSPLILYRFFHEDVTLGNRSSPSGGASLNLSLTAEHSGNYSCEADNGLGAQRSETVTLYITGLTANRSGPFATG
(4)FCRH5 huFc蛋白序列
QFARTPRPIIFLQPPWTTVFQGERVTLTCKGFRFYSPQKTKWYHRYLGKEILRETPDNILEVQESGEYRCQAQGSPLSSPVHLDFSSASLILQAPLSVFEGDSVVLRCRAKAEVTLNNTIYKNDNVLAFLNKRTDFHIPHACLKDNGAYRCTGYKESCCPVSSNTVKIQVQEPFTRPVLRASSFQPISGNPVTLTCETQLSLERSDVPLRFRFFRDDQTLGLGWSLSPNFQITAMWSKDSGFYWCKAATMPYSVISDSPRSWIQVQIPASHPVLTLSPEKALNFEGTKVTLHCETQEDSLRTLYRFYHEGVPLRHKSVRCERGASISFSLTTENSGNYYCTADNGLGAKPSKAVSLSVTVPVSHPVLNLSSPEDLIFEGAKVTLHCEAQRGSLPILYQFHHEGAALERRSANSAGGVAISFSLTAEHSGNYYCTADNGFGPQRSKAVSLSVTVPVSHPVLTLSSAEALTFEGATVTLHCEVQRGSPQILYQFYHEDMPLWSSSTPSVGRVSFSFSLTEGHSGNYYCTADNGFGPQRSEVVSLFVTVPVSRPILTLRVPRAQAVVGDLLELHCEAPRGSPPILYWFYHEDVTLGSSSAPSGGEASFNLSLTAEHSGNYSCEANNGLVAQHSDTISLSVIVPVSRPILTFRAPRAQAVVGDLLELHCEALRGSSPILYWFYHEDVTLGKISAPSGGGASFNLSLTTEHSGIYSCEADNGLEAQRSEMVTLKVAVPVSRPVLTLRAPGTHAAVGDLLELHCEALRGSPLILYRFFHEDVTLGNRSSPSGGASLNLSLTAEHSGNYSCEADNGLGAQRSETVTLYITGLTANRSGPFATGDDDDKMDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
(5)anti-huBCMA单克隆抗体33-A1-VHH氨基酸序列
AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYPMGWFRQGPGKERKFVAAISRNGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYFCAARSGWFGEKAGTDFGSWGQGTQVTVSS
(6)anti-huBCMA单克隆抗体33-A1-VHH核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGATTCTGGCGGAGGACTGGTTCAGGCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCAGCTATCCTATGGGCTGGTTCAGACAAGGCCCTGGCAAAGAACGGAAGTTCGTGGCCGCCATCAGCAGAAATGGCAGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCATGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGATACCGCCGTGTACTTTTGCGCCGCTAGAAGCGGATGGTTCGGCGAGAAAGCCGGCACCGATTTTGGCTCTTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTAGCTCT
(7)anti-huBCMA单克隆抗体33-A11-VHH氨基酸序列
AVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYPMGWFRQGPGKERKFVAAISRNGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYFCAARSGWFGEEAGTDFGSWGQGTQVTVSS
(8)anti-huBCMA单克隆抗体33-A11-VHH核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGGCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCAGCTATCCTATGGGCTGGTTCAGACAAGGCCCTGGCAAAGAACGGAAGTTCGTGGCCGCCATCAGCAGAAATGGCAGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCATGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGATACCGCCGTGTACTTTTGCGCCGCTAGAAGCGGATGGTTCGGCGAGGAAGCCGGCACAGATTTTGGCTCTTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTAGCTCT
(9)anti-huBCMA单克隆抗体33-F10-VHH氨基酸序列
AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSGYAMGWFRQAPGKGREFVAAISWSGGSTHYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARSGWFGEEVGADFGSWGQGTQVIVSS
(10)anti-huBCMA单克隆抗体33-F10-VHH核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGATTCTGGCGGAGGACTGGTTCAGGCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTTAGCGGCTATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGAAAGGGCAGAGAATTTGTGGCCGCCATCTCTTGGAGCGGCGGCTCTACACACTACGCCGATTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGCTAGATCTGGATGGTTCGGCGAGGAAGTGGGCGCCGATTTTGGATCTTGGGGCCAGGGCACACAAGTGATCGTGTCTAGT
(11)anti-huBCMA单克隆抗体33-F2-VHH氨基酸序列
AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARSGWFGDEVGADFGSWGQGTQVTVSS
(12)anti-huBCMA单克隆抗体33-F2-VHH核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGATTCTGGCGGAGGACTGGTTCAGGCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCAGATATGCCATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGAGAGAGAGTTCGTCGCCGCCATCTCTTGGAGCGGCGGCAGCACATATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGCTAGATCTGGATGGTTCGGGGATGAAGTGGGCGCCGATTTTGGCTCTTGGGGCCAGGGAACACAAGTGACCGTTAGCTCT
(13)CD8α信号肽
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
(14)CD8铰链区
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
(15)CD8跨膜区
ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
(16)4-1BB
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
(17)CD3ξ
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
(18)BCMA-1氨基酸序列
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYPMGWFRQAPGKGRKFVAAISRNGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYFCAARSGWFGEKAGTDFGSWGQGTTVTVSS
(19)BCMA-1核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCAGCTATCCTATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAAAATTCGTGGCCGCCATCAGCAGAAACGGCAGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCATGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCGCTAGAAGCGGATGGTTCGGCGAGAAGGCCGGCACAGATTTTGGCTCTTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACAGTTAGCTCT
(20)BCMA-2氨基酸序列
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYPMGWFRQAPGKGRKFVAAISRNGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYFCAARSGWFGEEAGTDFGSWGQGTTVTVSS
(21)BCMA-2核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCAGAACCTTCAGCAGCTATCCTATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAAAATTCGTGGCCGCCATCAGCAGAAACGGCAGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCATGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCGCTAGAAGCGGATGGTTCGGCGAGGAAGCCGGCACAGATTTTGGCTCTTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACAGTTAGCTCT
(22)BCMA-3氨基酸序列
AVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYPMGWFRQAPGKGRKFVAAISRNGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYFCAARSGWFGEEAGTDFGSWGQGTTVTVSS
(23)BCMA-3核酸序列
GCTGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCAGAACCTTCAGCAGCTATCCTATGGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAAAATTCGTGGCCGCCATCAGCAGAAACGGCAGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCATGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCGCTAGAAGCGGATGGTTCGGCGAGGAAGCCGGCACAGATTTTGGCTCTTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACAGTTAGCTCT
(24)anti-huFCRH5单克隆抗体5F4氨基酸序列
MAAVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCLASGFYFSVYDMKWARQAPGKGPEWVAAINTDGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNNLKPEDTALYYCARVGAGRSFPEGQGTQVTVSS
(25)anti-huFCRH5单克隆抗体5F4核酸序列
ATGGCTGCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTTGCTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTCTGGCCAGCGGCTTCTACTTCAGCGTGTACGACATGAAGTGGGCTAGACAGGCCCCTGGCAAGGGACCTGAATGGGTTGCCGCCATCAATACCGATGGCGGCTCTACCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAGCACCCTGTACCTGCAGATGAACAACCTGAAGCCTGAGGACACAGCCCTGTACTACTGCGCCAGAGTTGGAGCCGGCAGAAGCTTTCCTGAAGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTGTCATCT
(26)FCRH5-5F7-HM5氨基酸序列
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCLASGFYFSVYDMKWARQAPGKGLVWVAAINTDGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGAGRSFPEGQGTMVTVSS
(27)FCRH5-5F7-HM5核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTCTGGCCAGCGGCTTCTACTTCAGCGTGTACGACATGAAGTGGGCTAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGTTTGGGTCGCCGCCATCAATACCGATGGCGGCAGCACCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAGCACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGAGTTGGCGCCGGAAGAAGCTTCCCTGAAGGCCAGGGAACCATGGTCACCGTGTCATCT
(28)FCRH5-5F7-HM7氨基酸序列
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSVYDMKWVRQAPGKGLEWVAAINTDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLKPEDTAVYYCARVGAGRSFPEGQGTMVTVSS
(29)FCRH5-5F7-HM7核酸序列
GCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCTACTTCAGCGTGTACGACATGAAATGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTTGCCGCCATCAATACCGATGGCGGCTCTACCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAGCACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGTTGGAGCCGGCAGAAGCTTCCCTGAAGGCCAGGGAACAATGGTCACCGTGTCTAGC

Claims (11)

1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，其至少包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述抗原结合结构域含有抗BCMA单域抗体；
其中，所述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。
2.一种靶向BCMA和FCRH5的嵌合抗原受体，其特征在于，其至少包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述抗原结合结构域含有抗BCMA单域抗体和抗FCRH5单域抗体；
其中，所述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；
所述抗FCRH5单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
3.如权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体或权利要求2所述的靶向BCMA和FCRH5的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域和CD28跨膜结构域；
所述CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
4.如权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体或权利要求2所述的靶向BCMA和FCRH5的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；
所述共刺激信号传导域包括人4-1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或多种的组合，所述人4-1BB胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述CD3ζ信号传导域其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
5.如权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体或权利要求2所述的靶向BCMA和FCRH5的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域和跨膜结构域通过铰链区进行连接，所述铰链区包含IgG1铰链区和/或CD8铰链区；所述铰链区为CD8铰链区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
6.如权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体或权利要求2所述的靶向BCMA和FCRH5的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括CD8α信号肽；所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
7.编码权利要求1所述的靶向BCMA的嵌合抗原受体或权利要求2所述的靶向BCMA和FCRH5的嵌合抗原受体的多核苷酸。
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求7所述的核苷酸。
9.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞是由权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
10.权利要求1-5任一项所述嵌合抗原受体、权利要求7所述多核苷酸、权利要求8所述重组表达载体在如下任意一种或多种中的应用：
（b1）制备嵌合抗原受体T细胞；
（b2）制备肿瘤治疗药物；
其中，所述肿瘤为与B细胞成熟抗原蛋白的表达相关的肿瘤疾病，所述肿瘤疾病选自多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病和胶质母细胞瘤。
11.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，所述肿瘤治疗药物其活性成分至少包含权利要求9所述T细胞。
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