CN117379428A - 选择性***受体降解剂 - Google Patents

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Abstract

本文提供了根据下式的新的选择性***受体降解剂(SERD)及其药学上可接受的盐及其药物组合物，其中R1或R2中一个独立地选自Cl、F、‑CF3或‑CH3，且另一个为氢，以及其使用方法。

Description

选择性***受体降解剂
本申请为分案申请，原申请的申请号为201980046849.3，申请日为2019年7月11日，优先权日为2018年7月12日，发明名称为“选择性***受体降解剂”。
背景
选择性***受体降解剂(SERD)结合***受体(ER)并下调ER介导的转录活性。这种由SERD引起的降解和下调可用于治疗细胞增殖疾病，例如癌症。文献中已经公开了SERD的一些小分子实例(参见例如WO2005073204、WO2014205136,和WO2016097071)。然而，已知的SERD还未如有效治疗癌症所需的那样有用。例如，发现具有更好的药物动力学(PK)和药效学(PD)性质、在临床中更高的效率和良好的口服生物利用度的SERD将非常有助于治疗癌症。具有有效抑制ER介导的转录的纯拮抗剂SERD在治疗癌症中将是特别有益的。需要新的SERD来治疗癌症如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌和肺癌以及由于出现抗性而引起的突变。特别是，需要新的SERD来治疗ER阳性乳腺癌、胃癌和/或肺癌。
发明概述
本文提供了下式的化合物:
及其药学上可接受的盐，以及其药物组合物。在该式中，R1或R2中一个独立地选自Cl、F、-CF3或-CH3，且另一个是氢。
还提供了使用如本文所述的化合物、其药学上可接受的盐及其药物组合物治疗乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌或肺癌的方法。所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。
还提供了用于治疗法的如本文所述的化合物及其药学上可接受的盐。本文所述的化合物及其药学上可接受的盐可用于治疗乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌或肺癌。
还提供了如本文所述的化合物及其药学上可接受的盐在制备用于治疗乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌或肺癌的药物中的用途。
发明详述
本文公开了用作SERD的新四环化合物及其药用盐。本文描述的新发明的SERD提供了ER介导的转录的抑制，其将可用于治疗癌症，诸如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌和肺癌以及由于出现抗性而引起的突变。这些SERD可以作为单一活性剂使用或与其他种类的药物组合使用，所述其他种类的药物包括选择性***受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、CDK4抑制剂、CDK6抑制剂、PI3K抑制剂、和mTOR抑制剂，以治疗激素受体阳性癌症，例如乳腺癌、胃癌、和/或肺癌。
本文所述的新化合物由式I表示:
及其药学上可接受的盐,其中R1或R2中一个独立地选自Cl、F、-CF3或-CH3，且另一个为氢。本领域技术人员将理解，式I所述的化合物或其药学上可接受的盐含有手性中心，其位置由上述*指示。本领域技术人员还将理解，对于手性中心的Cahn-Ingold-Prelog(R)或(S)命名将根据手性中心周围的取代模式而变化。式I化合物中的手性中心提供了式II所示的R-对映体形式
和式III所示的S-对映体形式:
根据式I、式II和式III的化合物的所有单独的立体异构体、对映异构体和非对映异构体，以及对映异构体和非对映异构体的混合物(包括外消旋物)，包括在本文所述的化合物的范围内。含有手性中心的药用化合物通常以单一对映体或非对映异构体的形式分离，并且这样分离的式I、式II和式III的化合物包括在本文公开的化合物的范围内。本领域技术人员还将理解，本文所述的式I、式II和式III的化合物及其药学上可接受的盐可被氘化(其中氢可被氘替代)，并且此类分子被认为包括在本文公开的化合物的范围内。
式I化合物的具体实例(包括IUPAC命名法名称)在此示出:
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-甲基-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；和
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇。
由于上述手性中心，上述式I化合物的这些具体实例各自具有表1所示的R-和S-对映体形式(即式II的R-对映异构化合物和式III的S-对映异构化合物)。
表1:式I化合物的对映异构形式
本文还描述了药物组合物，其包含如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。本文所述的药物组合物可以使用药学上可接受的添加剂来制备。如本文所用，术语"药学上可接受的添加剂"是指与组合物或制剂的其它添加剂相容并且对患者无害的一种或多种载体、稀释剂和赋形剂。本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐可以配制为通过多种途径(如口服或IV)施用的药物组合物。生物利用度通常是癌症治疗的因素，并且选择施用方法和药物组合物以控制或优化活性成分的生物利用度的能力是有用的。例如，口服生物可利用的SERD组合物将是特别有用的。如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐被认为具有口服生物利用度。药物组合物和用于其制备的方法的实例可以在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,L.V.Allen Jr编撰，第22版，MackPublishing Co.,2012中找到。药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的非限制性实例包括以下：盐水、水、淀粉、糖、甘露醇和二氧化硅衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；高岭土和皂土；以及聚乙基乙二醇。
本文还描述了治疗癌症的方法。本文所述的方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐。例如，施用有效量的如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐的方法可以是口服施用。癌症可以是***响应性癌症。另外，癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌或肺癌。例如，癌症可以是ER阳性乳腺癌、ER-阳性胃癌或ER-阳性肺癌。
本文还描述了用于治疗法的如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐。本文还提供了如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌或肺癌。特别是，乳腺癌可以是ER阳性乳腺癌、ER-阳性胃癌或ER-阳性肺癌。例如，式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐可以口服施用。
另外，本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐可用于制备治疗癌症的药物。例如，所述药物可经口施用。本文所述的药物可用于治疗的癌症类型包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌或肺癌。特别是，所述癌症可以是ER阳性乳腺癌、ER-阳性胃癌或ER-阳性肺癌。
如本文所述的式I、式II和式III的化合物及其药学上可接受的盐可以作为单一活性剂或与一种或多种其它治疗剂(例如抗癌剂)组合具有临床效用，用于治疗癌症诸如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌或肺癌。当与其它治疗剂(如抗癌剂)组合使用时，如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐可以与其它治疗剂同时、依序或分开使用。如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐可以组合的药物类别的实例包括SERM、芳香酶抑制剂、CDK4抑制剂、CDK6抑制剂、PI3K抑制剂和mTOR抑制剂，以治疗激素受体阳性乳腺癌。如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐可以组合的药物的更具体实例包括阿贝西利(abemaciclib)(CDK4/6抑制剂)、依维莫司(mTOR抑制剂)、阿培利司(alpelisib)(PIK3CA抑制剂)和8-[5-(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶-3-基]-1-[(2S)-2-甲氧基丙基]-3-甲基-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(PI3K/mTOR抑制剂)。
如本文所用，术语"有效量"是指如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐的量或剂量，其在向患者单剂量或多剂量施用后在所诊断或治疗的患者中提供所需效果。优选地，所需效果是抑制肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞死亡或两者。如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐通常在宽剂量范围内有效。例如，每天的剂量通常在约100mg至约2000mg的日范围内。
如本文所用，"治疗"或"处置"是指抑制、减缓、停止或逆转已有症状或障碍的进展或严重程度。
如本文所用，术语"患者"是指患有特定疾病、障碍或病症的人。
如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐可通过本领域已知的各种方法来制备，其中的一些方法在下面的制备和实施例中示出。用于每种所述途径的具体合成步骤可以不同方式组合，或结合来自不同方法的步骤，以制备如本文所述的式I、式II和式III的化合物或其药学上可接受的盐。产物可通过本领域熟知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱法、过滤、研磨和结晶。试剂和起始材料是本领域普通技术人员容易获得的。
用于合成如本文所述的式I、式II和式III的化合物的中间体和方法旨在包括在本说明书中。另外，本文所述的某些中间体可包含一个或多个保护基。取决于具体的反应条件和要进行的具体转化，可变保护基在每次出现时可以相同或不同。保护和脱保护条件是本领域技术人员熟知的并且描述于文献中(参见例如“Greene’s Protective Groups inOrganic Synthesis”,第四版,Peter G.M.Wuts and Theodora W.Greene,John Wiley和Sons,Inc.2007)。
通过诸如选择性结晶技术或手性色谱法的方法，本领域普通技术人员可以在如本文所述的式I、式II和式III的化合物的合成中的任何方便的点分离或拆分各个异构体、对映异构体和非对映异构体(参见例如，J.Jacques等人,“Enantiomers,Racemates,andResolutions”,John Wiley and Sons,Inc.,1981，和E.L.Eliel和S.H.Wilen,“Stereochemistry of Organic Compounds”,Wiley-Interscience,1994)。虽然各个异构体、对映异构体和非对映异构体可以如所述的那样分离或拆分，但是它们手性中心的Cahn-Ingold-Prelog(R)或(S)命名可能还未确定。在Cahn-Ingold-Prelog(R)或(S)命名不可得的情况下，使用标识符“异构体1”和“异构体2”，并且将其与不具有Cahn-Ingold-Prelog立体化学命名的IUPAC名称组合。如在下面的具体实验描述中所定义的那样被分离。异构体是“1”还是“2”是指在所列条件下式I、式II和式III的化合物从手性色谱柱洗脱的顺序，即“异构体1”在所述条件下首先从柱洗脱。如果手性色谱法在合成的早期开始，则将相同的命名应用于后续中间体和式I、式II和式III的化合物。
除非特别指出，本文所用的缩写根据Aldrichimica Acta,第17卷,第一期,1984定义。其它缩写定义如下:“ACN”是指乙腈；“BSA”是指牛血清白蛋白；“A Pd G3”是指[(二(1-金刚烷基)-丁基膦)-2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)甲磺酸盐；“DCM”是指二氯甲烷或亚甲基二氯；“DMA”是指二甲基乙酰胺；“DMEA”是指二甲基乙胺；“DMEM”是指达尔伯克改良伊格尔培养基；“DMF”是指N,N-二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲基亚砜；“DNA”是指脱氧核糖核酸；“cDNA”是指互补DNA；“DNase”是指脱氧核糖核酸酶；“DTT”是指二硫苏糖醇；“EC50”是指与预定的阳性对照化合物(绝对EC50)相比产生50％靶活性响应的活性剂的浓度；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“ee”是指对映异构体过量；“ERα”是指***受体α；“ERβ”是指***受体β；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“EtOH”是指乙醇或乙醇；“FBS”是指胎牛血清；“HBSS”是指Hank平衡盐溶液；“HEC”是指指羟乙基纤维素；“HEPES”是指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“HPLC”是指高效液相色谱；“IC50”是指该活性剂可能产生50％最大抑制响应的活性剂的浓度(相对IC50)或与安慰剂对照相比产生50％靶酶活性抑制的活性剂的浓度(绝对IC50)；“IPA”是指异丙胺；“iPrOH”是指异丙醇或异丙基醇；“IV”是指静脉内施用；“Ki”是指抑制常数；“MEK”是指甲基乙基酮；“MeOH”是指甲醇或甲醇；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“PO”是指口服施用；“PRα”是指孕酮受体α；“QD”是指每日一次给药；“RNA”是指核糖核酸；“RNase”是指核糖核酸酶；“RT-PCR”是指逆转录聚合酶链式反应；“RT-qPCR”是指逆转录定量聚合酶链式反应；“SFC”是指超临界流体色谱；“TED50”是指实现肿瘤中的靶50％抑制的有效剂量；“THF”是指四氢呋喃；“t(R)”是指保留时间；“XantPhosPd G2”是指氯[(4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨)-2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)；和“XPhos Pd G2”是指氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯)]钯(II)。
以下制备例和实施例进一步说明本发明。
制备例和实施例
流程1
流程1描述了式I化合物的合成。
在步骤A中，完成格氏反应。格氏反应作为用于形成碳-碳键的反应是本领域公知的。该反应包括有机金属反应，其中芳基卤化镁(格氏试剂)加成到羰基例如化合物2的酰基氯上，得到步骤A的化合物。例如，用格氏试剂例如异丙基氯化镁处理4-氯取代的喹诺酮(化合物1)以形成格氏中间体，然后在溶剂例如THF中加入酰基氯(4-氟苯甲酰氯)(化合物2)。反应完成时，可用水猝灭反应以得到化合物3。
在步骤B中，化合物3的芳基甲醚可在技术人员可识别的多种条件下去甲基化，例如用三溴化硼处理。例如，在溶剂例如DCM中，在约0℃的温度下，用三溴化硼缓慢处理化合物3。在室温下搅拌混合物，用磷酸氢二钾淬灭，得到化合物4。
在步骤C中，该氮杂环丁烷醚6可以如下形成：在适当的极性非质子溶剂如DMF或THF中，用合适的碱，例如氢化钠、叔丁醇钠或叔丁醇钾处理相应的对氟苯基酮4和氮杂环丁烷醇盐5或相应的游离碱，以得到醚化合物6。
然后在Suzuki交叉偶联反应中用适当的取代芳基硼酸(化合物7)将化合物6烷基化，在步骤D中得到化合物8。本领域技术人员将认识到，存在可用于促进这种交叉偶联反应的多种条件。合适的钯试剂可以包括XantPhos Pd G2,A Pd G3、氯化双(三苯基膦)钯(II)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)与三环己基膦、(1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁)氯化钯(II)、四(三苯基膦)钯或乙酸钯(II)。合适的碱可以包括氟化钾、碳酸铯、碳酸钠、碳酸钾、叔丁醇锂或磷酸三钾一水合物。例如，化合物6可以与适当的硼酸化合物7(例如2-氟-4-(三氟甲基)苯基硼酸)在溶剂(例如2-甲基-2-丁醇)中与碱(例如碳酸钾)和催化剂(例如XPhos Pd G2)反应，并在微波条件下加热至约80℃，得到化合物8。
本领域技术人员将认识到步骤D，Suzuki交叉偶联反应，可以在步骤C的氮杂环丁烷醚形成之前完成。
在步骤E中，本领域技术人员将认识到，化合物8可以通过酮的初始还原而环化。这可以使用还原剂(诸如三乙基硼氢化锂)在溶剂(诸如1，4-二噁烷和THF)中、并在约0℃至室温的温度下完成，以得到相应的仲醇。该中间体醇可以负载在粗品上，并用合适的碱例如碳酸铯、氢化钠、叔丁醇钠或叔丁醇钾在溶剂例如THF、DMSO或DMF中脱质子化。所得醇盐可以在室温下加热至回流，或在约60℃的温度下，环化成芳基氟化物。然后可以获得在氟化物置换时形成的取代环醚，以得到式I的化合物。
或者，酮8可以被还原成醇，并在步骤F手性纯化，得到手性醇9，然后如上文对步骤E所述在步骤G中进行环化，得到式I的化合物。
在另一个备选反应中，可以使用手性试剂例如(R)-(+)-α.α-二苯基-2-吡咯烷甲醇与硼酸三甲酯和硼烷-二甲基硫醚将酮还原，直接得到所需的手性醇化合物9，然后可以如上文对步骤E所述在步骤G中环化化合物9，得到式I的化合物。
在任选的步骤中，本文所述的式I、式II和式III化合物的药学上可接受的盐可通过在标准条件下使本文所述的式I、式II和式III化合物的合适游离碱与合适的药学上可接受的酸在合适的溶剂中反应而形成。另外，此类盐的形成可在氮保护基脱保护后同时发生。药学上可接受的盐的可能形成是公知的。参见，例如，Gould,P.L.,“Salt selection forbasic drugs,”International Journal of Pharmaceutics,33:201-217(1986)；Bastin,R.J.等人“Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical NewChemical Entities,”Organic Process Research and Development,4:427-435(2000)；和Berge,S.M.等人,“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences,66:1-19,(1977)。本领域普通技术人员将理解，本文所述的式I、式II和式III化合物易于转化成药学上可接受的盐并且可分离为药学上可接受的盐。有用盐的实例包括但不限于苯磺酸盐和4-甲基苯磺酸盐。4-甲基苯磺酸盐也称为甲苯磺酸盐。
制备例1
2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙-1-醇
在N2下历经15分钟将三乙酰氧基硼氢化钠(405g，1.91mol)分批加入3-(氟甲基)氮杂环丁烷盐酸盐(160g，1.28mol)在DCM(2.4L)中的搅拌的0℃溶液中，并在0℃搅拌10分钟。在0℃历经1小时分6部分加入1,4-二噁烷-2,5-二醇(99g，0.83mol)，然后在0-5℃搅拌15分钟。使该反应温至室温，并在N2下搅拌2小时。历经20分钟将反应冷却至10-15℃，然后温至25-30℃，并保持在该温度达2小时。历经25-30分钟在10-15℃加入水(800mL)，是其温至室温5-10分钟，然后分离各层。用DCM(800mL)洗涤水层，分离各层，然后将合并的水层冷却至10-15℃，并使用50％氢氧化钠溶液(～540mL)将pH调节至13-14。使水层温至室温，用DCM(4X800mL)萃取，用硫酸钠(80g)干燥，过滤，并浓缩至干燥，得到标题化合物(139g，82％)，为粘稠的黄色油状物。ES/MS(m/z):134.1(M+H)。
制备例2
2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙醇-1-醇盐酸盐
将2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙醇-1-醇(529g，4mol)溶于MTBE(2.6L)中，并冷却至0℃。历经30分钟滴加加入HCl/EtOH溶液(492mL，30wt％)，然后在0℃搅拌30分钟。过滤固体，并用MTBE(2X200mL)洗涤滤饼。在N2下干燥8小时，得到标题化合物(580g，86％)，为白色固体。ES/MS(m/z):134.0(M+H)。
制备例3
(3-氯-7-甲氧基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮
将4-溴-3-氯-7-甲氧基喹啉(70g，254mmol)和THF(1L)的混合液冷在N2下却至-40℃，产生物质沉淀。历经20分钟加入异丙基氯化镁(2M在THF中，254mL，509mmol)，并将该混合液搅拌1小时。滴加加入4-氟苯甲酰氯(66mL，559mmol)在THF(140mL)中的溶液，然后使其温至室温。用饱和的NH4Cl溶液(300mL)和水(200mL)淬灭反应，并分离各层。饱和的NH4Cl溶液(300mL)用洗涤有机层，经MgSO4干燥，过滤，并浓缩得到油性残余物。经硅胶用MTBE/己烷混合液(1:1)洗脱过滤粗制的棕色油状物，得到粗制的产物，为黄色固体(84g)。用10％乙酸甲脂/庚烷(800mL)处理固体，并在室温搅拌过夜。过滤以收集固体并保存。浓缩滤液，并经硅胶用10-40％ EtOAc/己烷洗脱纯化，然后用10％乙酸甲脂/庚烷(200mL)处理产物，并在室温搅拌3小时。过滤得到的固体，与来自之前过滤的固体合并，并真空干燥过夜，得到标题化合物(31g，38％)，为黄色固体。ES/MS(m/z):316.0(M+H)。
制备例4
(3-氯-7-羟基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮
将三溴化硼(1M，在DCM中，295mL，295mmol)加入(3-氯-7-甲氧基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮(31g，98mmol)在DCM(217ml)中的混合液中，并将该混合液在室温搅拌3天。将该混合液缓慢倾入磷酸氢二钾(2M，在水中，700mL)和水(200mL)的0℃溶液中。使该混合液温至室温，并搅拌1小时。在真空下浓缩溶液以除去有机溶剂，过滤，收集滤液，并在真空下干燥在45℃滤液过夜。用DCM/庚烷(1:1，450mL)处理固体，并搅拌过夜。收集固体，并真空干燥过夜，得到标题化合物(32g，定量收率)，为浅棕色固体。ES/MS(m/z):302.0(M+H)。
制备例5
(3-氯-7-羟基喹啉-4-基)-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)甲酮
将2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙醇-1-醇盐酸盐(3.90g，23.0mmol)加入(3-氯-7-羟基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮(5.00g，15.3mmol)在DMF(75ml)中的搅拌的溶液中，随后加入氢化钠(60％在矿物油中，3.02g，76.8mmol)。在N2下搅拌，并温至40℃达45分钟。用水淬灭溶液，并浓缩。将残余物在20％iPrOH/CHCl3和饱和的碳酸氢钠水溶液之间分配，并分离，将水相用2x20％iPrOH/CHCl3萃取，合并有机萃取物，经硫酸镁干燥合并的有机层，过滤和浓缩滤液，得到粗制的产物，为暗红色油状物。经硅胶柱色谱纯化粗制的物质用5-10％的7N在MeOH/DCM中的NH3的梯度洗脱，得到标题化合物(5.31g，84％)，为黄色固体。ES/MS(m/z):415.0(M+H)。
制备例6
(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羟基喹啉-4-基}甲酮
将(3-氯-7-羟基喹啉-4-基)-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)甲酮(200mg，0.48mmol)、2-氟-4-(三氟甲基)苯基硼酸(158mg，0.72mmol)、硼酸(202mg，1.45mmol)、2-甲基-2-丁醇(3ml),和水(1ml)的混合物在微波小瓶中用N2(5x)脱气。加入XPhos Pd G2(12mg，0.015mmol)，密封，并在80℃微波2小时。将残余物在MTBE和饱和的NH4Cl溶液之间分配。分离各层，并用MTBE萃取水层。合并有机萃取物，经硫酸镁干燥，过滤，并浓缩滤液，得到橙色残余物。经硅胶柱色谱用5％ MeOH/DCM洗脱纯化粗制的物质，得到标题化合物(205mg，78％)，为黄色固体。ES/MS(m/z):543.2(M+H)。
以基本上类似于制备例6的方法制备以下化合物，在操作中进行以下改变，加热1-2小时，用MTBE或EtOAc萃取，将有机层经硫酸镁或硫酸钠干燥。通过硅胶柱色谱法纯化，使用最高10％(MeOH或7M含氨MeOH)的DCM溶液(制备例10：梯度为3-8％7M含氨MeOH的DCM溶液；制备例9和11：梯度为4-10％7M含氨MeOH的DCM溶液)，和/或通过如上所述的高pH反相色谱法纯化。
表2:根据制备例6制备的化合物
a通过高pH反相快速色谱法(RediSep Rf高效C18柱，用35-45％ACN的10mM碳酸氢铵水溶液(含5％MeOH)洗脱)纯化。
b经二氧化硅用4-10％在DCM中的7M含氨MeOH洗脱纯化后，进一步通过高pH反相快速色谱法(RediSep Rf高效C18柱，用30-44％ACN的10mM碳酸氢铵水溶液(含5％MeOH)洗脱)纯化。
制备例14
外消旋4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)(羟基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇
在N2下一起加入(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羟基喹啉-4-基}甲酮(305g，562.2mmol)和THF(1.5L)，并将溶液冷却至0-5℃。滴加加入三乙基硼氢化锂(1M在THF中，1.5L,1.5mol)。将该混合液在0-5℃搅拌1小时。滴加加入水(300mL)和饱和的NH4Cl(1L)。将该混合液温至室温。加入EtOAc(2L)，并收集有机层。用盐水(500mL)洗涤有机层，经MgSO4干燥，过滤，并浓缩至干燥。将残余物溶于丙酮和2M在MeOH中的氨的95:5的混合液中，并经硅胶过滤，得到标题化合物(264g，86.2％)，为橙色固体。ES/MS(m/z):545.2(M+H)。
制备例15
4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)(羟基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇，异构体1
在以下条件下使用手性色谱纯化外消旋4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)(羟基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇(354g，0.62mol):柱Chiralpak AD-H,150x50mm,流速300g/分钟,UV 350nm,流动相35％iPrOH，含0.5％ DMEA/CO2，柱温40℃，得到第一个洗脱异构体的标题化合物(171.4g，48％)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>98％ee，t(R)＝0.79分钟,柱:4.6×150mm Chiralpak AD-H,用在CO2中的35％iPrOH(含0.5％DMEA)流动相洗脱，流速为0.6mL/分钟，UV检测：350nm。
备选制备例15
向(R)-(+)-α.α-二苯基-2-吡咯烷甲醇(132mg，0.52mmol)在THF(20mL)中的溶液中加入硼酸三甲酯(65mg，0.62mmol)。将该混合液在N2下在室温搅拌1小时。加入硼烷-二甲基硫化物(2.0M在THF中，2.6mL，5.2mmol)，随后加入(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羟基喹啉-4-基}甲酮(1.0g，1.73mmol)。将该反应在45℃加热过夜。加入另外的硼烷-二甲基硫化物(2.0M在THF中，2.6mL，5.2mmol)，并在45℃搅拌5小时。缓慢加入饱和的NH4Cl溶液(25mL)，分离有机相。用20％iPrOH/CHCl3再萃取水萃取物。合并有机萃取物，经Na2SO4干燥，过滤，并蒸发，得到硼烷复合物中间体(1.2g)。在1,4-二噁烷(4mL)和乙醇胺(0.3mL，5mmol)中溶解三分之一的硼烷复合物中间体(0.4g，0.6mmol)，并将该反应加热至70℃达3小时。用饱和的NH4Cl溶液(25mL)淬灭反应，并分离有机相。用20％iPrOH/CHCl3(4x25mL)再萃取水萃取物。合并有机萃取物，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干燥，得到标题化合物，为橙色固体(0.33g，0.57mmol，100％收率)。LC/MS(m/z):[M+H]+545。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，96％ee,t(R)＝0.79分钟，柱:4.6×150mm Chiralpak AD-H，用含0.5％在CO2中的DMEA 35％iPrOH的流动相洗脱，流速为0.6mL/分钟,UV检测：350nm。
实施例1
外消旋5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
将(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羟基喹啉-4-基}甲酮(5.27g，9.71mmol)在1,4-二噁烷(100mL)中的溶液冷却至5℃。加入三乙基硼氢化锂(1M在THF中，30.0mL，30.0mmol)。除去冷却浴，并在室温搅拌1.5小时。将该混合液用水淬灭。加入饱和的NH4Cl溶液和EtOAc。分离各层，并用EtOAc萃取水层。合并有机萃取物，经无水MgSO4干燥，过滤，并浓缩滤液。溶解在THF(100mL)中的粗制的残余物。加入氢化钠(60％在矿物油中，1.94g，48.5mmol)。将溶液回流1.5小时。加入另外的氢化钠(60％在矿物油中，1.94g，48.5mmol)，然后再回流另外的30分钟。将溶液冷却至室温，并用水淬灭。加入EtOAc和饱和的NH4Cl溶液。分离各层，并用EtOAc萃取水层。合并有机萃取物，经无水MgSO4干燥，过滤，并浓缩滤液。通过硅胶柱色谱用5-7％在DCM中的MeOH梯度洗脱纯化残余物，得到标题化合物(3.70g，72％)，为淡黄色泡沫。ES/MS(m/z):525.2(M+H)。
以基本上类似于实施例1的方法的方式制备以下化合物，在操作上进行以下改变。对于还原，使用3至5当量三乙基硼氢化锂，反应时间为30分钟至1小时，并将有机层在硫酸镁或硫酸钠上干燥。在环化之前，直接使用粗制的残余物或通过硅胶柱色谱法用DCM中的0-5-7.5-10％ MeOH梯度洗脱纯化。通过在THF中回流至多16小时完成环化，或在DMF中在室温下回流2小时(对于实施例2)，在85℃回流2小时(对于实施例8)。用DCM或EtOAc萃取，经硫酸镁或硫酸钠干燥有机层。通过硅胶柱色谱法纯化，使用最高10％(MeOH或7M的含氨MeOH)的DCM溶液(实施例2：梯度0-10％ MeOH的DCM溶液；实施例5：梯度4-10％7M的含氨MeOH的DCM溶液；实施例8：梯度5-7.5％7M的含氨MeOH的DCM溶液)，或通过如上所述的高pH反相HPLC纯化。
表3:根据实施例1制备的实施例化合物
a用高pH反相HPLC(C18,5μm,30×250mM柱，用35-50％ACN的10mM碳酸氢铵水溶液(含5％MeOH)洗脱)纯化。
b通过高pH反相HPLC(C18,5μm,30×250mm柱，用35-43％ACN的10mM碳酸氢铵水溶液(含5％MeOH)洗脱)纯化。
c经硅胶用4-10％在DCM中的7M含氨MeOH洗脱纯化后，进一步通过高pH反相HPLC(C18,5μm,30×250mm柱，用30-44％ACN的10mM碳酸氢铵水溶液(含5％MeOH)洗脱)纯化。
d通过高pH反相HPLC(C18 5μm OBD,30×75mm柱，用10-75％ACN的10mM碳酸氢铵水溶液(含5％ MeOH)洗脱)纯化。
e通过高pH反相HPLC(C18 5μm OBD,30×75mm柱，用10-60％ACN的10mM碳酸氢铵水溶液(含5％ MeOH)洗脱)纯化。/>
实施例1A
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体1
和
实施例1B
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
用以下条件通过手性SFC分离5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇的两个对映异构体:柱:Cellulose-1,5×25cm；用30％在CO2中的iPrOH(含0.5％ DMEA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:300g/分钟；UV检测波长:270nm，得到实施例1A，为第一个洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):525.2(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>99％ee,t(R):1.30分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的30％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。分离实施例1B的标题化合物，得到第二个洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS(m/z):525.2(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体2的对映体富集，98％ee,t(R):2.03分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的30％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。
备选的制备实施例1B
结晶5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
在水(250mL)中以1000rpm搅拌5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇,4-甲基苯磺酸，异构体2(23.8g，0.034mol)。加入NaOH(76μL)，并将该溶液搅拌2小时。加入DCM(600mL)。将该混合液分离，用硫酸镁干燥DCM萃取物，经注射过滤器(0.45μm)过滤物质，并浓缩至干燥。将物质放置在N2气流下度过周末。加入1:1EtOH/水(80mL)，并将该混合液在超声下搅拌。通过在尼龙膜上过滤收集褐色固体，得到标题化合物(10.47g，0.02mol，59％)。
X-射线粉末衍射(XRD)
在Bruker D4 Endeav X-射线粉末衍射仪上获得结晶固体的XRPD图，该衍射仪装有CuKα源和Vantec检测器，在35kV和50mA操作。在4和40 2θ°之间扫描样品，步长为0.008 2θ°，扫描速率为0.5秒/步，使用1.0mm的发散度、6.6mm的固定抗散射和11.3mm的检测器狭缝。将干燥粉末装在石英样品架上，并使用载玻片获得光滑表面。在环境温度和相对湿度下收集晶形衍射图。在MDI-Jade中，根据内部NIST 675标准物，在完整图移动后，测定晶体峰位置，峰值在8.853和26.774 2θ°。在晶体学领域中公知，对于任何给定的晶型，衍射峰的相对强度可能由于由诸如晶体形态和习性等因素导致的优选取向而变化。当存在优选取向的影响时，峰强度改变，但是多晶型物的特征峰位置不变。参见例如美国药典#23，国家处方集#18，第1843页-1844页，1995。此外，在结晶学领域中也公知，对于任何给定的晶形，角峰位置可以稍微变化。例如，峰位置可能由于分析样品的温度变化、样品替代或存在或不存在内标而偏移。在本情况中，±0.2 2θ°的峰位置变化被认为考虑了这些潜在变化，而不妨碍所指示的晶型的明确鉴定。可以基于区别峰的任何独特组合来确认晶型。
通过使用CuKa辐射的XRD图表征制备的结晶5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇(异构体2)的样品，其具有下表4所述的衍射峰(2θ值)，特别是具有在19.8的峰与选自6.8、16.0和22.1的一个或多个峰的组合；衍射角的偏差为0.2度。
表4:结晶实施例1B的X-射线粉末衍射峰
峰 角(°2-θ)+/-0.2° 相对强度(最强峰的％)
1 6.8 29.40
2 15.3 8.30
3 16.0 20.10
4 17.4 7.60
5 18.1 16.00
6 19.8 100.00
7 21.1 14.60
8 22.1 28.90
9 24.9 16.40
10 25.4 21.90
备选的制备实施例1B
在N2下在室温将4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)(羟基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇，异构体1(63.05g，104.7mmol)溶解于DMSO(1.3L)中。历经5分钟分批加入碳酸铯(108g，331mmol)。将该混合液加热至60℃达15小时。将该混合液冷却至室温，并用水(2.1L)和EtOAc(1.3L)稀释。将该混合液搅拌5分钟，并分离。用EtOAc(1.3L)再萃取水性物质，并搅拌5分钟。分离并合并有机萃取物，用盐水、水和EtOAc洗涤。用MgSO4干燥有机萃取物，浓缩，并在高真空下在室温干燥过夜，得到标题化合物，为棕色固体(52.69g，95.9％)。通过手性分析SFC证实实施例1B的对映体富集，98.1％ee,t(R):2.03分钟；柱:OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的30％ MeOH(0.2％IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。
实施例2A
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体1
和
实施例2B
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
通过手性SFC用以下条件分离5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇的两个对映异构体:柱:IC,21×250cm；用在CO2中的30％iPrOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:70g/分钟；UV检测波长:225nm，得到实施例2A，为第一个洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):525.1(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>99％ee,t(R):1.56分钟；柱:/>IC,4.6×150mm；用在CO2中的30％iPrOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。分离实施例2B的标题化合物，得到第二个洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS(m/z):525.2(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体2的对映体富集，98％ee,t(R):2.33分钟；柱:/>IC,4.6×150mm；用在CO2中的30％iPrOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。
实施例3A
8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体1
和
实施例3B
8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
通过手性SFC用以下条件分离8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇的两个对映异构体:柱:OD-H,21×250cm；用在CO2中的35％ MeOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:80g/分钟；UV检测波长:225nm，得到实施例3A，为第一个洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):491.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>99％ee,t(R):1.55分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的35％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。分离实施例3B的标题化合物，得到第二个洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS(m/z):491.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体2的对映体富集，>99％ee,t(R):2.26分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的35％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。/>
实施例4A
7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体1
和
实施例4B
7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
通过手性SFC用以下条件分离7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇的两个对映异构体:柱:OD-H,21×250cm；用在CO2中的35％ MeOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:80g/分钟；UV检测波长:225nm，得到实施例4A，为第一个洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):491.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>99％ee,t(R):1.71分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的35％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。分离实施例4B的标题化合物，得到第二个洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS(m/z):491.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体2的对映体富集，>99％ee,t(R):2.38分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的35％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。
实施例5A
8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体1
和
实施例5B
8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
通过手性SFC用以下条件分离8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇的两个对映异构体:柱:OD-H,21×250cm；用在CO2中的30％ MeOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:80g/分钟；UV检测波长:225nm，得到实施例5A，为第一个洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):475.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>99％ee,t(R):1.56分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的30％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。分离实施例5B的标题化合物，得到第二个洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS(m/z):475.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体2的对映体富集，>99％ee,t(R):2.29分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的30％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。
实施例6A
7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体1
和
实施例6B
7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
通过手性SFC用以下条件分离7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇的两个对映异构体:柱:OD-H,21×250cm；用在CO2中的35％ MeOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:80g/分钟；UV检测波长:225nm，得到实施例6A，为第一个洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):475.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>99％ee,t(R):1.32分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的35％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。分离实施例6B的标题化合物，得到第二个洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS(m/z):475.0(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体2的对映体富集，>99％ee,t(R):1.95分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的35％ MeOH(0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。
实施例8A
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体1
和
实施例8B
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2
/>
通过手性SFC用以下条件分离5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇的两个对映异构体:柱:OD-H,21×250cm；用在CO2中的30％iPrOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:80g/分钟；UV检测波长:265nm，得到实施例8A，为第一个洗脱对映异构体(异构体1)。ES/MS(m/z):471.2(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体1的对映体富集，>99％ee,t(R):1.47分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的30％iPrOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。分离实施例8B的标题化合物，得到第二个洗脱对映异构体(异构体2)。ES/MS(m/z):471.2(M+H)。通过手性分析SFC证实异构体2的对映体富集，>99％ee,t(R):2.05分钟；柱:/>OD-H,4.6×150mm；用在CO2中的30％iPrOH(含0.2％ IPA)的流动相洗脱；柱温:40℃；流速:5mL/分钟；UV检测波长:225nm。
实施例9
5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2，苯磺酸
在50℃加热5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2(实施例1B)(100mg，0.19mmol)在ACN(3mL)中的浆体。加入苯磺酸一水合物(40mg，0.23mmol)在ACN(1mL)中的溶液。将该澄清的黄色溶液在50℃加热10分钟。停止加热，将该反应混合液冷却至室温，并将该混合液搅拌过夜。加入甲苯(2mL)，并搅拌该反应混合液2小时。过滤溶液，收集得到的固体，并用ACN(1mL)洗涤固体。在真空下干燥固体，得到标题化合物(74mg，55％)。
备选的制备实施例9
在50℃加热5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2(实施例1B)(124.1mg，0.24mmol)在MEK(4mL)中的浆体。加入苯磺酸一水合物(50mg，0.28mmol)溶于MEK(1mL)中的溶液。停止加热，将该反应混合液冷却至室温，并将该混合液搅拌历经周末。在N2气流下浓缩。加入MEK(1mL)和浆体，得到黄色结晶固体。收集固体，用MEK洗涤，并在室温真空下干燥，得到标题化合物(78.8mg，48％)。
XRD，实施例9
如实施例1B所述完成XRD。通过使用CuKa辐射的XRD图表征制备的-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2,苯磺酸的样品，其具有下表5中所述的衍射峰(2θ值)，特别是具有在20.5处的峰与选自12.3、22.2和23.1的一个或多个峰的组合；衍射角的偏差为0.2度。
表5:结晶实施例9的X-射线粉末衍射峰
实施例10
结晶5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇,4-甲基苯磺酸，异构体2
一起加入5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，异构体2(实施例1B)(204.2g，389mmol)和EtOAc(5L)，并在60℃搅拌，随后在60℃加入MeOH(200mL)，得到澄清的棕色溶液。加入标题产物(11.48g)以接种该溶液，随后加入4-甲基苯磺酸的预混合溶液；在EtOAc(800mL)中的水合物(81.4g，428mmol)，得到黄色混悬液。将该混悬液在50℃搅拌30分钟。将该混悬液浓缩至1/2体积。将该溶液在室温冷却1小时，过滤，收集固体，并用EtOAc洗涤固体。在真空下在30℃干燥固体过周末，得到标题化合物(239g，343mmol)。为了进一步纯化该物质，一起加入标题化合物(229g，328.7mmol)和2–丙醇(4.6L)，并加热至60℃达2小时。冷却至室温30分钟。过滤固体，并用iPrOH(100mL)洗涤。在N2流下干燥固体过夜，得到标题化合物(174.4g，76.2％)。将基本上以相同方式制备的各批标题化合物合并，并加入庚烷(2L)。将该混悬液搅拌30分钟，过滤固体，并用庚烷(300mL)洗涤。在N2流下干燥收集的固体过夜，得到标题化合物(199.7g，99.5％)。
XRD，实施例10
如实施例1B所述完成XRD。5-(4-{2-[3-(氟甲基)氮杂环丁烷-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并吡喃并[4,3-c]喹啉-2-醇,4-甲基苯磺酸，异构体2(实施例10)的制备样品的特征在于使用CuKa辐射的XRD图，其具有下表6中所述的衍射峰(2-θ值)，特别是在20.1处具有峰与选自12.8、19.5和22.8的一个或多个峰的组合；衍射角的偏差为0.2度。
表6:结晶实施例10的X-射线粉末衍射峰
峰 角(°2-θ)+/-0.2° 相对强度(最强峰的％)
1 7.6 25.70
2 12.4 27.90
3 12.8 36.80
4 18.9 26.50
5 19.5 56.90
6 20.1 100.00
7 20.9 41.50
8 21.8 40.90
9 22.8 39.40
10 25.4 29.70
生物学测定
ER表达和某些癌症之间的关系的证据是本领域公知的。
以下测定的结果证明，实施例中的式I、式II和式III化合物是活性SERD，并被认为可用于治疗癌症。
ER(野生型)、ERα(Y537S突变体)和ERβ竞争结合测定
以下ER竞争结合测定的目的是确定测试化合物对ERα(野生型)、ERα(Y537S突变体)和ERβ的亲和力。
在含有50mM HEPES，pH 7.5，1.5mM EDTA，150mM NaCl，10％甘油，1mg/mL卵清蛋白，和5mM DTT的缓冲液中进行竞争结合测定，使用0.025μCi/孔的3H-***(118Ci/mmol，1mCi/mL)，7.2ng/孔ERα(野生型)或7.2ng/孔ERα(Y537S突变体)或7.7ng/孔ERβ受体。加入10,000nM-0.5nM的10种不同浓度的测试化合物，并在1μM的17β***的存在下测定非特异性结合。在室温下将结合反应物(140μL)孵育4小时，然后向每个反应物中加入冷的葡聚糖-炭缓冲液(70μL)(每50mL测定缓冲液含有0.75g炭和0.25g葡聚糖)。在定轨摇床上于4℃将平板混合8分钟，然后于4℃以3000rpm离心10分钟。将混合物的等分试样(120μL)转移至另一个96孔白色底板(Costar)并向每个孔中加入Perkin Elmer Optiphase Supermix闪烁液(175μL)。将板密封并在轨道式振动器上剧烈振动。孵育2.5小时后，在Wallac Microbeta计数器中读板。使用4参数逻辑曲线拟合计算IC50并计算在10μM的％抑制。使用Cheng-Prusoff方程将化合物的IC50值转化为Ki。该测定的结果证明，实施例1、1A和1B(和其它实施例)结合重组ERα野生型和ERα突变体(Y537S)，如下面表7所示，并且还测定实施例1B以0.11+0.07的Ki(nM)ERβ竞争结合ERβ，n＝3。
表7:ERα(野生型)、ERα(Y537S突变体)和ERβ竞争结合的结果
实施例# Ki(nM)ERα(野生型) Ki(nM)ERα(Y537S突变体)
1 0.87 5.80
1A 12.45±9.32,n＝3 57.18±39.13,n＝3
1B 0.31±0.38,n＝5 2.79±3.00,n＝5
2 2.17 6.78
2A 0.65 7.92
2B 60.4 293.6
3 2.36 6.69
3A 8.11 27.23
3B 0.59 2.79
4 0.64 12.11
4A 16.78 54.97
4B 0.34 2.34
5 2.82 19.47
5A 12.54 81.15
5B 1.30 6.56
6 4.14 15.77
6A 8.53 45.99
6B 1.13 5.71
7 1.55 8.55
8 3.20 11.4
8A 9.33 66.94
8B 0.94 5.44
在测试的示例性化合物中，ERα野生型的Ki范围为约0.300nM-约65nM。ERαY537S突变体的Ki范围为约2nM至300nM。该试验的结果证明了示例化合物对ERα野生型、突变体(ESR1 Y537NS)和ERβ蛋白的结合亲和力和效力。
MCF7细胞中ERα降解测定
下列ERα降解试验的目的是测定ERα阳性乳腺癌细胞系如MCF7中测试化合物对ERα的降解。
在补充了10％ FBS、0.01mg/mL人胰岛素1和1％青霉素/链霉素抗生素的DMEM培养基中培养MCF7(购自ATCC HTB-22)细胞，并以4,000个细胞/孔的密度在384孔平底平板中在含有10％活性炭处理的FBS的无酚红DMEM培养基(20μL)中铺板。在细胞培养箱中(5％ CO2，95％相对湿度和37℃)孵育细胞过夜，使细胞附着于板上。第二天向细胞施用测试化合物。使用Echo 555声学分配器来制备在6μM至0.0003μM范围内的测试化合物系列稀释液(1:3)。加入来自系列稀释板的5μL至细胞板，来向细胞给药，产生0.2％的最终DMSO浓度，最终测试化合物浓度剂量范围在2至0.0001μM之间。对于最大点，使用含有0.2％DMSO的培养基，对于最小点，使用在含有0.2％ DMSO的生长培养基中稀释至2μM终浓度的氟维司群。在给予测试化合物后，将细胞板在37℃和5％ CO2下孵育24小时。通过在室温下加入14％低聚甲醛(10μL)30分钟来固定细胞。用PBS(20μL)洗涤细胞一次，并用含有0.5％(v/v)20的PBS(20μL)孵育1小时。用含有0.05％/>20的PBS(2×)洗涤细胞，并用在含有0.05％20和0.1％ TRITONTMX-100的PBS中的3％ BSA(20μL/孔)在室温下封闭1小时。每孔加入1:500初级抗体(20μL)(ERα(克隆SP1)单克隆兔抗体#RM-9101-S，ThermoScientific)，其稀释在1％ BSA的PBS(含有0.05％/>20)中，密封板，在4℃下孵育过夜。第二天用含有0.05％/>20(2×)的PBS洗涤细胞，并与在1％ BSA的PBS中的二级抗体(20μL/孔)(1:1000稀释液，山羊抗兔IgM ALEXA FLUORTM488)在室温下孵育105分钟。用PBS(2×20μL)洗涤板后，加入RNase(Sigma)(20μL，50μg/mL)和1:1000碘化丙啶在PBS中的稀释液/孔(20μL)。将板密封并在工作台上于室温孵育1小时(避光保存)。用ACUMENEXPLORERTM[TTP LABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞仪]扫描板以测量ERα。图像分析是基于细胞荧光信号，用于鉴定阳性细胞。通过平均强度鉴定ER阳性细胞。用碘化丙啶/DNA在575-640nm处的总强度鉴定单个细胞。试验输出值为％ER阳性细胞。通过使用GENE DATATM对每个输出值进行曲线拟合至四参数逻辑曲线来确定IC50。该试验的结果证明在MCF7乳腺癌细胞中本文所述式I、式II和式III化合物诱导的ERα的强效降解。实施例1、1A和1B的相对IC50值示于表8。
表8:MCF7细胞中ERα降解测定
具体地，表8中的结果显示实施例1的化合物在MCF7乳腺癌细胞中强效降解ERα。在测试的示例性化合物中，相对IC50范围为0.003至＞2μM，表明除了实施例2B之外的所有化合物在测试浓度下均显示活性。该分析的结果证明，式(I)化合物是在细胞中具有强效的ERα降解活性的SERD。
MCF7细胞中PRα的诱导测定
下列PRα诱导测定法的目的是测定测试化合物是否具有ERα受体激动剂活性(预期激动剂将活化该受体)。
在补充有10％ FBS、0.01mg/mL人胰岛素1和1％青霉素/链霉素抗生素的DMEM培养基中培养MCF7(购自ATCC HTB-22)，并将细胞(在变为70％汇合之前)以每孔4,000个细胞的密度在384孔底板中、在20μL体积、在含有10％ FBS的无酚红DMEM培养基(活性炭处理)中铺板。在细胞培养箱中(5％ CO2，95％相对湿度，37℃)孵育细胞过夜，使细胞附着于板上。第二天，向细胞施用测试化合物。使用Echo 555声学分配器来制备6μM至0.0003μM范围内的化合物系列稀释液(1:3)。加入了来自系列稀释板的测试化合物(5μL)至细胞板，来向细胞给药，产生0.2％的最终DMSO浓度，测试化合物的最终浓度剂量范围在2至0.0001μM。对于最大点，使用含有0.2％ DMSO的培养基，对于最小点，使用在含有0.2％ DMSO的生长培养基中稀释至2μM终浓度的氟维司群。在给予测试化合物后，将细胞板在37℃和5％CO2下孵育24小时。通过在室温下加入14％低聚甲醛(10μL)30分钟来固定细胞。用PBS(20μL)洗涤细胞一次，并用含有0.5％(v/v)20的PBS(20μL)孵育1小时。在室温下用含有0.05％20的PBS(20μL)洗涤细胞两次，并用在含有0.05％ />20和0.1％TRITONTMX-100的PBS中的3％ BSA(20μL/孔)封闭1小时。每孔加入1:500初级抗体(20μL)(PR单克隆小鼠抗人抗体，克隆PgR 636Dako，M3569)在1％ BSA/PBS(含有0.05/>20)中的稀释液，密封板，并在4℃下孵育过夜。
第二天，用PBS 0.05％20(2×20μL)洗涤细胞，并与在PBS1％ BSA中的二级抗体(20μL/孔)(1:1000稀释，山羊抗兔IgM ALEXA FLUORTM488)于室温下孵育105分钟。用PBS(2×20μL)洗涤后，每孔加入RNase(20μL，50μg/mL)(Sigma)和1:1000碘化丙啶在PBS中的稀释液。将板密封并在工作台上于室温孵育1小时(避光保存)。用ACUMEN EXPLORERTM[TTP LABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞仪]扫描板以测量PRα。图像分析是基于细胞荧光信号，用于鉴定阳性细胞。通过平均强度鉴定PR阳性细胞。用碘化丙啶/DNA在575-640nm处的总强度鉴定单个细胞。试验输出值为％PR阳性细胞。通过使用GENE DATATM对每个输出值进行曲线拟合至四参数逻辑曲线来确定IC50。该试验结果表明在MCF7乳腺癌细胞中实施例1、1A和1B没有显著的激动活性。对于测试的化合物，在该试验中的相对IC50＞2μM。该试验的结果表明在MCF7乳腺癌细胞中测试的示例化合物没有显著的激动活性。这些结果还证明所测试的示例性化合物是MCF7乳腺癌细胞中ERα的拮抗剂(即它们具有SERD活性)。
在MCF7-ESR1 Y537N 682CRISPR细胞中的PRα抑制(ERα功能拮抗)细胞试验
下列PRα抑制(ERα功能拮抗)细胞测定的目的是测定测试化合物对Y537N突变ERα受体的拮抗活性。在该试验中，拮抗剂预期阻断ERα受体的功能。PRα是ERα的下游转录靶标，因此预期ERα的拮抗剂抑制PRα的表达。
在补充10％ FBS和1％青霉素/链霉素抗生素的DMEM培养基中培养MCF7-ESR1Y537N-682(由MCF7细胞中ESR1基因的CRISPR/Cas9基因编辑产生，克隆#682)，并将细胞(在变为70％汇合之前)以每孔4,000个细胞的密度在384孔底板中在无酚红DMEM培养基10％ FBS(20μL体积)(活性炭处理)中铺板。在细胞培养箱中(5％ CO2，95％相对湿度和37℃)孵育细胞过夜，使细胞附着于板上。第二天向细胞施用测试化合物。使用Echo 555声学分配器来制备在6μM至0.0003μM范围内的化合物系列稀释液(1:3)。加入来自系列稀释板的5μL至细胞板，来向细胞给药，产生0.2％的最终DMSO浓度，最终测试化合物浓度剂量范围在2至0.0001μM之间。对于最大点，使用含有0.2％ DMSO的培养基，和对于最小点，使用在含有0.2％ DMSO的生长培养基中稀释至2μM终浓度的氟维司群。在给予测试化合物后，将细胞板在37℃和5％ CO2下孵育72小时。通过在室温下加入14％低聚甲醛(10μL)30分钟来固定细胞。用PBS(1×20μL)洗涤细胞，并用含有0.5％(v/v)20的PBS(20μL)孵育1小时。用PBS(2×20μL)、0.05％/>20洗涤细胞，并用3％ BSA/PBS 0.05％/>20、0.1％ TRITONTMX-100(20μL/孔)在室温下封闭1小时。每孔加入1:500初级抗体(20μL)(PR单克隆小鼠抗人抗体，克隆PgR 636Dako，M3569)在1％ BSA/PBS(含有0.05％/>20)中的稀释液，密封板，并在4℃下孵育过夜。
第二天，用PBS(2×20μL)洗涤细胞，并与在PBS1％ BSA中的二级抗体(20μL/孔)(1:1000稀释，山羊抗兔IgM ALEXA FLUORTM488)在室温下孵育105分钟。用PBS(2×20μL)洗涤后，加入RNase(20μL，50μg/mL)(Sigma)和1:1000碘化丙啶在PBS中的稀释液/孔。将板密封并在工作台上于室温孵育1小时(避光保存)。用ACUMEN EXPLORERTM[TTP LABTECHLTD制造的激光扫描荧光微量培养板血细胞计数器]扫描板以测量PRα。图像分析是基于细胞荧光信号，用于鉴定阳性细胞。通过平均强度鉴定PR阳性细胞。用碘化丙啶/DNA在575-640nm处的总强度鉴定单个细胞。试验输出值为％PR阳性细胞。通过使用GENE DATATM对每个输出值进行曲线拟合至四参数逻辑曲线来确定IC50。
该试验结果表明实施例1、1A和1B在MCF7(ESR1 Y537N，杂合突变体)乳腺癌细胞中强效抑制PRα和功能拮抗。在该试验中实施例1、1A和1B(和其它实施例)的相对IC50示于下表9。测试的示例性化合物的相对IC50范围为约0.0118至＞1.6μM，表明示例性化合物是ERα突变体的强效拮抗剂(Y537N)和ERα介导的转录的强效抑制剂，除了实施例2B 1.6μM)。PRα(PGR)也是ERα的转录靶标，并且该测定的结果证明了对ERα介导的PRα转录的强效抑制。
表9:在MCF7Y537N 682 CRISPR细胞中的PRα抑制(ERα功能拮抗)细胞测定
实施例# 相对IC50(μM)
1 0.01679±0.00003,n＝2
1A 1.20±0.29,n＝2
1B 0.0130±0.0059,n＝14
2 0.01451±0.002619,n＝2
2A 0.02494±0.007386,n＝3
2B 1.639±0.2228,n＝3
3 0.07717±0.01154,n＝2
3A 0.6117
3B 0.016
4 0.03854+0.003865,n＝2
4A 0.5052
4B 0.01181
5 0.06614±0.01551,n＝2
5A 0.3945
5B 0.01822+0.009815,n＝2
6 0.06319±0.01609,n＝2
6A 0.2364
6B 0.0136
7 0.1271
8 0.04124+0.006572,n＝2
8A 0.4335+0.1946,n＝3
8B 0.008926±0.003828,n＝3
10 0.007936±0.003163,n＝3
在MCF7细胞中的PRα抑制(ERα功能拮抗)细胞测定
下列PRα抑制(ERα功能拮抗)细胞试验的目的是测定测试化合物对ERα受体的拮抗活性。在该试验中，拮抗剂预期阻断ERα受体的功能。PRα是ERα的下游转录靶标，因此预期ERα的拮抗剂抑制PRα的表达。
使用MCF7细胞系进行在上述ERα降解细胞基础Acumen测定中详述的测定条件，不同之处在于，在分配测试化合物之前，从细胞板中除去培养基，并用含有0.47nM***的测定培养基预处理除阴性对照孔(板的第24列)外的所有孔30分钟。在该测定中，进行免疫染色以检测PRα，并用ACUMEN EXPLORERTM[由TTP LABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞仪]扫描板以测量PRα。图像分析是基于细胞荧光信号，用于鉴定阳性细胞。通过平均强度鉴定PRα阳性细胞。使用来自碘化丙啶/DNA的575-640的总强度鉴定单个细胞。试验输出值为％PRα阳性细胞。通过使用GENE DATATM对每个输出值进行曲线拟合至四参数逻辑曲线来确定IC50。该试验的结果表明实施例1、1A和1B在MCF7乳腺癌细胞中强效抑制PRα和功能拮抗。在该试验中实施例1、1A和1B的相对IC50示于下表10中。示例性化合物的相对IC50范围为约0.029至＞2μM，表明除1A和2B外，测试的所有示例性化合物为ERα野生型蛋白的强效拮抗剂和ERα介导的转录的强效抑制剂。PRα(PGR)也是ERα的转录靶标，并且该测定的结果证明了在测试浓度下对ERα介导的PRα转录的强效抑制。
表10:在MCF7细胞中的PRα抑制(ERα功能拮抗)细胞测定
实施例# 相对IC50(μM)
1 0.1283±0.0226,n＝3
1A >2.000
1B 0.04129±0.03370,n＝16
2 0.1634
2A 0.1215±0.05368,n＝2
2B >2.000
3 0.07666±0.02101,n＝3
3A 0.9274
3B 0.03435
4 0.07626±0.1676,n＝3
4A 0.8465
4B 0.02866
5 0.1180±0.01230,n＝2
5A 0.6002
5B 0.03203±0.005306,n＝2
6 0.08258+0.005682,n＝3
6A 0.2528
6B 0.02835
7 0.1134±0.02087,n＝2
8 0.06835±0.02273,n＝2
8A 0.2058
8B 0.04848±0.02944,n＝2
10 0.02633+0.004459,n＝3
MCF7和MCF7-ESR1 Y537N-682中的细胞增殖测定
以下细胞增殖测定的目的概括而言是检测测试化合物是否对细胞增殖有影响。
将密度为2,000个细胞/孔的MCF7(购自ATCC HTB-22)细胞接种于无酚红DMEM培养基10％ FBS(20μL体积)(活性炭处理)中，其在透明底部384孔细胞培养板中。将MCF7-ESRY537N-682(由MCF7细胞中的ESr1基因的CRISPR/Cas9基因编辑产生，克隆#682)铺在补充了10％ FBS和1％青霉素/链霉素抗生素的DMEM培养基中，密度为每孔1000个细胞。在37℃和5％ CO2下孵育板。第二天向细胞施用测试化合物。使用Echo 555声学分配器制备60μM至0.003μM范围内的测试化合物系列稀释液(1:3)。加入来自系列稀释板的5μL至细胞板，来向细胞给药，产生0.2％的最终DMSO浓度，最终测试化合物浓度剂量范围为20至0.001μM。对于最大点，使用含有0.2％ DMSO的培养基，对于最小点，使用在含有0.2％ DMSO的生长培养基中稀释至2μM终浓度的氟维司群。在给予测试化合物后，在37℃和5％ CO2下孵育细胞板。加入测试化合物七天后，从培养箱中取出板，并向每个孔中加入冷的EtOH 96％(65μL)。30分钟后，除去培养基，每孔加入RNase(20μL，50μg/mL)(Sigma)和1:1000碘化丙锭在PBS中的稀释液。将板密封并在工作台上于室温孵育1小时(避光保存)。用ACUMEN EXPLORERTM[TTPLABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞仪]扫描板。MCF-7细胞系生长形成聚集体，作为实物数量的细胞数量可能不能用作读数；因此，细胞数目可以通过估计的细胞数目来评估(通过面积参数(总细胞群的总面积的比率(FL-1(PI)的峰强度的指定范围和单细胞群的平均面积(由周长定义))来计算)。通过使用GENE DATATM对每个输出值进行曲线拟合至四参数逻辑曲线来确定IC50。MCF7 ESR1野生型和MCF7-ESR1 Y537N突变细胞中实施例1、1A和1B(和其它实施例)的相对IC50显示在下表11中。该试验结果证明了实施例1、1A和1B(和其它实施例)在MCF7(ESR1野生型)和MCF7(ESR1 Y537N突变)乳腺癌细胞中强效的抗增殖活性和细胞生长抑制。示例性化合物的相对IC50在MCF7 ESR1野生型中为约0.0035至1.176μM，在MCF7(ESR1 Y537N突变)乳腺癌细胞中为0.014至1.86μM，表明所有测试的示例性化合物在MCF7(ESR1野生型)和MCF7(ESR1 Y537N突变)乳腺癌细胞中都表现出强效的抗增殖活性和细胞生长抑制作用。
表11:MCF7和MCF7-ESR1 Y537N-682中的细胞增殖测定
MCF7肿瘤中的体内靶标抑制(IVTI)测定(PGR RT-qPCR测定)
该IVTI试验的目的是测定测试化合物(SERD)抑制植入小鼠的异种移植肿瘤中ERα下游的PRα基因表达(转录)的能力。
将来自Envigo RMS,Inc.,Madison,Wisconsin的雌性NOD SCID小鼠(22-25g)在右胁腹区皮下植入5×10e6 MCF7 ER阳性乳腺癌细胞(ATCC,#HTB-22)，其在1:1HBSS+MATRIGELTM溶液(200μL)。在肿瘤细胞植入前1天皮下植入17-β***丸剂(0.18mg/丸剂，90天释放，来自Innovative research)。在植入后第七天开始每周两次测量肿瘤生长和体重。当肿瘤大小达到250-350mm3时，随机选择动物并分组，每组五只动物。给动物口服施用在测试化合物特异性溶媒(1％羟乙基纤维素/0.25％ 80/0.05％消泡剂，在纯化水中)中的多剂量的测试化合物或单独口服溶媒，施用3天，并在最后一次施用后以所需的时间间隔收集肿瘤和血液。使用异氟烷麻醉加上颈部脱位处死动物。将肿瘤快速冷冻并储存在-80℃直至进行处理用于RNA分离和RT-qPCR测定。收集EDTA管中的血液，为获得血浆进行离心，并在96孔板中于-80℃冷冻。使用质谱法测定测试化合物暴露。
在液氮中粉碎肿瘤，并在FASTPREP-24TM细胞破坏器(MP Biomedical)中使用基质D珠(MP Biomedical，#6913-500)在1×RNA裂解缓冲液(来自RNA分离试剂盒)中裂解。以14000rpm在4℃旋转20分钟后，将肿瘤裂解物转移到新鲜的试管中。用RNAMini试剂盒(Invitrogen#12183018A)或RNeasy Mini试剂盒(Qiagen#74104和#74106)从肿瘤裂解物中分离RNA。使用/>DNase Set(Invitrogen#12185010)或RNase-FreeDNase Set(Qiagen#79254)去除DNA污染物。通过在无RNase的水中稀释样品并在读板仪(SpectraMax190)上测量260nm的吸光度来测量分离的RNA浓度。从所有其它RNA样品的260nm测量值中减去空白样品(仅不含RNase的水)的平均260nm吸光度测量值。在无RNase的水中将RNA样品稀释至相同浓度。使用RT-PCR的第一链合成***(Invitrogen,#18080-051)从稀释RNA合成cDNA。为了进行RT-qPCR，首先将cDNA稀释在无RNase的水中。将2×AbsoluteBlue qPCR ROX Mix(Thermo,#AB-4139/A)、PGR引物(Thermo,Hs01556702_m1)和用于每个反应的稀释的cDNA在PCR板(Applied Biosystems,#4309849)中合并。通过在热循环仪(ABIPrism 7900HT序列检测***)中在50℃下孵育样品2分钟，然后在95℃下孵育15分钟来扩增cDNA。继续在95℃下孵育15秒，然后在50℃下孵育60秒，共40个循环。将循环对管家基因进行标准化，并用于计算与单独的介质相比的％PGR抑制。一式两份分析每个样品，并使用平均数进行计算。使用Excel和XL Fit计算靶标(PGR)抑制百分比。
该试验的结果证明，实施例1B抑制了PRα(PGR)在肿瘤异种移植模型中的表达。采用30mg/kg剂量口服施用时，在肿瘤异种移植模型中24小时，实施例1B，抑制PRα(PGR)表达～78％。这些结果证明了在体内在肿瘤异种移植模型中ERα拮抗活性和ERα介导的转录活性的显著和持续抑制。
在植入小鼠的ER阳性(ESR1野生型)乳腺癌异种移植瘤模型中的体内肿瘤生长抑制研究
下列异种移植肿瘤抑制试验的目的是测量响应于测试化合物施用的肿瘤体积的减少。
在培养物中扩增人乳腺癌细胞MCF7(ATCC#HTB-22)和HCC1428(ATCC#CRL-2327)，收获并在雌性NOD SCID小鼠(22-25g，Envigo RMS,Inc)的右后胁皮下注射1:1HBSS+MATRIGELTM溶液(200μL)中的5×10e6个细胞。在细胞植入前二十四小时，皮下植入***丸剂(0.18mg/丸剂，17β***，90天释放，Innovative Research)。在培养物中扩增人乳腺癌细胞T47D(ATCC#HTB-22)，收获并在雌性NOD SCID小鼠(22-25g，Envigo RMS,Inc)的右后胁皮下注射1:1HBSS+MATRIGELTM溶液(200μL)中的5×10e6个细胞。在细胞植入前二十四小时，皮下植入***丸剂(0.38mg/丸剂，17β***，90天释放，Innovative Research)。在培养物中扩增人乳腺癌细胞ZR-75-1(ATCC#CRL-1500)，收获并在雌性NOD SCID小鼠(22-25g，Envigo RMS,Inc)的右后胁皮下注射1:1HBSS+MATRIGELTM溶液(200μL)中的5×10e6个细胞。在细胞植入前二十四小时，给动物施用50μl戊酸***(10mg/mL)血管内注射，然后在研究期间每14天施用一次。在植入后第七天开始每周两次测量肿瘤生长和体重。当肿瘤大小达到250-350mm3时，随机选择动物并分组，每组5只动物。在适当的介质(1％羟乙基纤维素/0.25％ 80/0.05％消泡剂，在纯化水中)中制备测试化合物实施例1B，并通过口服管饲法施用28天，QD。通过在治疗过程期间每周进行两次的肿瘤体积测量来确定肿瘤应答。每当测量肿瘤体积时，将体重作为毒性的一般量度。
发现实施例1B的化合物具有下表12中提供的ΔT/C％值。这些结果表明实施例1B的化合物在小鼠中表现出良好的口服生物利用度，并且在ER阳性(ESR1野生型)人乳腺癌异种移植物模型中显示出显著的抗肿瘤活性或肿瘤消退。
表12:在植入小鼠的ER阳性乳腺癌异种移植肿瘤模型中的体内肿瘤生长抑制研究
肿瘤体积的分析基于Log 10和SpatialPower协方差结构。
*:与介质对照相比显著(p<0.05)。
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或高于基线肿瘤体积时，计算ΔT/C％。公式为100*(T-T0)/(C-C0)，其中T和C分别为治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是那些组中的平均基线肿瘤体积。
当终点体积低于基线时，计算消退％。该公式为100*(T-T0)/T0，其中T0是治疗组的平均基线肿瘤体积。
在第32天，使用从基线(随机化)的所有组的总平均值来计算T/C的％变化。
在植入小鼠的ESR1突变(Y537S)乳腺癌PDX肿瘤模型(ST941/HI)中的体内肿瘤生长抑制研究
下列异种移植物肿瘤抑制试验的目的是在ESR1突变和激素非依赖(HI)乳腺癌患者衍生的异种移植物(PDX)模型中测量响应测试化合物施用的肿瘤体积减小。
ST941/HIPDX模型来源于南德克萨斯加速研究疗法(San Antonio，TX)并在其处运行。从宿主动物中收获肿瘤碎片，并将其植入免疫缺陷小鼠(Jackson实验室)，在约125-250mm3的平均肿瘤体积开始研究。在适当的介质(1％羟乙基纤维素/0.25％ 80/0.05％消泡剂，在纯化水中)中制备测试化合物，实施例1B，并通过口服管饲法施用28天。通过在治疗过程期间每周进行两次的肿瘤体积测量来确定肿瘤应答。每当测量肿瘤体积时，将体重作为毒性的一般量度。
发现实施例1B的化合物具有下表13中提供的ΔT/C％值。这些结果表明实施例1B的化合物在小鼠中表现出良好的口服生物利用度，并且在ESR1突变(Y537S)人乳腺癌PDX模型中表现出显著的抗肿瘤活性或肿瘤消退。
表13:在小鼠中植入的ESR1突变乳腺癌PDX肿瘤模型中的体内肿瘤生长抑制研究
肿瘤体积的分析基于Log 10和SpatialPower协方差结构。
*:与介质对照相比显著(p<0.05)。
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或高于基线肿瘤体积时，计算ΔT/C％。公式为100*(T-T0)/(C-C0)，其中T和C分别为治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是那些组中的平均基线肿瘤体积。
当终点体积低于基线时，计算消退％。该公式是100*(T-T0)/(C-C0)，其中T0是治疗组的平均基线肿瘤体积。
在第32天，使用从基线(随机化)的所有组的总平均值来计算T/C的％变化。
组合研究
由于肿瘤异质性和对内分泌疗法的获得性抗性，就有效疗法而言或为了克服获得性抗性，组合疗法在ER阳性和晚期/转移性乳腺癌治疗中已变得必要。我们已经在体外测试了实施例1B与CDK4/6抑制剂abemiclib、mTOR抑制剂依维莫司、PIK3CA抑制剂阿培利司(alpelisib)和PI3K/mTOR抑制剂8-[5-(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶-3-基]-1-[(2S)-2-甲氧基丙基]-3-甲基-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(“化合物A”)在五种ER阳性乳腺癌细胞系中的组合作用。
用于组合研究的细胞活力测定
将下表14中所示密度的细胞在表中所述20μL体积的培养基中接种到透明底部384孔细胞培养板中。
表14:细胞活力测定细胞系信息
在37℃和5％ CO2下孵育板。第二天，将测试化合物-实施例1B，施用于细胞。
将化合物制备为10mM DMSO储备溶液并用于剂量响应研究，其中最高浓度以10或1μM开始，两种化合物以固定比率一起测试，然后制备1:3系列稀释液，以及用于IC50测定的单独化合物，起始浓度为20μM。加入来自系列稀释板的5μL至细胞板，来向细胞给药，产生0.2％的最终DMSO浓度，其中最终测试化合物浓度剂量范围对于单一处理为20至0.001μM或对于组合为更低的范围。对于最大点，使用含有0.2％ DMSO的培养基，对于最小点，使用在含有0.2％ DMSO的生长培养基中稀释至2μM终浓度的星孢素。在给予测试化合物后，在37℃和5％ CO2下孵育细胞板。与化合物一起孵育两个倍增时间后，从培养箱中取出板，并向每个孔中加入冷的EtOH 96％(65μL)。30分钟后，除去培养基，每孔加入RNase(20μL，50μg/mL)(Sigma)和1:1000碘化丙锭在PBS中的稀释液。密封板并在室温下孵育1小时(避光)。用ACUMEN EXPLORERTM[TTP LABTECH LTD制造的激光扫描荧光微量培养板细胞仪]扫描板。随着一些细胞系生长形成聚集体，作为实物数量的细胞数量可能不能用作读出值；因此将总面积群体(FL-1(PI)的峰强度的指定范围)或PI的总强度用于评估细胞数目。
体外组合数据表明，实施例1B与阿贝西利或依维莫司的组合在5个ER阳性乳腺癌细胞系中的5个中均具有协同作用(如下文所定义)，如表15A所示。实施例1B与化合物A的组合在所测试的4个ER阳性乳腺癌细胞系中的4个中均具有协同作用。实施例1B与阿培利司的组合作用在4个ER阳性乳腺癌细胞系中的2个中是加合的，在4个ER阳性乳腺癌细胞系中的2个中是协同的。
表15A:在ER阳性乳腺癌细胞系中实施例1B与其他靶向活性剂的体外组合
组合作用的数据分析和解释
使用文献中公开的方法来计算体外组合作用(L.Zhao等人,Front Biosci,2010,2:241-249和L.Zhao等人,Clin Cancer Res,2004,10(23):7994-8004)。为了鉴定两种药物之间的协同或拮抗相互作用，使用带有XLFit 5 add ins的定制的XL模板进行了曲线移位分析。使用4参数逻辑回归调整单一活性剂的曲线。用于拟合的标准和限制是(i)底部＜(-20)固定到0和(ii)顶部＞120固定到100。如果所有观察结果低于用户设置的阈值，则执行与hill＝0的恒定拟合，并且认为IC50高于最大包含浓度。一旦获得了每种单一活性剂的绝对IC50，则计算单一和组合在50％活性下的当量浓度(equivalent concentration)。使用这些当量浓度与测量的活性，我们重新计算绝对IC50，在eq浓度值等于1时，单一活性剂的曲线将达到50％活性，而协同组合在较低值时将达到50％，导致向左移动，并且拮抗组合将显示向右移动。还使用当量浓度计算CI50(50％活性下的组合指数)，其中CI50等于组合曲线的绝对IC50。与CI50一起，可以计算不同活性百分比的其它CI(组合指数)(CI10，CI20，CI30，CI40，CI60，CI70，CI80，CI90)。为了计算CInn，计算不同活性百分比下的当量浓度。对于每个活性百分数，我们计算误差界限，其是在95％的置信区间，并且使用该置信区间，我们将上限计算为CI加误差界限，并且将下限计算为CI减误差界限。上限＝CI+置信区间95％且下限＝CI-置信区间95％。然后使用这些限制来解释结果。
在每个活性百分比的统计解释如下：
下限<1和上限>1 加合
上限<1 协同
下限>1 拮抗
在每个活性百分比的生物学解释如下:
CInn<0.5 协同
CInn>0.5和CInn<2 加合
CInn>2 拮抗
体内组合研究
由于肿瘤异质性和对内分泌疗法的获得性抗性，就有效疗法而言或为了克服获得性抗性，组合疗法在ER阳性和晚期/转移性乳腺癌治疗中已变得必要。假设靶向治疗的组合在减缓或甚至停止ER阳性乳腺癌中具有更有效的潜力。CDK4/6抑制剂和氟维司群的组合已被批准用于治疗ER阳性转移性乳腺癌，但由于ESR1或PIK3CA中的获得性突变，高百分比的患者出现抗性。作为ERα的强效降解剂和拮抗剂，口服SERD例如实施例1B具有作为单一活性剂或与CDK4/6抑制剂例如阿贝西利或PI3K/mTOR抑制剂例如化合物A组合而更有效地减缓或停止ESR1突变或PIK3CA突变乳腺癌的潜力。在该上下文中，测试实施例1B的化合物与阿贝西利(专利参考)或化合物A(专利参考)的组合的肿瘤生长抑制。更具体地说，在ESR1野生型和PIK3Ca突变MCF7乳腺癌异种移植物模型中，将实施例1B的化合物与阿贝西利或化合物A组合进行测试。
在培养物中扩增人乳腺癌细胞MCF7(ATCC#HTB-22)，收获并在雌性NOD SCID小鼠(22-25g，Enviou RMS,Inc)的右后胁皮下注射1:1HBSS+MATRIGELTM溶液(200μL)中的5×10e6细胞。在细胞植入前二十四小时，皮下植入***丸剂(0.18mg/丸剂，17β***，90天释放，Innovative Research)。在植入后第七天开始每周两次测量肿瘤生长和体重。当肿瘤大小达到250-350mm3时，随机选择动物并分组，每组5只动物。在适当的介质(1％羟乙基纤维素/0.25％80/0.05％消泡剂，在纯化水中)中制备测试化合物实施例1B，并通过口服管饲法施用42天。在1％ HEC的25mM磷酸钠缓冲液、pH 2.0中配制CDK4/6抑制剂(阿贝西利)。在1％羟乙基纤维素/0.25％/>80/0.05％消泡剂的纯化水中配制PI3K/mTOR抑制剂(化合物A)。通过在治疗过程期间每周进行两次的肿瘤体积测量来确定肿瘤应答。每当测量肿瘤体积时，将体重作为毒性的一般量度。通过使用公式v＝l x w2 x 0.535估计肿瘤体积，其中l＝测量直径的较长者和W＝垂直直径的较短者。
统计分析
肿瘤体积数据的统计分析从数据转换为对数标度开始，以均衡时间和治疗组之间的差异。使用SAS软件(版本9.3)中的MIXED程序，通过双向重复测量分析随时间和处理的变化，来分析对数体积数据。用于重复测量的相关模型是空间幂(Spatial Power)。在每个时间点将治疗组与对照组进行比较。MIXED程序也单独用于每个治疗组，以计算每个时间点的调整平均值和标准误差。两种分析都解释了每只动物内的自相关和当具有大肿瘤的动物从研究早期移除时发生的数据损失。将每个处理组的调整平均值和标准误差对时间作图。肿瘤体积的分析基于log10和空间幂协方差结构。P值是基于两个特定组之间的比较。
组合分析方法(用于IVEF研究的Bliss独立性)
首先，将通常的重复测量模型拟合成对数体积与组和时间的关系。然后使用对比陈述(contrast statements)来测试在每个时间点使用组合的2种特定处理的相互作用效果。这等效于Bliss独立性方法，并且假设肿瘤体积在理论上可以达到零，即完全消退。组合的预期加合响应(EAR)在肿瘤体积标度上计算为：响应(EAR)EAR体积＝V1*V2/V0，其中V0、V1和V2分别是介质对照、单独处理1和单独处理2的估计平均肿瘤体积。如果相互作用试验是显著的，则根据观察到的组合平均体积分别小于或大于EAR体积，宣布组合作用在统计学上大于加合或小于加合。否则，统计结论是加合的。此外，可将加合性的生物学相关范围定义为高于和低于EAR体积的X％。通常，X为25-40％。如果观察到的组合平均体积低于、处于或高于加合性区间，则可以对该组合得出多于加合、加合或少于加合的生物学结论。
可能存在停滞是最佳预期响应的情况。在这些情况下，Bliss方法可以直接应用于％ΔT/C值以获得EAR百分比响应：EAR％ΔT/C＝Y1*Y2/100，其中Y1和Y2是单药剂处理的百分比ΔT/C值。目前，没有统计学检验来比较在组合组中观察到的％ΔT/C与EAR，但是可以应用上述生物学标准。
如表15B和16所示，用单独的实施例1B或阿贝西利作为单一活性剂进行治疗分别导致32％(％dT/C＝-32)和52％(％dT/C＝-52)肿瘤消退，并且与介质对照相比，两者都具有统计学显著性(p＜0.001)。实施例1B与阿贝西利的组合效果是“小于加合”，但是实施例1B加阿贝西利的组合效果显著优于实施例1B单独使用(p＜0.001)。然而，单一活性剂阿贝西利功效在组合中不具有统计学显著性(P＝0.055)。该组合在动物中耐受而没有显著的体重减轻。
表15B:实施例1B与阿贝西利在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
b差＝治疗1–治疗2；*p-值:显著(p<0.05)
SE–标准误差
表16:实施例1B与阿贝西利在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
肿瘤体积的分析基于Log10和空间幂协方差结构。
*p-值:显著(p<0.05)；NA:不适用
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或高于基线肿瘤体积时，计算ΔT/C％；并且对于低于基线的肿瘤体积计算消退％。公式为100*(T-T0)/(C-C0)，其中T和C分别为治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是那些组中的平均基线肿瘤体积。
如表17和18所示，用实施例1B或化合物A作为单一活性剂单独处理分别导致32％(％dT/C＝-32)和36％(％dT/C＝-36)肿瘤消退，并且与介质对照相比两者都具有统计学显著性(p＜0.001)。实施例1B与化合物A的组合效力“小于加合”，但实施例1B加上化合物A的组合效果显著优于单独的实施例1B(p＜0.001)或单独的化合物A(p＝0.002*)。该组合在动物中耐受而没有显著的体重减轻。
表17:实施例1B与化合物A在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
b差＝治疗1–治疗2；*p-值:显著(p<0.05)
SE–标准误差
表18:实施例1B与阿贝西利在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
肿瘤体积的分析基于Log10和空间幂协方差结构。
*p-值:显著(p<0.05)；NA:不适用
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或高于基线肿瘤体积时，计算ΔT/C％；并且对于低于基线的肿瘤体积计算消退％。公式为100*(T-T0)/(C-C0)，其中T和C分别为治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是那些组中的平均基线肿瘤体积。
如表19和20所示，用单独的实施例10或阿贝西利作为单一活性剂进行的治疗分别导致51％(％dT/C＝-51)和70％(％dT/C＝-70)的肿瘤消退，并且与介质对照相比，两者都具有统计学显著性(p＜0.001)。实施例10与阿贝西利的组合功效是“小于加合”，但是实施例10加上阿贝西利的组合功效显著优于单独的实施例10(p＝0.039)。然而，实施例10加阿贝西利的组合功效与单独的阿贝西利没有显著差异(p＝0.905)。该组合在动物中耐受而没有显著的体重减轻。
表19:实施例10与阿贝西利在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
b差＝治疗1–治疗2；*p-值:显著(p<0.05)
SE–标准误差
表20:实施例10与阿贝西利在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
/>
肿瘤体积的分析基于Log10和空间幂协方差结构。
*p-值:显著(p<0.05)；NA:不适用
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或高于基线肿瘤体积时，计算ΔT/C％；并且对于低于基线的肿瘤体积计算消退％。公式为100*(T-T0)/(C-C0)，其中T和C分别为治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是那些组中的平均基线肿瘤体积。
如表21和22所示，用实施例10或阿培利司单独作为单一活性剂处理分别导致51％(％dT/C＝-51)和21％(％dT/C＝-21)肿瘤消退，并且与介质对照相比两者都具有统计学显著性(p＜0.001和p＝0.013)。实施例10与阿培利司的组合功效是“加合的”，并且实施例10加阿培利司的组合功效显著优于单独的实施例10(p＝0.009)。实施例10加阿培利司的组合功效也显著优于单独的阿培利司(p＝<0.001)。该组合在动物中耐受而没有显著的体重减轻。
表21:实施例10与阿培利司在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
b差＝治疗1–治疗2；*p-值:显著(p<0.05)
SE–标准误差
表22:实施例10与阿培利司在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
肿瘤体积的分析基于Log10和空间幂协方差结构。
*p-值:显著(p<0.05)；NA:不可适用
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或高于基线肿瘤体积时，计算ΔT/C％；并且对于低于基线的肿瘤体积计算消退％。公式为100*(T-T0)/(C-C0)，其中T和C分别为治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是那些组中的平均基线肿瘤体积。
如表23和24所示，用实施例10或依维莫司作为单一活性剂单独治疗分别导致51％(％dT/C＝-51)和50％(％dT/C＝-50)肿瘤消退，并且与介质对照相比两者都具有统计学显著性(p＜0.001和p＜0.001)。实施例10与依维莫司的组合功效是“加合的”，且实施例10加依维莫司的组合功效显著优于单独的实施例10(p＝0.004)。实施例10加阿培利司的组合功效也显著优于单独的依维莫司(p＝0.04)。该组合在动物中耐受而没有显著的体重减轻。
表23:实施例10与依维莫司在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
b差＝治疗1–治疗2；*p-值:显著(p<0.05)
SE–标准误差
表24:实施例10与依维莫司在MCF7 ER阳性乳腺癌模型中的组合功效
肿瘤体积的分析基于Log10和空间幂协方差结构。
*p-值:显著(p<0.05)；NA:不适用
当治疗组中的终点肿瘤体积等于或高于基线肿瘤体积时，计算ΔT/C％；并且对于低于基线的肿瘤体积计算消退％。公式为100*(T-T0)/(C-C0)，其中T和C分别为治疗组或对照组中的平均终点肿瘤体积。T0和C0是那些组中的平均基线肿瘤体积。
大鼠口服生物利用度测定
以下测定的目的是证明测试化合物是否是口服生物可利用的。
将测试化合物以1mg/kg(使用介质：20％ 在25mM磷酸钠缓冲液中，pH2适量；或者25％ DMA，15％ EtOH，10％丙二醇，25％2-吡咯烷酮，和25％纯化水)IV施用于Sprague-Dawley大鼠，并以10mg/kg(使用介质：1％羟乙基纤维素，0.25％聚山梨酯80，0.05％消泡剂1510-US，和纯化水适量)PO施用。在静脉推注施用后0.08、0.25、0.5、1、2、4、8和12小时以及口服施用后0.25、0.5、1、2、4、8和12小时收集系列血样。用EDTA抗凝剂处理后，离心获得血浆并在-70℃保存直到LC-MS/MS分析。测定血浆中的测试化合物浓度，并上载到Watson LIMSTM***中，其中使用非房室分析来计算IV和PO臂的曲线下面积(AUC)。通过以下等式计算口服生物利用度(％F)，
％F＝(AUCPO X剂量IV)/(AUCIV X剂量PO)X 100。
实施例1B的化合物在上述试验中显示～50％的％F值。该试验证明实施例1B具有优良的口服生物利用度。

Claims (25)

1.用于治疗癌症的组合，所述组合是包含式I化合物或其药学上可接受的盐的治疗剂与第二治疗剂的组合，所述第二治疗剂选自选择性***受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、CDK4抑制剂、CDK6抑制剂、PI3K抑制剂、和mTOR抑制剂，
其中R1或R2中一个独立地选自Cl、F、-CF3或-CH3，且另一个为氢。
2.根据权利要求1的组合，其中所述化合物具有式II的结构：
3.根据权利要求1的组合，其中所述化合物具有式III的结构：
4.根据权利要求1的组合，其中所述化合物是
5.根据权利要求2的组合，其中所述化合物是
6.根据权利要求3的组合，其中所述化合物是
7.根据权利要求1-6中任一项的组合，其中所述药学上可接受的盐是苯磺酸盐或4-甲基苯磺酸盐。
8.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是SERM。
9.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是芳香酶抑制剂。
10.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是CDK4抑制剂。
11.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是CDK6抑制剂。
12.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是阿贝西利。
13.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是依维莫司。
14.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是阿培利司。
15.根据权利要求1-7中任一项的组合，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌和肺癌。
16.根据权利要求15的组合，其中所述乳腺癌是ER阳性乳腺癌。
17.根据权利要求15的组合，其中所述胃癌是ER-阳性胃癌。
18.根据权利要求15的组合，其中所述肺癌是ER-阳性肺癌。
19.根据权利要求15的组合，其中所述第二治疗剂是阿贝西利、依维莫司或阿培利司。
20.用于治疗癌症的组合，所述组合是包含下式化合物或其药学上可接受的盐的治疗剂与第二治疗剂的组合，所述第二治疗剂选自选择性***受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、CDK4抑制剂、CDK6抑制剂、PI3K抑制剂、和mTOR抑制剂，
21.根据权利要求20的组合，其中所述化合物是
22.根据权利要求20的组合，其中所述化合物是
23.根据权利要求20-22中任一项的组合，其中所述第二治疗剂是阿贝西利、依维莫司或阿培利司，且其中所述药学上可接受的盐选自苯磺酸盐或4-甲基苯磺酸盐。
24.根据权利要求23的组合，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、子宫癌、胃癌和肺癌。
25.根据权利要求24的组合，其中所述乳腺癌是ER阳性乳腺癌，所述胃癌是ER-阳性胃癌，和/或所述肺癌是ER-阳性肺癌。
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