CN1173690C - 溶葡萄球菌复合酶漱口水及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种溶葡萄球菌复合酶漱口水制剂，该制剂是以溶葡萄球菌复合酶与药用辅料组成的。能有效治疗葡萄球菌、溶血性链球菌、白色念株菌、厌氧菌等细菌引起的口腔疾病，无毒副作用，不产生抗药性，稳定性好，可广泛用于临床。
Description
本发明涉及生物制剂，具体涉及一种溶葡萄球菌复合酶漱口水(高科复合溶菌酶漱口水)及制备方法。
口腔是人肌体与外界接触的一道重要屏障，是呼吸***、消化***的一个组成部分，同时也是最易受到侵害的部分，包括空气污染、细菌等的侵害。随着空气污染的加剧，环境的恶化，口腔疾病的发生率大大提高了。
口腔中存在为数众多的致病菌，其中占主要比例的包括：葡萄球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌、厌氧菌等细菌。它们不但是口腔疾病的根源，而且还影响营养的正常摄入甚至会引起诸如呼吸道，胃肠等器官的疾病，因此预防和杀灭口腔致病菌，对维护人体口腔健康，降低其它器官的发病率十分关键。
长期以来，对口腔疾病的治疗一直采用化学、抗生素类药物，尽管当时起到一定的作用，但随着这些药物的反复使用，带来了一系列的不利影响——产生了许多抗药性菌株，给肌体带来了毒副作用。现在耐药性菌株在致病菌中所占的比例有逐年上升之势。
抗生素是在细菌生长代谢的过程中起作用，只能起到抑制细菌生长的目的，而不能将其全部杀死，一部分存活下来的细菌就会带有此种抗生素的抗性。
传统的口腔清洁剂主要含有四种成分：乙醇、湿润剂、表面活性剂和香精。为了防止口臭，多数喷雾剂配入抑菌剂，其主要为甲硝脞、洗必泰和一些中药如双黄连等。虽然加入抑菌剂能达到较好的抑菌效果，但由于化学药品很易产生耐药菌，对口腔粘膜也有刺激，如甲硝脞对胃刺激很大，不易被人接受。
在口腔感染疾病的治疗中，现阶段仍以化学和抗生素类药物为主。例如，老年人口腔念珠菌病主要用制霉菌素和西地碘，急性冠周炎用甲硝脞，口腔扁平苔藓用甲硝脞及四环素等来治疗，这些药物都有毒副作用，而且还会产生抗药性菌株。目前还没有一种真正有效的全生物制剂，既能有效杀菌又无任何毒副作用，而且还不易产生抗药性。
本发明的目的在于克服上述不足之处，设计一种安全有效的生物制剂型漱口水。
本发明提供了一种溶葡萄球菌复合酶(高科复合溶菌酶漱口水)，它是由溶葡萄球菌酶、溶菌酶与药用辅料组成的，其中主要成分为溶葡萄球菌酶0.003～0.007％、溶菌酶5～15％，药用辅料为山梨醇5～8％、磷酸钾7～10％、氯化钠0.5～1％、香精0.1％、蒸馏水65～82％。
溶葡萄球菌复合酶漱口水中的一种成分溶葡萄球菌酶是一种革兰氏阳性菌的溶菌素，组成该类革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖的四肽侧链的氨基酸，依次为L-丙氨酸，D-谷氨酸，L-赖氨酸，D-丙氨酸；而首位的L-丙氨酸通过一个酰胺键与胞壁酸相连，该聚糖链四肽侧链第3位的L-赖氨酸，通过五肽(五个甘氨酸)交联桥联结到相邻聚糖链四肽侧链D-丙氨酸羧基上。由此纵横交叉，左右联结构成十分坚韧的三维立体多孔结构，并聚合成较厚的肽聚糖层。溶葡萄球菌酶可切断肽聚糖中的Gly-Gly键，而溶葡萄球菌复合酶漱口水中另一种溶菌酶可切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的键，从而使杀菌活性更强，达到溶解并杀死细菌的目的，并可避免细菌耐药性的产生。
由于溶葡萄球菌复合酶独特的杀菌机理，使其不同于一般抗生素，常用抗生素是抑制细菌生长，而该酶则是裂解细菌杀死细菌。上海市华山医院抗生素研究所、第二军医大学长海医院检验科、上海市第六人民医院检验科、上海市第九人民医院检验科等单位曾将临床各科收集到的400多株细菌进行了溶葡萄球菌复合酶的抑杀菌实验。实验结果表明：溶葡萄球菌复合酶对革兰氏阳性菌，如临床上常见的金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、D群肠球菌、四联球菌、产单核李斯特菌、链球菌以及胃幽门螺旋杆菌等均有明显的抑杀作用。
实验还证明溶葡萄球菌复合酶对耐药性菌株，如目前医学临床上最感棘手的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐药性肺炎双球菌、嗜麦芽窄食单孢菌的效果更优于常用抗生素。疾病控制中心对引起口腔炎症细菌如链球菌和卟啉菌进行抑菌试验，杀菌率可达99.9％。
本发明的溶葡萄球菌复合酶漱口水产品，经上海市疾病预防控制中心进行安全性毒理学评价结果如下：
一、急性毒性(经口LD50)试验：
目的：样品通过一次经口接触所能引起的健康危害及求出半数致死剂量，为急性毒性分类、分级提供依据(为亚慢性试验和其它试验确定剂量提供参考)。
1、样品性状：透明液体，溶于水。
2、样品处理及配制：取样品5000mg加蒸馏水至20ml，供试。
3、实验动物：昆明种小鼠，体重18-22克，由上海医科大学实验动物部提供(合格证号：02-22-1)。
4、实验方法：按《消毒技术规范(***1991)》测试。
4.1试验前，实验动物禁食16小时。
4.2将动物随机分组，雌雄各一组，每组10只，称重，按0.4ml/20g体重，采用灌胃法进行一次给样。
4.3观察给样后两周内，实验动物的中毒表现及死亡情况。
4.4计算LD50及95％可信区间。
5、结果：
表 雌雄小鼠急性毒性经口毒性试验结果
动物性别 剂量 动物数 死亡数 LD50及95％
(mg/kg) (只) (只) 可信限(mg/kg)
雌性小鼠 5000 10 0 ＞5000
雄性小鼠 5000 10 0 ＞5000
6、结论：雌性小鼠：LD50＞5000mg/kg
雄性小鼠：LD50＞5000mg/kg
二、微核试验：
1、样品性状：透明液体，溶于水。
2、样品的处理及配制：取样品2500、1000、500、250mg分别加蒸馏水至20ml，配成浓度为125、50、25、12.5mg/ml的溶液，供试。
3、实验动物：
3.1来源：上海医科大学实验动物部(合格证号：02-22-1)
3.2种属与品系：昆明小鼠
3.3性别：雌、雄
3.4体重：25-30克
4、实验方法：
4.1将动物随机分为6组，每组8只，雌雄各半，分别作为样品四个剂量组及阴性对照和阳性对照组。
4.2采用30小时两次灌胃法，动物称重，将配制的不同浓度样品按0.4ml/20g体重，分别对各组动物灌胃。
4.3于第二次灌胃后6小时，颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓加小牛血清混匀，常规涂片、固定Giemsa染色制片。
4.4镜检观察，每鼠计数1000个嗜多染红细胞的微核发生率，并进行统计分析。
5、结果：
表 动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率
剂量 性别 动物数 受检细胞数 微核细胞数 微核率 统计学
(mg/kg) (只) (个) (个) (‰) 检验*
2500 雄性 4 4000 6 1.5 ＞0.5
2500 雌性 4 4000 5 1.2 ＞0.5
1000 雄性 4 4000 4 1.0 ＞0.5
1000 雌性 4 4000 5 1.2 ＞0.5
500 雄性 4 4000 6 1.5 ＞0.5
500 雌性 4 4000 7 1.8 ＞0.5
250 雄性 4 4000 5 1.2 ＞0.5
250 雌性 4 4000 6 1.5 ＞0.5
阴性对照 雄性 4 4000 7 1.8
(蒸馏水2000mg/kg) 雌性 4 4000 8 2.0
阳性对照 雄性 4 4000 77 19.2 0.01
(环磷酰胺40mg/kg) 雌性 4 4000 78 19.5 0.01
阴阳性对照相比(经卡方检验)
结论：经统计学分析，样品骨髓嗜多染红细胞微核试验， 是为阴性。
三、粘膜刺激试验：
1、目的：通过眼刺激试验：来提示当眼一旦接触该样品后可能出现的危害情况。
2、样品性状：透明液体，溶于水。
3、样品处理：样品直接测试。
4、实验动物：新西兰种家兔，4只，体重2-3kg，雌雄各半，由上海医科大学实验动物部提供。合格证号：02-52-1。
5、实验方法：
5.1将实验动物一侧眼睑轻轻拉开，将0.1ml(g)受试物滴入(或放入)结膜囊中将上下眼睑闭合数秒，另一侧眼用生理盐水作对照。
5.2滴眼后24h进行冲洗(刺激性强者，可在滴眼后30s冲洗)。
5.3分别于滴眼后6、24、48h和72h、4d、7d，对实验动物眼睛进行检查，按消毒技术规范(***1991)进行粘膜刺激强度评价。
6、结果：试验动物粘膜刺激反应未见结膜刺激强度评价。
动 部位 粘膜刺激反应积分
物 6h 24h 48h 72h 4d 7d
编 样 对 样 对 样 对 样 对 样 对 样 对
号
1 结膜 0 0 0 0 0 0 0 0
虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0
角膜 0 0 0 0 0 0 0 0
总分 0 0 0 0 0 0 0 0
2 结膜 0 0 0 0 0 0 0 0
虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0
角膜 0 0 0 0 0 0 0 0
总分 0 0 0 0 0 0 0 0
3 结膜 0 0 0 0 0 0 0 0
虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0
角膜 0 0 0 0 0 0 0 0
总分 0 0 0 0 0 0 0 0
4 结膜 0 0 0 0 0 0 0 0
虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0
角膜 0 0 0 0 0 0 0 0
总分 0 0 0 0 0 0 0 0
总积分 0 0 0 0 0 0 0 0
平均刺 0 0 0 0 0 0 0 0
激指数
粘膜刺激 0 0 0 0 0 0 0 0
分指数(I.A.0.1)
18h后刺激 0 0 0 0 0 0 0 0
平均指数( )
7、结论：本品粘膜刺激积分指数为0粘膜刺激平均指数48h后为是无刺激性。
本发明的溶葡萄球菌复合酶漱口水产品，经上海市疾病预防控制中心进行抑菌作用检验结果如下：
一、结果：
1、对大肠杆菌(8099)的抑菌作用：
浓度 不同作用时间(min)抑菌率％
(％) 1 2 3 5
100 100 100 100 100
50 99.98 100 100 100
注：对照菌数为5.5×104cfu/ml。
2、对金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的抑菌作用：
浓度 不同作用时间(min)抑菌率％
(％) 1 2 3 5
100 100 100 100 100
50 99.98 100 100 100
注：对照菌数为7.1×104cfu/ml。
3、对白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌作用：
浓度 不同作用时间(min)抑菌率％
(％) 1 2 3 5
100 99.99 100 100 100
50 99.97 99.99 100 100
注：对照菌数为9.2×104cfu/ml。
4、对溶血性链球菌(32210)的抑菌作用：
浓度 不同作用时间(min)抑菌率％
(％) 1 2 3 5
100 100 100 100 100
50 99.99 100 100 100
注：对照菌数为9.5×104cfu/ml。
5、对厌氧菌(牙龈卟啉菌)的抑菌作用：
浓度 不同作用时间(min)抑菌率％
(％) 1 2 3 5
100 100 100 100 100
50 99.97 100 100 100
注：对照菌数为8.5×104cfu/ml。
6、现场试验：
选10名志愿者，在口腔上下牙齿用灭菌棉拭涂擦二次，将此棉拭放入10ml蛋白胨PBS，摇匀后取1ml放入灭菌平皿培养计数作为对照样本(本底)。试验时向口腔喷雾溶葡萄球菌复合酶口腔清洁液1分钟，用灭菌棉拭按上法采样培养计数。另外将产品稀释成50％浓度50ml漱口1分钟，按前法采样培养计数。并做溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、厌氧菌培养。在试验过程中，志愿者未出现头晕、呕吐、腹泻、过敏等不良反应。
(1)喷雾法的杀菌作用
喷雾法杀菌率(％) 口腔牙齿细菌菌落数(cfu/ml)
92.82 1.4×105
(2)漱口法杀菌作用
漱口法杀菌率(％) 口腔牙齿细菌菌落数(cfu/ml)
91.47 1.4×105
注：喷雾法、漱口法均未检出溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、厌氧菌。
7、细菌学检测
检测指标 结果 标准值
细菌菌落总数(CFU/g) ＜10 ＜20
大肠菌群 未检出 不得检出
金黄色葡萄球菌 未检出 不得检出
绿脓杆菌 未检出 不得检出
溶血性链球菌 未检出 不得检出
真菌 未检出 不得检出
二、评价：
本品50％浓度作用1分钟对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、溶血性链球菌、厌氧菌均有较强的抑菌作用；经现场志愿者试验，对口腔喷雾、漱口，抑菌率分别为92.82％和91.47％。试验后未检出溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、厌氧菌。经细菌学检测，符合GB15979-1995。
通过在多家医院口腔科对牙周病、口腔粘膜溃疡等口腔疾病的治疗发现，溶葡萄球菌复合酶对口腔和牙龈急性炎症，有良好的治疗作用。一般复发性口疮的疼痛症状，多数在2-3天内消失。牙周病患者的急性充血、肿胀等症状在第一疗程后也能消失，临床还观察到，本品对复发性口疮，能明显地延长缓解期，减少复发次数。因此，溶葡萄球菌复合酶是理想的治疗口腔炎症疾患的药物及口腔卫生用品。
山西医科大学第二附属医院口腔科用溶葡萄球菌复合酶漱口水共治疗316例口腔炎性疾患病例，其中包括口腔溃疡90例，牙周炎79例，齿槽脓肿81例，舌炎21例，咽炎45例，有效297例，临床总有效率达到93％。
上海市口腔病防治院对溶葡萄球菌复合酶漱口水治疗冠周炎进行了研究发现，三天后本品对冠周炎的有效率为83.3％，三天后继续用药的21例病人均在治疗后5-10天治愈。而对照组无一例完全治愈。
上海第二医科大学口腔医学院和上海市口腔医学研究所对溶葡萄球菌复合酶漱口水预防牙龈炎的临床试验表明，本品可显著降低牙龈炎患者的菌斑指数、牙龈指数和龈沟出血指数，试验前后这三个指数有差异，本品可显著改善牙龈炎患者的临床症状。
本发明的另一目的是提供了上述溶葡萄球菌复合酶漱口水的制备方法，该方法是在无菌室中，将溶葡萄球菌酶(从美国Sigma公司购买)，溶菌酶，山梨醇，磷酸钾，氯化钠，按比例依次加入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，轻轻搅拌，充分混和均匀后，再加入所示比例的香精和蒸馏水，充分混匀，灌装于塑料瓶或金属瓶中，入库，室温保存即可。
本发明的产品具有以下特点：
1、它能迅速而有效地杀灭引起口腔感染的葡萄球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌、厌氧菌等细菌。
2、不易产生抗药性，对口腔粘膜无刺激和其他副作用。
3、稳定性好。
由于以上优点，本发明产品可在临床广泛使用。
实例 每制造100克溶葡萄球菌复合酶漱口水的配制方法。
1、先分别将溶葡萄球菌酶0.0032克，溶菌酶15克，山梨醇7克，磷酸钾9克，氯化钠0.8克混匀，再加入薄荷香精0.1克和蒸馏水65.6ml，混匀灌装。该配方对金黄色葡萄球菌杀菌率99.9％
2、先分别将溶葡萄球菌酶0.004克，溶菌酶7克，山梨醇7克，磷酸钾10克，氯化钠1克混匀，再加入柠檬香精0.1克和蒸馏水71.9ml，混匀灌装。该配方对金黄色葡萄球菌杀菌率99.5％
3、先分别将溶葡萄球菌酶0.005克，溶菌酶10克，山梨醇6克，磷酸钾7克，氯化钠0.5克混匀，再加入芒果香精0.05克和蒸馏水73.45ml，混匀灌装。该配方对金黄色葡萄球菌杀菌率99.3％。
Claims (2)
1、一种溶葡萄球菌复合酶漱口水制剂，其特征在于该制剂是由溶葡萄球菌复合酶与药用辅料组成的，其中成分为溶葡萄球菌酶0.003～0.007％、溶菌酶5～15％、药用辅料为山梨醇5～8％、磷酸钾7～10％、氯化钠0.5～1％、香精0.1％、蒸馏水65～82％。
2、一种如权利要求1所述的一种溶葡萄球菌复合酶漱口制剂的制备方法，其特征在于该方法是在无菌室中，将溶葡萄球菌酶，溶菌酶，山梨醇，磷酸钾，氯化钠，按比例依次加入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，轻轻搅拌，充分混和均匀后，再加入所示比例的香精和蒸馏水，充分混匀，灌装于塑料瓶或金属瓶中，入库，室温保存即可。
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