CN117368380A - 一种类固醇激素的检测试剂盒以及检测方法 - Google Patents
一种类固醇激素的检测试剂盒以及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种类固醇激素的检测试剂盒以及检测方法,属于物质检测技术领域。本申请的类固醇激素的检测试剂盒包括磁固相萃取填料、活化液、平衡液、淋洗液和洗脱液;磁固相萃取填料包括亲水亲脂磁性微球;亲水亲脂磁性微球包括聚二乙烯基苯磁性微球骨架和吡咯烷酮基团,吡咯烷酮基团接枝或键合在聚二乙烯基苯磁性微球骨架。检测试剂盒采用亲水亲脂磁性微球作为磁固相萃取填料,亲水亲脂磁性微球通过亲水基团和亲脂基团促进与类固醇激素的结合,配合淋洗液和洗脱液对其进行净化除杂,保证后续测定的准确性和可靠性。检测的前处理流程工艺简单,花费时间少,有利于类固醇激素的快速准确检测。
Description
技术领域
本申请涉及一种类固醇激素的检测试剂盒以及检测方法,属于物质检测技术领域。
背景技术
类固醇激素又称为甾类激素,是一类四环脂肪烃化合物,具有环戊烷多氢菲母核。类固醇激素可以分为两类,皮质类固醇和性类固醇。在这两个类别中,根据它们结合的受体分为五种类型:糖皮质激素和盐皮质激素(均为皮质类固醇),以及雄激素、***和孕激素(均为性类固醇)。
类固醇激素在人体的多种生命活动中发挥着重要生理功能,是内分泌细胞分泌的高效能生物化学物质,在维持生命、调节机体物质代谢、促进性器官发育和维持生育等方面起着重要的调节作用。同时类固醇激素具有极重要的医药价值,在维持生命、调节性功能、机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用。目前与类固醇激素相关的疾病有儿童性早熟、多囊卵巢综合症、库欣综合证、先天性肾上腺皮质增生症等。类固醇激素水平可作为儿童性早熟等多种疾病诊断标准的重要指标,对儿童的类固醇激素水平进行检测具有重要的临床和研究价值。
目前类固醇激素的检测具有以下方法:
(1)免疫学方法:基于检测抗体与类固醇激素抗原的结合反应进行检测,免疫学方法具有自动化操作、检测快速、成本低的优势,是目前临床实验常用的检测方法,但是其容易出现交叉反应和假阳性等问题,而且一次实验只能检测一种类固醇激素。此外,免疫学方法对水平较低的类固醇激素的低值检测很不稳定,具有检测准确度差的问题,像脱氢表雄酮这种在儿童血液样本中含量很低的标志物,免疫学方法很难检出。
(2)气相色谱质谱法(GC-MS):用于类固醇激素的定量检测的特异性好,并且可实现多种类固醇激素的同时检测,但对于样品的前处理过程要求比较苛刻,如提取、纯化和衍生步骤,整个前处理过程非常繁琐,在临床上开展的难度较大。
(3)液质联用技术(LC-MS/MS):对类固醇激素的检测逐渐成为目前医学检测实验室的重要选择,其具备了灵敏度高、杂质干扰少、可直接检测和特异性高等优势。并且质谱方法可以在短时间内同时检测多种类固醇激素,相较于传统免疫学方法每次只能检测一种类固醇激素而言,在疾病诊断时候具有更高的临床应用价值。但是液质联用技术在临床应用中仍然受到诸多限制,其中最主要的问题是前处理过程复杂,常需要多步骤固相萃取(SPE)过程。现有技术提出了采用自动化酶联免疫法进行样品前处理,通过机械臂的转移实现一站式完成SPE加样和移样过程,但是该过程速度较慢,且需要多次进行离心、正压等步骤吸附或脱附样品,自动化程度较低。而采用人工手动操作完成SPE的加样和取样步骤,对临床操作人员技能要求较高,并且容易出现人为失误。
因此,现有技术中对类固醇激素的检测方法存在前处理过程复杂繁琐,花费时间长,容易出现误差问题导致检测结果准确度差。此外儿童类固醇激素种类和分泌水平和成人有所不同,不同激素的分泌水平会随着年龄的增长发生变化,从而影响儿童的生长发育和免疫功能。因此需要一种类固醇激素的检测方法,实现针对儿童类固醇激素水平进行准确检测,以促进对儿童类固醇激素相关疾病的诊断和研究。
发明内容
本申请的目的在于提供一种类固醇激素的检测试剂盒以及检测方法,可以同时检测多种类固醇激素,通过磁固相萃取填料与待测样品中的类固醇激素结合,结合磁吸附转移技术实现类固醇激素的富集纯化,极大简化了液质联用检测前处理的操作流程,具有操作简便、提取效率高、检测准确度和精密度高的优点。
第一方面,本申请提供了一种类固醇激素的检测试剂盒,检测试剂盒包括磁固相萃取填料、活化液、平衡液、淋洗液和洗脱液;磁固相萃取填料包括亲水亲脂磁性微球;亲水亲脂磁性微球包括聚二乙烯基苯磁性微球骨架和吡咯烷酮基团,所述吡咯烷酮基团接枝或键合在所述聚二乙烯基苯磁性微球骨架上;所述亲水亲脂磁性微球中,所述吡咯烷酮基团和所述聚二乙烯基苯磁性微球骨架的摩尔比例为(3~9):(4~8)。本申请的检测试剂盒采用亲水亲脂磁性微球作为磁固相萃取填料,通过控制亲水亲脂磁性微球中亲水基团(吡咯烷酮基团)和亲脂基团(聚二乙烯基苯磁性微球骨架中含有的苯基和乙烯基键合后形成的碳链)的比例,与多种类固醇激素中的极性和非极性基团配合,促进亲水亲脂磁性微球与类固醇激素的紧密结合,配合磁吸附技术对类固醇激素进行萃取富集。萃取类固醇激素后可以配合淋洗液和洗脱液对其进行净化除杂,保证后续测定的准确性和可靠性。检测的前处理流程工艺简单,花费时间少,可以配合磁固相萃取自动化处理***,从而有利于类固醇激素的快速准确检测,提升类固醇激素的检测效率和检测结果的准确性和稳定性,有利于对以类固醇激素为标志物的相关疾病的诊断和预后评估等应用。
吡咯烷酮基团可以接枝或键合在聚二乙烯基苯磁性微球骨架上,接枝或键合后吡咯烷酮基团均以功能性基团的形式结合在聚二乙烯基苯磁性微球骨架上。本申请中接枝是指在制备得到聚二乙烯基苯磁性微球骨架后,将吡咯烷酮基团活化后与聚二乙烯基苯磁性微球骨架通过化学反应进行结合;键合是指在聚二乙烯基苯磁性微球骨架的制备过程中,将吡咯烷酮基团加入含聚合单体的反应体系中共同反应生成亲水亲脂磁性微球。
进一步地,亲水亲脂磁性微球中,吡咯烷酮基团和聚二乙烯基苯磁性微球骨架的摩尔比例为(3~6):(7~8)。本申请通过进一步控制亲水基团和亲脂基团的比例,能够使亲水亲脂磁性微球与血液样品中的九种类固醇激素均表现出优异的结合效果,并且亲水亲脂基团在此比例下与目标类固醇激素的结合特异性更高,减少对非目标杂质的萃取,提高萃取效率和准确性,满足临床上对九种类固醇激素检测的需求。
优选地,聚二乙烯基苯磁性微球骨架通过包括以下步骤的制备方法得到:将二乙烯基苯在含有引发剂、致孔剂和聚乙二醇修饰的磁性粒子的反应体系中,进行交联聚合反应,即得聚二乙烯基苯磁性微球骨架。本申请在聚二乙烯基苯基体的交联聚合反应过程中引入磁性粒子,使聚二乙烯基苯磁性微球能够兼顾良好的磁性和聚二乙烯基苯的结合吸附性能,能够适用于酸性、碱性和/或中性化合物的萃取和净化。
优选地,引发剂包括偶氮二异丁腈和/或过氧化苯甲酰;致孔剂可选自甲苯、液体石蜡、邻苯二甲酸二丁酯中的至少一种;本申请中交联聚合反应的反应体系为乙醇水溶液体系。
优选地,磁性粒子包括铁粒子、钴粒子、镍粒子、四氧化三铁粒子中的至少一种。
本申请中聚乙二醇修饰的四氧化三铁粒子采用包括以下步骤的制备方法得到:将亚铁盐、铁盐、还原剂和聚乙二醇混合后,加入沉淀剂进行共沉淀处理,即得聚乙二醇修饰的四氧化三铁粒子。
优选地,交联聚合反应的条件包括:交联聚合反应的温度为40~90℃;交联聚合反应的时间为8~32h。本申请通过控制苯乙烯和二乙烯基苯反应物的比例及反应条件,控制聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球表面苯环和交联碳链的数量,进而控制亲水亲脂磁性微球的极性,使其更好地结合类固醇激素,减少与非目标物质的结合,提高磁固相萃取的萃取效果。
可选地,亲水亲脂磁性微球通过包括以下步骤的制备方法得到:将聚二乙烯基苯磁性微球骨架进行氯甲基化处理,然后加入吡咯烷酮进行修饰,即得亲水亲脂磁性微球。该亲水亲脂磁性微球包括聚二乙烯基苯磁性微球骨架和表面接枝的吡咯烷酮基团。
优选地,亲水亲脂磁性微球的平均粒径为1~50 um。本申请的亲水亲脂磁性微球的平均粒径在1~50 um范围内,采用平均粒径为1~5 um的小颗粒亲水亲脂磁性微球和平均粒径为30~50 um的大颗粒亲水亲脂磁性微球均能实现与类固醇激素较好的结合。
优选地,淋洗液包括第一淋洗液和第二淋洗液;第一淋洗液包括醇类化合物和水,第一淋洗液中醇类化合物和水的体积比例为(10~20):(50~100);和/或,第二淋洗液包括醇类化合物和脂肪烃类化合物,第二淋洗液中醇类化合物与脂肪烃类化合物的体积比例为(20~50):(30~60)。本申请通过第一淋洗液去除磁固相萃取填料在类固醇激素萃取步骤中,共萃取到的极性相对于类固醇激素较强的一部分杂质;通过第二淋洗液去除磁固相萃取填料在类固醇激素萃取步骤中,共萃取到的非极性相对于类固醇激素更强的一部分杂质。通过两步淋洗配合进行净化除杂,能够最大限度地除去共萃取到的杂质,使最终得到的类固醇激素待测样品更干净,减少杂质在后续检测中带来的干扰,提高检测结果的准确性。
优选地,醇类化合物选自C1~6的醇类化合物中的至少一种,例如甲醇、乙醇、异丙醇和乙二醇等。
优选地,脂肪烃类化合物选自C5~15的脂肪烃类化合物中的至少一种,本申请中脂肪烃类化合物包括烷烃和/或烯烃。
进一步地,脂肪烃类化合物选自C6~10的烷烃类化合物中的至少一种,例如正己烷、正庚烷等。
优选地,活化液包括醇类化合物和水,活化液中醇类化合物和水的体积比例为(50~80):(5~50)。本申请在萃取待测样品中的类固醇激素之前,采用活化液对磁固相萃取填料进行活化,通过醇类化合物和水的混合液可以浸润磁固相萃取填料本身,清洗填料中可能存在的微量杂质,同时还可以起到让磁固相萃取填料具备更好的吸附效果的作用。
优选地,平衡液包括醇类化合物和水,平衡液中醇类化合物和水的体积比例为(20~80):(60~100)。本申请将磁固相萃取填料保存在平衡液中,不止起到保存的作用,同时在萃取待测样品中类固醇激素之前,还起到平衡磁固相萃取填料本身溶剂体系的作用,更适用于在下一步萃取步骤中实现高的萃取效率。
优选地,洗脱液包括腈类化合物和水,所述洗脱液中腈类化合物和水的体积比例为(60~100):(5~30);腈类化合物选自乙腈、丙腈、丙烯腈中的至少一种。表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁固相萃取填料,淋洗步骤后,本申请通过磁固相萃取填料中的亲水亲脂磁性微球将类固醇激素进行萃取和净化,然后通过洗脱液实现类固醇激素的解吸附,使类固醇激素得到释放的同时,通过洗脱液将类固醇激素转换成溶液形式,有利于后续液相色谱串联质谱法直接进行分析测试。
优选地,类固醇激素包括睾酮(缩写:T)、皮质醇(缩写:C)、雄烯二酮(缩写:A4)、脱氢表雄酮(缩写:DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(缩写:DHEA-S)、17α-羟孕酮(缩写:17α-OHP)、孕酮(缩写:P)、11-脱氧皮质醇(缩写:11S)、11-脱氧皮质酮(缩写:11-DOC)中的至少一种。上述九种类固醇激素可作为类固醇激素相关疾病的诊断标志物,临床上采用免疫发光法检测试剂,一次实验仅能针对其中一种类固醇激素进行检测,并且对含量较低的类固醇激素还具有检测准确度差的问题。本申请的检测试剂盒可实现对上述九种类固醇激素进行快速萃取和净化,配合液相色谱串联质谱能够实现准确检测。
进一步地,类固醇激素包括睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮。本申请的类固醇激素的检测试剂盒可以同时对检测样本中的九种类固醇激素进行检测,而且具有检测效率高,准确度高的优势。
第二方面,本申请提供了一种采用上述任意一种类固醇激素的检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:S100、将磁固相萃取填料依次进行活化处理、平衡处理后,加入待测样品中进行萃取处理,其中,待测样品中含有类固醇激素;S200、萃取处理后将磁固相萃取填料利用淋洗液进行淋洗处理,然后采用洗脱液进行洗脱处理,得到待测液;S300、对待测液进行液相色谱串联质谱分析,获取待测样品中类固醇激素的浓度信息。本申请采用磁固相萃取填料结合待测样品中的类固醇激素,通过外加磁场将类固醇激素从待测样品中分离,配合淋洗和洗脱步骤去除杂质,得到含类固醇激素的待测液,实现液相色谱串联质谱的前处理过程。方法所需实验流程简单高效,通过本申请的磁固相萃取填料中的亲水亲脂磁性微球能够对痕量的类固醇激素进行高倍富集,并且保证类固醇激素与待测样品基体彻底分离,提高检测的准确性和可靠性。
本申请的检测方法还可以配合磁固相萃取自动化处理***进行,将检测试剂盒各组分分别置于不同容器中(例如96孔板),利用外加磁场将磁固相萃取填料在不同液体体系之间进行转移,自动化实现上述活化、平衡、萃取、淋洗和洗脱过程,解放人力,还有利于减少人工操作的误差。
本申请的检测方法中淋洗还可以包括第一次淋洗和第二次淋洗,本申请中活化、平衡、第一次淋洗、第二次淋洗和洗脱的时间可以为20~60s,优选地,活化、平衡、第一次淋洗和第二次淋洗的时间为20~30s。本申请中萃取处理的时间可以为60~90s。活化、平衡、第一次淋洗、第二次淋洗和洗脱的每一步骤后,通过外加磁场转移磁固相萃取填料的移磁步骤时间可以为20~30s。
优选地,步骤S100还包括:萃取处理前,向所述待测样品中加入锌盐进行除杂和分离处理。血液样品中部分类固醇激素会与球蛋白和/或白蛋白进行结合,会阻碍类固醇激素与磁固相萃取填料的结合,从而影响类固醇激素检测的准确性。本申请针对儿童血液样品中存在的影响类固醇激素检测的干扰杂质,采用锌盐破坏血液样品中的大分子蛋白结构,使类固醇激素从与蛋白质的结合中释放出来,达到分离类固醇激素的目的,另外锌盐还可以与血液样品中的蛋白质和脂质等大分子反应进行除杂,减少或避免大分子杂质对磁固相萃取过程的影响,提高磁固相萃取效果。本申请的磁固相萃取填料在活化平衡后,可以直接加入除杂和分离处理后的液体体系中进行磁固相萃取处理,相比与传统固相萃取大大简化了操作流程,有利于提高萃取效率。
为进一步提高除杂和分离处理的效果,向待测样品中加入锌盐进行除杂和分离处理包括:锌盐选自硫酸锌、氯化锌、醋酸锌、丙酸锌中的至少一种。本申请的锌盐化合物可以针对儿童血液样品中的大分子杂质进行针对性的除杂并对类固醇激素进行释放和分离,从而提高对儿童血液样品中类固醇激素检测的效率和准确性。
本申请中进行除杂和分离处理的锌盐可以作为除杂剂,被包括在类固醇激素的检测试剂盒中。
优选地,除杂和分离处理中,待测样品与锌盐的比例为(50~200)uL:(20~200)umol。本申请中待测样品的体积为5~20 uL,对应除杂和分离处理所采用的锌盐的物质的量为20~200umol。
优选地,除杂和分离处理的时间为30~90 s。
本申请中液相色谱串联质谱分析的条件包括:
液相色谱条件包括:色谱柱为C18色谱柱;流动相A相为NH4F的去离子水溶液,流动相B相为NH4F甲醇溶液;流速为0.5mL/min;柱温为45℃;进样量为10uL;
质谱条件包括:使用电喷雾离子源,正负离子同时监测模式,多重反应监测进行扫描;离子源温度150℃, 毛细管电压Capillary:2 kV,脱溶剂气温度Desolvation Temp:500℃,脱溶剂气Desolvation:1000 L/Hr,锥孔气Cone:150 L/Hr。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。
本申请所提供的类固醇激素的检测试剂盒以及检测方法,具有以下有益效果:
1)本申请通过亲水亲脂磁性微球与类固醇激素进行紧密结合,利用磁固相萃取技术能够快速有效地萃取血液样本中的类固醇激素,通过磁场的作用力下实现类固醇激素在淋洗液和洗脱液之间的转移,对类固醇激素进行净化除杂,步骤简洁,还可以配合磁固相萃取自动化处理***,进一步简化人工操作和减少人为误差,提高类固醇激素检测的准确性;
2)通过前处理的两步淋洗步骤配合,能够尽可能去除杂质干扰物,降低杂质干扰物对类固醇激素分析测试的影响,配合洗脱步骤使类固醇激素与磁固相萃取填料彻底分离,从而提高了检测结果的准确性、可靠性和测试灵敏度;可同时检测血样中的睾酮、皮质醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮等九种关键类固醇激素,并可精准的做到定性和定量分析;
3)传统蛋白沉淀与固相萃取过程所需的操作时长为2~3h,本申请的检测方法针对儿童血液样品优化了除杂和分离处理的条件,采用锌盐化合物能够快速彻底地除去大分子杂质,并充分暴露待测类固醇激素;配合磁固相萃取技术,能够将磁固相萃取填料直接加入除杂和分离处理后的体系中,并在90s内完成类固醇激素的富集,将前处理的总操作时长缩短到9min以内,极大的提高了类固醇激素检测的效率,并且具有准确度和精密度高等优点,能够满足批间精密度<15%,批内精密度<15%,以及浓度检测值的准确度在92~109%,有利于对以类固醇激素为标志物的相关疾病的诊断和预后评估等应用,为临床检测以及治疗儿童性早熟等疾病提供了有力的实验室检查依据。
附图说明
图1为本申请的检测方法测定得到的标准品中睾酮的检测谱图;
图2为本申请的检测方法测定得到的标准品中雄烯二酮的检测谱图;
图3为本申请的检测方法测定得到的标准品中脱氢表雄酮的检测谱图;
图4为本申请的检测方法测定得到的标准品中硫酸脱氢表雄酮的检测谱图;
图5为本申请的检测方法测定得到的标准品中17α-羟孕酮的检测谱图;
图6为本申请的检测方法测定得到的标准品中孕酮的检测谱图;
图7为本申请的检测方法测定得到的标准品中皮质醇的检测谱图;
图8为本申请的检测方法测定得到的标准品中11-脱氧皮质醇的检测谱图;
图9为本申请的检测方法测定得到的标准品中11-脱氧皮质酮的检测谱图;
图10为本申请的检测方法建立的浓度为0.05~6ng/mL的睾酮的标准曲线;
图11为本申请的检测方法建立的浓度为0.1~12ng/mL的雄烯二酮的标准曲线;
图12为本申请的检测方法建立的浓度为0.5~60ng/mL的脱氢表雄酮的标准曲线;
图13为本申请的检测方法建立的浓度为50~6000ng/mL的硫酸脱氢表雄酮的标准曲线;
图14为本申请的检测方法建立的浓度为0.1~12ng/mL的17α-羟孕酮的标准曲线;
图15为本申请的检测方法建立的浓度为0.2~24ng/mL的孕酮的标准曲线;
图16为本申请的检测方法建立的浓度为5~600ng/mL的皮质醇的标准曲线;
图17为本申请的检测方法建立的浓度为0.05~6ng/mL的11-脱氧皮质醇的标准曲线;
图18为本申请的检测方法建立的浓度为0.05~6ng/mL的11-脱氧皮质酮的标准曲线。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
为了简便,本申请仅明确地公开了一些数值范围。然而,任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围;以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围,同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外,尽管未明确记载,但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而,每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
现有技术对类固醇激素采用液相色谱串联质谱检测时,一般采用蛋白沉淀法进行预处理,然后再通过固相萃取法进行二次富集和净化,实现类固醇激素的检测前处理过程。该方法包括首先用96孔蛋白沉淀板,通过蛋白沉淀前处理法,将血液样品中的类固醇激素和蛋白的结合部分释放出来,形成游离态的提取液形式。然后通过96孔SPE固相萃取板(例如HLB系列亲水亲脂的反相吸附剂)进行固相萃取,实现富集、净化和浓缩部分的前处理工作。96孔SPE固相萃取板在应用时,首先需要预先活化和平衡,然后将蛋白沉淀萃取组分预先稀释,稀释后转移到96孔SPE固相萃取板中,通过亲水亲脂的反相吸附剂选择性的吸附目标物组分,之后再通过淋洗的步骤,将部分干扰杂质洗掉,前提是不影响目标物组分吸附在吸附剂上,最后通过添加与目标物结合能力更强的溶剂,将目标物从吸附剂上洗脱下来,实现了富集、净化和浓缩的目的。蛋白沉淀法预处理存在的缺陷为需要蛋白沉淀和固相萃取两个主要过程才能完成实验,耗材和试剂消耗量较大,同时步骤较为繁琐,包括蛋白沉淀、过滤、活化、上样、淋洗和洗脱等步骤,而且处理过程耗时长,预计需要2~3h。同时由于血液样本的基质的来源和特异性,比如溶血或脂血样本等,可能会导致前处理板的堵塞,进而影响整体的实验进度。因此一个更快速、有效的适用于儿童性早熟症状筛查的临床检测方法是非常有必要的。
有鉴于此,本申请提供了一种类固醇激素的检测试剂盒,采用亲水亲脂磁性微球作为磁固相萃取填料,通过亲水基团和亲脂基团与血液样本中的类固醇激素紧密结合,利用磁场作用力实现类固醇激素与样品基质的分离,配合淋洗和洗脱步骤去除与类固醇激素性质接近的杂质干扰物,以及完成类固醇激素的解吸附,实现类固醇激素的除杂净化。本申请的磁固相萃取填料与类固醇激素结合性能强,萃取效率高,得到的待测液中类固醇激素的纯度较高,并且杂质干扰物较少,有利于提高质谱检测的离子化效率和检测灵敏度。得益于本申请检测试剂盒的高萃取效率,检测所需的血液样品用量较少,最少仅需50~100uL血液样品即可完成检测,有利于减少血液样品采集过程的误差,以及还能减少对受检者的身体和心理影响。
相比于蛋白沉淀预处理方法,本申请的磁固相萃取填料能够直接加入蛋白沉淀体系进行萃取,从而蛋白沉淀和萃取净化两步前处理合并在一个步骤内完成。另一方面,由于传统固相萃取过程的扩散和传质速率有限,因此萃取过程的平衡时间通常较长。本申请的磁固相萃取填料完全暴露于待测体系,并与类固醇激素充分接触,因此能够在短时间内从大体积的待测体系中吸附和萃取类固醇激素,再利用外加磁场从待测样品中实现分离,避免了繁琐的处理过程,从而将富集和净化过程实现绝对的缩短,让整个前处理的时间从传统固相萃取的2~3h缩短并控制在9min以内,进而能够更适用于临床检测,实现快速分析测试得到检测结果的目的。
本申请中磁性固相萃取(magnetic-solid phase extraction,简称M-SPE)是以磁性或可磁化的材料作为吸附剂基质的一种分散固相萃取技术,其在固相萃取技术的基础上将填料赋予了磁性,可以在磁场的作用力下实现聚集和转移。目标物利用磁性固相萃取填料的特异性吸附能力得到萃取,通过在不同功能液体间进行转移完成净化及解吸附过程,可以实现在复杂样本基质中的分离和净化。
本申请通过亲水亲脂磁性微球上亲水基团和亲脂基团的配合,能够对类固醇激素实现快速、紧密的结合,从而可以在短时间内从大体积的待测体系中吸附和萃取类固醇激素。整个萃取过程减少了有毒有害有机溶剂的使用,简化了繁琐的样品处理步骤,可以搭载磁固相萃取自动化处理***实现自动化处理,并且可以对儿童待测血液样品中的痕量类固醇激素例如睾酮、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮等进行高倍的富集,在应用上具有极高的优势。
在一些具体实施例中,本申请提供的类固醇激素的检测试剂盒,各组分如磁固相萃取填料、活化液、平衡液、淋洗液和洗脱液等,可以预先装填反应板产品中,例如96孔板试剂盒,可以通过铝膜等将96孔板试剂盒密封,极大的方便了产品的使用。实际操作中,只需撕开密封膜,然后将标准品、质控品和待测样品等按照要求加入到样本孔位中,通过外加磁场对磁固相萃取柱填料进行转移,即可实现检测方法所涉及的活化、平衡、上样、淋洗和洗脱等程序,完成类固醇激素的磁固相萃取过程。
在一些具体实施例中,本申请的检测试剂盒还可以可以搭配磁固相萃取自动化处理***,例如ZPTQ32全自动样品前处理***,通过程序自动完成检测方法所涉及的活化、平衡、上样、淋洗和洗脱等程序,实现了磁固相萃取填料结合全自动样品前处理***的全自动样品前处理方案,完成了自动化操作,降低了人为引入的误差,有利于解放生产力,可以更加快速、有效的实现血液样本中类固醇激素的提取、净化和浓缩,不止提升了检测效率,对检测结果的稳定性和准确性也有很大的提升,具有方便快捷的优势。
本申请提供的类固醇激素的检测试剂盒,配合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行分析检测,可用于血液样品中的睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮等物质的体外定量测试。这几种类固醇激素是儿童性早熟及其他相关疾病临床评价的重要标志物,在临床和生理方面具有较高研究价值。
本申请的检测方法还需用到校准品溶液和质控品溶液。
校准品溶液可以为系列浓度已知的睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮皮质醇、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮的混合溶液。
质控品可以采用去除激素本底后的血浆作为基质,加入特定浓度的睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮皮质醇、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮的混合溶液,可以分为高浓度质控品、中浓度质控品和低浓度质控品。高浓度质控品、中浓度质控品和低浓度质控品中类固醇激素的浓度依次降低。其中,去除激素本底后的血浆可由市售常规渠道获得。
在一些实施例中,液相色谱串联质谱法的液相条件,所述液相色谱的流动相,分别为流动相A和流动相B,流动相A为含有添加剂的超纯水,流动相B为含有添加剂的质谱级别甲醇溶液,添加剂为0.5mM 氟化铵。
本申请在流动相中添加0.5mM氟化铵,能同时满足质谱的正模式和负模式两种模式的离子化,同时还能够提高样品中标志物的检测灵敏度,提高标志物的离子化效率。
本申请的检测方法还包括:对校准品进行上述的磁固相萃取和液相色谱串联质谱分析后,根据分析结果以校准品中类固醇激素标准物的浓度为x轴,以类固醇激素标准物与内标物的峰面积比为y轴建立标准曲线。
在一些实施例中,对待测液中的待测类固醇激素进行液相色谱串联质谱分析后,基于标准曲线获取待测样品中待测类固醇激素的浓度。
实施例
下面结合具体实施例对本申请的技术方案进行说明,以下实施例所用原料均来自普通市售产品,所用装置或设备均购自常规市面销售渠道。
实施例1
本实施例的类固醇激素的检测试剂盒,包括:
磁固相萃取填料:磁固相萃取填料包括亲水亲脂磁性微球;亲水亲脂磁性微球包括聚二乙烯基苯磁性微球骨架和吡咯烷酮基团,吡咯烷酮基团和聚二乙烯基苯磁性微球骨架的摩尔比例为6:7;吡咯烷酮基团接枝在聚二乙烯基苯磁性微球骨架。
活化液:乙醇水溶液,乙醇和水的体积比例为70:20。
平衡液:乙醇水溶液,乙醇和水的体积比例为30:70。
第一淋洗液:乙醇水溶液,乙醇和水的体积比例为15:70。
第二淋洗液:乙醇和正己烷的混合液,其中乙醇和正己烷的体积比例为40:50。
洗脱液:异丙腈水溶液,异丙腈和水的体积比例为80:15。
聚二乙烯基苯磁性微球骨架通过包括以下步骤的制备方法得到:将三口瓶安置在水浴锅上,反应体系为乙醇水体系,打开搅拌桨,匀速搅拌,向三口瓶中通入惰性气体氮气除去氧气,然后向三口瓶中加入PEG4000。搅拌均匀后,加入二乙烯基苯,继续搅拌均匀后,再加入引发剂偶氮二异丁腈和过氧化苯甲酰,搅拌溶解后,再加入溶解好的聚乙二醇修饰的四氧化三铁纳米粒子,然后再加入甲苯作为致孔剂,持续匀速搅拌20min,使反应体系混合均匀。
之后打开水浴锅将反应体系加热至80℃,温度稳定后维持16h进行交联聚合反应。反应完成后,将反应体系转移到抽滤瓶中抽滤,然后依次用水、乙醇清洗,得到反应产物:聚二乙烯基苯磁性微球。将清洗后的产物用盐酸溶液浸泡过夜,清除聚二乙烯基苯表面的磁性物质,然后再次通过抽滤瓶抽滤清洗填料,用水清洗反应产物至中性后,在用三倍反应产物体积的乙醇清洗三遍,抽干后转移到60℃恒温箱干燥过夜,得到最终的聚二乙烯基苯磁性微球骨架,平均粒径为40 um。
亲水亲脂磁性微球通过包括以下步骤的制备方法得到:
将聚二乙烯基苯磁性微球骨架进行氯甲基化,然后加入吡咯烷酮进行修饰,即得亲水亲脂磁性微球。
本实施例的类固醇激素的检测试剂盒的检测方法,采用本实施例1的检测试剂盒,具体地,包括以下步骤:
1、溶液配制
1.1混合工作液的配制方案,如表1所示:
表1混合工作液的配制
如表1所示,首先取睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮皮质醇、11-脱氧皮质醇和11-脱氢皮质酮对应浓度和体积的一级储备液,加入50vol%的甲醇水溶液定容至1000uL,得到二级储备液。然后分别取对应体积的二级储备液,加入50vol%的甲醇水溶液定容,得到各类固醇激素对应的混合工作液浓度如上表1所示,备用。
1.2校准品的配制,如表2所示:
表2 校准品的配制
校准品配制时采用的基质液体的组分为含有5% BSA(牛血清白蛋白)的PBS(1X)缓冲溶液,-20℃储存。按表2所示取对应体积的混合工作液混合后,加入基质液体,首先配制得到校准品S6和校准品S7。然后取体积为45uL的校准品S7,加入225uL基质液体,即得校准品S5。校准品S1~S4按照表2的配方分别采用校准品S5或S7,加入对应的基质液体配制而成。
1.3质控品的配制,如表3所示:
表3 质控品的配制
质控品配制的基质液体为去除本底的血浆。首先取30 uL混合工作液与720uL质控品基质液体混合,配制得到高浓度质控品HQC。然后取15uL的高浓度质控品HQC,加入465uL的质控品基质液体,配制得到低浓度质控品LQC。按照同样的流程取250uL的高浓度质控品HQC,加入250uL的质控品基质液体,配制得到中浓度质控品MQC。质控品配制完成后,立刻分装并冷冻存储。
1.4内标工作液的配制,如表4所示:
表4 内标工作液的配制
采用甲醇作为稀释液,将内标储备液按照表4稀释为对应浓度的内标工作液。
2、样品前处理
2.1磁固相萃取前处理净化操作过程
2.11准备磁固相萃取96孔板规格的类固醇激素的检测试剂盒,撕开封板的铝膜。
2.12将校准品S1~S7,以及质控品LQC、MQC、HQC 参考表5的磁固相萃取96孔板的样品布局,添加到对应孔位当中。
2.13临床样本,向剩余其它孔中加入100uL待测血液样品和10uL内标工作液。
2.14向3和9列所有孔中加入200uL乙醇进行除杂和分离处理,待测样品与乙醇的体积比例为1:2,除杂和分离处理的时间为30s。
表5磁固相萃取96孔板样品布局表
表5为本申请的类固醇激素的检测试剂盒各组分、待测样品、标准品和质控品在96孔板中的位置布局,其中试剂1为活化液,试剂2为平衡液,磁固相萃取填料储存在平衡液中,试剂3为第一淋洗液,试剂4为第二淋洗液,试剂5为洗脱液。在96孔板的3列和9列中,C1~C7为校准品S1~S7,LQC、MQC和HQC分别是指低浓度质控品、中浓度质控品和高浓度质控品,Sample1~6是指可以同时对6个待测样品中的类固醇激素进行磁固相萃取处理。在对校准品S1~S7中的类固醇激素进行液相色谱串联质谱分析,得到浓度与分析结果的标准曲线后,短时间内无需进行校准品的测试,此时采用96孔板最多可以在3列和9列同时进行16个待测样品的处理。
2.2 磁固相萃取自动化操作流程
将配制好的前处理板放置于ZPTQ32全自动样品处理***,进行样品的自动化磁固相萃取处理,具体包括:将储存于2列平衡液中的磁固相萃取填料通过外加磁场力移取至1列的活化液中进行活化处理,然后移取磁固相萃取填料至2列进行平衡处理。平衡处理后,全自动样品处理***自动移取磁固相萃取填料至3列,进行磁固相萃取处理。达到设定的处理时间后,将磁固相萃取填料依次转移至4列、5列和6列中,分别进行第一淋洗处理、第二淋洗处理和洗脱处理。洗脱处理结束后,经过萃取和净化后的目标标志物留在第6列中,得到净化样本作为待测液,等待后续的上机检测。
96孔板中,7~12列的磁固相萃取过程与1~6列的过程相同,与1~6列平行进行。磁固相萃取自动化操作步骤所需时间如下表6所示。
表6 磁固相萃取自动化操作前处理步骤
3、样本检测
样品洗脱处理完毕后,将6和12列得到的净化样本作为待测液,转移到进样板中,进行液相色谱串联质谱的上机分析。
3.1色谱条件
进行液相色谱串联质谱分析时,液相色谱采用梯度洗脱,反相色谱法建立待测物的分离条件如下:色谱柱为C18色谱柱,规格为2.1×100mm,1.7μm,流速为0.5mL/min,柱温为45℃;其中流动相A相为0.5mM NH4F去离子水溶液,流动相B相为0.5mM NH4F甲醇溶液,进样量10uL。具体色谱条件和梯度洗脱程序如下表7所示:
表7 色谱梯度洗脱条件
3.2质谱条件
电喷雾电离(ESI)源,ESI+和ESI-离子电离正负同时监测模式(备注:DHEAS为ESI-模式)。离子源温度150℃, 毛细管电压Capillary:2 kV,脱溶剂气温度Desolvation Temp:500℃,脱溶剂气Desolvation:1000 L/Hr,锥孔气Cone:150 L/Hr。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。质谱离子对参数等信息如下表8所示:
表8 离子对参数
3.3标准曲线建立
对标准品进行检测,标准品中各类固醇激素的检测图谱如图1~9所示,图1~9分别为通过本申请检测方法测定得到的校准品中睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮九种标志物。采用内标法以标准物的浓度为x轴,以校准品与内标物的峰面积之比为纵坐标,得到标准曲线,结果如图10~18所示,线性关系验证结果如表9所示。
表9 标准曲线
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由图10~18及表9可知,各标准曲线的线性关系良好,相关系数r≥0.9950,可见本申请的检测方法所得检测结果与浓度相关性好,有利于检测的准确性,能够满足检测需求。
实施例2
采用实施例1的检测方法对质控品连续3天,每天进行3次平行实验,取3次实验测试值的平均值作为实测值,对检测结果的准确度和批内、批间精密度进行考察,结果如下:
表10 准确度考察结果
表11 批内,批间精密度考察结果
本申请中准确度由公式:准确度=实测值/理论值×100%计算得到,其中实测值为三次实验测试值的平均值。精密度用变异指数(CV)表示,由公式:精密度=标准偏差/实测值平均值×100%计算得到,CV数值越小,表示精密度越高。由表10和表11的质控品检测结果可知,本申请的检测方法能够对儿童血液样品中的睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮等九种类固醇激素同时进行检测,并且检测准确度在92.64~109.07%之间,批内精密度在2.46~7.31%之间,批间精密度在0.28~7.12之间,具有较高的准确度和精密度。在精密度方面能够满足批内定量下限浓度附近低值CV%<20%,其余浓度的CV<15%,批间浓度附近低值总CV%<20%,其余浓度的CV<15%;准确度方面满足,检测值在靶值的±15%以内,低浓度点在±20%以内,检测结果能够满足标准,有利于在临床上类固醇激素检测中的应用。
实施例3
本实施例的类固醇激素的检测方法,与实施例1的区别仅在于,检测试剂盒中的亲水亲脂磁性微球中,吡咯烷酮基团和聚二乙烯基苯磁性微球骨架的摩尔比例为9:4。
试验例
采用实施例1和3的类固醇激素的检测试剂盒对质控品QCM进行前处理,配合液相色谱串联质谱进行检测。通过ZPTQ32全自动样品前处理***进行自动化萃取处理等操作,其中9列的Sample1~6均为质控品QCM,采用实施例1和3的类固醇激素的检测试剂盒分别进行前处理后,液相色谱串联质谱的检测值平均值以及九种类固醇激素的准确度平均值如下表12所示。
表12 实施例1、3的质控品QCM检测结果
如表12所示,本申请的类固醇激素的检测试剂盒结合液相色谱串联质谱对九种类固醇激素同时进行萃取和检测,实施例1、3的检测试剂盒对九种类固醇激素的检测准确度在91.25~109.60%之间,检测值在靶值的±15%以内,有利于在临床应用的检测准确性。另外,实施例3对九种类固醇激素的检测准确度在91.25~109.60%之间,实施例1与之相比,准确度达到96.24~104.71%,可见本申请通过进一步控制亲水基团和亲脂基团的摩尔比例为(3~6):(7~8),能够使磁固相萃取填料更好地与类固醇激素结合,从而提高萃取效率和检测的准确性,满足临床上对九种类固醇激素的高准确度检测需求。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种类固醇激素的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括磁固相萃取填料、活化液、平衡液、淋洗液和洗脱液;
所述磁固相萃取填料包括亲水亲脂磁性微球;
所述亲水亲脂磁性微球包括聚二乙烯基苯磁性微球骨架和吡咯烷酮基团;
所述吡咯烷酮基团接枝或键合在所述聚二乙烯基苯磁性微球骨架上;
所述亲水亲脂磁性微球中,所述吡咯烷酮基团和所述聚二乙烯基苯磁性微球骨架的摩尔比例为(3~9):(4~8)。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,亲水亲脂磁性微球中,吡咯烷酮基团和聚二乙烯基苯磁性微球骨架的摩尔比例为(3~6):(7~8)。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述聚二乙烯基苯磁性微球骨架通过包括以下步骤的制备方法得到:
将二乙烯基苯在含有引发剂、致孔剂和聚乙二醇修饰的磁性粒子的反应体系中,进行交联聚合反应,即得所述聚二乙烯基苯磁性微球骨架。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述聚二乙烯基苯磁性微球骨架的制备方法包括以下条件中的至少一种:
条件1:所述引发剂包括偶氮二异丁腈和/或过氧化苯甲酰;
条件2:所述反应体系为乙醇水溶液体系;
条件3:所述磁性粒子包括铁粒子、钴粒子、镍粒子、四氧化三铁粒子中的至少一种;
条件4:所述交联聚合反应的温度为40~90℃;所述交联聚合反应的时间为8~32h。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述淋洗液包括第一淋洗液和第二淋洗液;
所述第一淋洗液包括醇类化合物和水,所述第一淋洗液中醇类化合物和水的体积比例为(10~20):(50~100);和/或,
所述第二淋洗液包括醇类化合物和脂肪烃类化合物,所述第二淋洗液中醇类化合物与脂肪烃类化合物的体积比例为(20~50):(30~60)。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,所述醇类化合物选自C1~6的醇类化合物中的至少一种;和/或,
所述脂肪烃类化合物选自C5~15的脂肪烃类化合物中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括以下条件中的至少一种:
条件A:所述活化液包括醇类化合物和水,所述活化液中醇类化合物和水的体积比例为(50~80):(5~50);
条件B:所述平衡液包括醇类化合物和水,所述平衡液中醇类化合物和水的体积比例为(20~80):(60~100);
条件C:所述洗脱液包括腈类化合物和水,所述洗脱液中腈类化合物和水的体积比例为(60~100):(5~30);所述腈类化合物选自乙腈、丙腈、丙烯腈中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述类固醇激素包括睾酮、皮质醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述类固醇激素包括睾酮、皮质醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮。
10.一种采用权利要求1~9中任一项所述类固醇激素的检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S100、将磁固相萃取填料依次进行活化处理、平衡处理后,加入待测样品中进行萃取处理,其中,所述待测样品中含有类固醇激素;
S200、萃取处理后将磁固相萃取填料利用淋洗液进行淋洗处理,然后采用洗脱液进行洗脱处理,得到待测液;
S300、对待测液进行液相色谱串联质谱分析,获取待测样品中类固醇激素的浓度信息。
11.根据权利要求10所述的检测方法,其特征在于,步骤S100还包括:萃取处理前,向所述待测样品中加入锌盐进行除杂和分离处理。
12.根据权利要求11所述的检测方法,其特征在于,所述向所述待测样品中加入锌盐进行除杂和分离处理包括以下条件中的至少一种:
条件a、所述锌盐选自硫酸锌、氯化锌、醋酸锌、丙酸锌中的至少一种;
条件b、待测样品与所述锌盐的比例为(50~200)uL:(20~200)umol;
条件c、所述除杂和分离处理的时间为30~90 s。
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