CN117363722A - 一种用于检测igk和igl基因的引物组合及其应用 - Google Patents

一种用于检测igk和igl基因的引物组合及其应用 Download PDF

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CN117363722A CN202311667031.8A CN202311667031A CN117363722A CN 117363722 A CN117363722 A CN 117363722A CN 202311667031 A CN202311667031 A CN 202311667031A CN 117363722 A CN117363722 A CN 117363722A
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Abstract

本发明公开了一种用于检测IGK和IGL基因的引物组合及其应用。所述引物组合包括IGK引物和IGL引物；所述IGK引物包括11条前置引物和3条后置引物；所述IGL引物包括8条前置引物和4条后置引物。本发明依据轻链型淀粉样变性疾病轻链蛋白异常表达但是异常克隆浆细胞水平很低的特点，巧妙的利用RNA可检测疾病轻链基因，直接分析轻链表达情况；同时设计IGK和IGL基因的2组引物组合，一个文库同时扩增IGK和IGL基因，能够全方面的分析轻链基因类型以及基因序列，保证简单、稳定、高效的扩增得到轻链基因序列，构建文库，进行高通量测序分析，实现了轻链基因类型、表达情况的稳定检测。

Description

一种用于检测IGK和IGL基因的引物组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于检测IGK和IGL基因的引物组合及其应用。
背景技术
免疫球蛋白轻链淀粉样变性是一种惰性浆细胞疾病，其特征是游离轻链(FLC)错误折叠和淀粉样纤维沉积在不同组织中，该疾病中存在免疫球蛋白轻链基因IGK或IGL的克隆性重排。在诊断为原发性淀粉样变性的患者中，大部分的血清或尿中发现M蛋白。免疫球蛋白轻链淀粉样变性临床表现多样且不具有特异性，使得疾病诊断困难且多数时间延误。理论上，除大脑外，任何器官均可受累，心脏是最常受累的器官，其次是肾脏、肝脏、胃肠道、软组织、外周和自主神经***。其中，心脏对预后的影响最为显著。免疫球蛋白轻链淀粉样变性的器官趋向性可能是使用特异性轻链胚系基因的功能，如具有κ轻链的AL患者有更多的肝脏受累，胚系基因IGLV6-57和IGLV1-44分别与肾脏和心脏受累增加有关。此外，免疫球蛋白轻链淀粉样变性中特异性胚系基因表达过多，也就是说，一些胚系基因，如IGLV6-57、IGLV3-01和IGLV2-14，在免疫球蛋白轻链淀粉样变性中的发生频率高于其他浆细胞恶性肿瘤或正常B细胞。在免疫球蛋白合成过程中产生的轻链基因的体细胞突变增加了轻链结构的复杂性。体细胞突变的负担和发生突变的特定位点会影响轻链的稳定性和淀粉样蛋白生成能力。因此，检测免疫球蛋白轻链淀粉样变性患者中IGK和IGL基因，既可以分析M蛋白表达情况，也可以分析受累器官类型以及预后情况，还可能揭示不同患者受累器官的机理。
目前免疫球蛋白检测方法有蛋白电泳、免疫电泳或免疫固定法，但检测灵敏度低，阳性率约72%，免疫球蛋白轻链基因IGK和IGL基因检测比较普及的方法主要是依赖于一代测序平台毛细管电泳方法检测DNA，但是由于技术以及核酸类型的局限性，临床应用方面还是存在着以下缺点：检测灵敏度低；检测结果不能够显示出具体IGK和IGL基因序列以及家族信息；免疫球蛋白轻链淀粉样变性患者异常克隆浆细胞比例低，DNA检测阳性率低。
综上所述，开发高效、稳定的检测IGK和IGL基因的方法，对于免疫球蛋白轻链淀粉样变性研究领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测IGK和IGL基因的引物组合及其应用，基于高通量测序的手段检测IGK和IGL基因，显著提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到序列信息。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测IGK和IGL基因的引物组合，所述引物组合包括IGK引物和IGL引物；所述IGK引物包括11条前置引物和3条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.11所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括SEQ IDNO.12~SEQ ID NO.14所示的序列；所述IGL引物包括8条前置引物和4条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.22所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.26所示的序列。
本发明中，开发基于高通量测序技术同时检测人免疫球蛋白轻链IGK和IGL基因的多重PCR引物组合，开发使用高通量测序技术来对骨髓等样本中（如轻链型淀粉样变性患者骨髓中）RNA的IGK和IGL基因进行分析，可以全方位了解IGK和IGL基因克隆性重排以及表达情况，IGK和IGL V区基因使用以及突变，同时可预测IGL蛋白结构。
本发明深入分析轻链型淀粉样变性疾病特征，异常克隆性浆细胞水平较低，但是异常克隆性浆细胞表达免疫球蛋白轻链水平较高，巧妙利用RNA替代DNA检测轻链基因，同时扩增IGK和IGL基因序列，了解轻链类型、表达情况、轻链V区类型以及突变情况。
SEQ ID NO.1：GTAAAACGACGGCCAGTAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAG。
SEQ ID NO.2：GTAAAACGACGGCCAGTAGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAG。
SEQ ID NO.3：GTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTC。
SEQ ID NO.4：GTAAAACGACGGCCAGTTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTG。
SEQ ID NO.5：GTAAAACGACGGCCAGTCTGGAGTGCCAGATAGGTTCAGTG。
SEQ ID NO.6：GTAAAACGACGGCCAGTCCCTGGAGTCCCAGACAGGTTCAG。
SEQ ID NO.7：GTAAAACGACGGCCAGTGCATCCCAGCCAGGTTCAGTG。
SEQ ID NO.8：GTAAAACGACGGCCAGTGTCCCTGACCGATTCAGTGGCA。
SEQ ID NO.9：GTAAAACGACGGCCAGTAATCCCACCTCGATTCAGTGGC。
SEQ ID NO.10：GTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGGGTCCCCTCGAGGTT。
SEQ ID NO.11：GTAAAACGACGGCCAGTAGACACTGGGGTCCCAGCCA。
SEQ ID NO.12：TAATACGACTCACTATAGGGACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC。
SEQ ID NO.13：TAATACGACTCACTATAGGGACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC。
SEQ ID NO.14：TAATACGACTCACTATAGGGACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC。
SEQ ID NO.15：GTAAAACGACGGCCAGTATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGC。
SEQ ID NO.16：GTAAAACGACGGCCAGTGGATCCCTGAGCGATTCTCTGG。
SEQ ID NO.17：GTAAAACGACGGCCAGTGAGTTCCTGATCGCTTCTCAGG。
SEQ ID NO.18：GTAAAACGACGGCCAGTTCCCCAGCCGCTTCTCTGG。
SEQ ID NO.19：GTAAAACGACGGCCAGTACACCTGCCCGGTTCTCAGG。
SEQ ID NO.20：GTAAAACGACGGCCAGTGCATCCCTGATCGCTTCTCAGT。
SEQ ID NO.21：GTAAAACGACGGCCAGTCAGCCTCCCTGACCATTACTGG。
SEQ ID NO.22：GTAAAACGACGGCCAGTGGTCCCCAGTCGAGTCTCTGG。
SEQ ID NO.23：TAATACGACTCACTATAGGGCTAGGACGGTGAGCTTGGTCCC。
SEQ ID NO.24：TAATACGACTCACTATAGGGCTAAAATGATCAGCTGGGTTCC。
SEQ ID NO.25：TAATACGACTCACTATAGGGCTAGGACGGTCAGCTCGGTCCC。
SEQ ID NO.26：TAATACGACTCACTATAGGGCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC。
本发明中，巧妙设计特性序列引物组合，能够保证以最少的引物扩增出所有家族的等位基因，同时降低多重PCR引物间相互作用，提高引物扩增效率。
优选地，所述引物组合还包括接头引物。
优选地，所述接头引物包括Ion Torrent平台接头引物。
优选地，所述接头引物包括12条前置引物和1条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括SEQ ID NO.27~SEQ ID NO.38所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括SEQ IDNO.39所示的序列。
SEQ ID NO.27：
ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccgcatggaacgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.28：
ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagctggcaatcctcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.29：
ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccggagaatcgcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.30：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtccacctcctcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.31：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagcagcattaattcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.32：
ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtctggcaacggcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.33：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtcctagaacacgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.34：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtccttgatgttcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.35：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtctagctcttcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.36：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagtcactcggatcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.37：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagttcctgcttcacgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.38：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagccttagagttcgatgtaaaacgacggccag。
SEQ ID NO.39：ccactacgcctccgctttcctctctatgggcagtcggtgattaatacgactcactataggg。
第二方面，本发明提供第一方面所述的用于检测IGK和IGL基因的引物组合在制备检测IGK和IGL基因的产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测IGK和IGL基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测IGK和IGL基因的引物组合；所述试剂盒还包括反转录试剂、多重PCR扩增试剂或测序接头扩增试剂中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述多重PCR扩增试剂包括DNA聚合酶和扩增缓冲液。
所述测序接头扩增试剂包括DNA聚合酶和扩增缓冲液。
第四方面，本发明提供一种构建IGK和IGL基因文库的方法，所述方法包括：
取待测样本中RNA，进行反转录，得到cDNA，以所述cDNA为模板，利用第一方面所述的用于检测IGK和IGL基因的引物组合进行多重PCR扩增，将多重PCR扩增产物与所述接头引物混合，进行接头PCR扩增反应，得到所述IGK和IGL基因文库。
优选地，所述待测样本为骨髓。
优选地，所述多重PCR扩增的条件为：（1）93~96℃预变性8~12 min；（2）93~95℃变性1~3 min、60~65℃退火1~3 min、70~73℃延伸25~35 s，30~40个循环；（3）70~73℃延伸8~12 min；
优选地，所述接头PCR扩增反应的条件为：（1）94~96℃预变性10~14 min；（2）93~95℃变性25~35 s、60~65℃退火25~35 s、70~73℃延伸25~35 s，18~23个循环；（3）70~73℃延伸3~6 min。
第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的检测IGK和IGL基因的方法，所述方法包括：
利用第四方面所述的构建IGK和IGL基因文库的方法构建IGK和IGL基因文库，对所述IGK和IGL基因文库进行纯化，将纯化后IGK和IGL基因文库进行上机测序及数据分析，判断IGK和IGL基因情况。
优选地，所述纯化的方法包括磁珠纯化法。
本发明设计特定的引物组合，保证准确、稳定扩增得到IGK和IGL基因基因序列，得到基因文库，同时结合高通量测序技术，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，具有广泛的应用前景，例如淀粉样变性患者异常克隆轻链基因序列鉴定、V区突变情况、轻链基因表达情况、轻链蛋白预测等。
第六方面，本发明提供一种检测IGK和IGL基因的装置，所述装置包括文库构建单元和测序单元。
所述文库构建单元用于执行包括：利用第四方面所述的构建IGK和IGL基因文库的方法构建IGK和IGL基因文库，对所述IGK和IGL基因文库进行纯化。
所述测序单元用于执行包括：将文库构建单元纯化后IGK和IGL基因文库进行上机测序及数据分析，判断IGK和IGL基因情况。
第七方面，本发明提供一种用于IGK和IGL基因的高通量测序检测的***，所述***包括第三方面所述的检测IGK和IGL基因突变的试剂盒和高通量测序平台。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明巧妙设计多组引物组合，能够保证以最少的引物扩增出所有家族的等位基因，同时降低多重PCR引物间相互作用，提高引物扩增效率，保证准确、稳定扩增得到IGK和IGL基因序列，得到基因文库，便于进行高通量测序分析，显著提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到序列信息。
附图说明
图1为IGL基因组成及引物分布图；
图2为IGK基因组成及引物分布图；
图3A为IGK和IGL扩增产物4200片段化分析结果图；
图3B为引物对照组1 IGK和IGL扩增产物4200片段化分析结果图；
图3C为引物对照组2 IGK和IGL扩增产物4200片段化分析结果图；
图4A为IGK和IGL文库4200片段化分析结果图；
图4B为引物对照组1 IGK和IGL文库4200片段化分析结果图；
图4C为引物对照组2 IGK和IGL文库4200片段化分析结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种IGK和IGL基因检测试剂盒，所述试剂盒包括IGK引物（前置引物SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.11；后置引物SEQ ID NO.12~SEQ ID NO.14）、IGL引物（前置引物SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.22；后置引物SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.26）和接头引物（前置引物SEQ ID NO.27~SEQ ID NO.38；后置引物SEQ ID NO.39），IGK和IGL基因组成及引物分布如图1和2所示。
实施例2
本实施例提取样本RNA及逆转录。
提取RNA所用试剂盒为天根TRNzol Universal 总RNA提取试剂(货号DP424)，反转录试剂盒为诺唯赞HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (货号R312)，按说明书进行操作。
实施例3
本实施例进行IGK和IGL基因目的片段扩增。
（d1）本实施例中所用扩增试剂为赛默飞（Thermofisher）的金牌酶；
（d2）基因片段扩增体系：PCR Buffer II（10×）加入5 μL，MgCl2（25 mM）加入3 μL，dNTP-Mix(10 mM)加入1 μL，AmpliTaq Gold(5U/μL)加入0.2 μL，引物加入量为终浓度0.2 μM，DNA加入量为100 ng，补水至总体积50 μL；
（d3）将上述体系加入到PCR管中，转移PCR管至PCR仪中开始扩增反应体系；
（d4）根据PCR热循环程序完成扩增反应，扩增程序为：(1) 94℃预变性10 min；(2)94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸30 s，35个循环；(3) 72℃延伸10 min，4℃ ∞；
（d5）反应结束后如不立刻进行后续实验将扩增产物放在4℃（短时）或-20℃（长时）；
（d6）扩增产物进行Qubit浓度质检及4200片段化分析，确保其空白对照无扩增产物出现，如图3A所示，正常样本扩增产物4200质检中有目的片段大小的条带。
（d7）本实施例同时设计了三组引物，经过对比实验，筛选出合适的引物。另外两组引物序列如下：
对照组1
（1）gtaaaacgacggccagttcaaggttcagcggcagtggatctg。
（2）gtaaaacgacggccagtggcctccatctcctgcaggtctagtc。
（3）gtaaaacgacggccagtcccaggctcctcatctatgatgcatcc。
（4）gtaaaacgacggccagtcaactgcaagtccagccagagtgtttt。
（5）gtaaaacgacggccagtcctgcaaagccagccaagacattgat。
（6）gtaaaacgacggccagtgaccgatttcaccctcacaattaatcc。
（7）taatacgactcactatagggcttacgtttgatctccaccttggtccc。
（8）taatacgactcactatagggcttacgtttaatctccagtcgtgtccc。
（9）gtaaaacgacggccagtattctctggctccaagtctggc。
（10）gtaaaacgacggccagtggatccctgagcgattctctgg。
（11）gtaaaacgacggccagtgagttcctgatcgcttctcagg。
（12）gtaaaacgacggccagttccccagccgcttctctgg。
（13）gtaaaacgacggccagtacacctgcccggttctcagg。
（14）gtaaaacgacggccagtgcatccctgatcgcttctcagt。
（15）gtaaaacgacggccagtcagcctccctgaccattactgg。
（16）gtaaaacgacggccagtggtccccagtcgagtctctgg。
（17）taatacgactcactatagggctaggacggtgagcttggtccc。
（18）taatacgactcactatagggctaaaatgatcagctgggttcc。
（19）taatacgactcactatagggctaggacggtcagctcggtccc。
（20）taatacgactcactatagggcgaggacggtcagctgggtgcc。
对照组2
（1）gtaaaacgacggccagtaagtggggtcccatcaaggttcag。
（2）gtaaaacgacggccagtagtcccatctcggttcagtggcag。
（3）gtaaaacgacggccagtgaaacaggggtcccatcaaggttc。
（4）gtaaaacgacggccagttcccagacagattcagtggcagtg。
（5）gtaaaacgacggccagtctggagtgccagataggttcagtg。
（6）gtaaaacgacggccagtccctggagtcccagacaggttcag。
（7）gtaaaacgacggccagtgcatcccagccaggttcagtg。
（8）gtaaaacgacggccagtgtccctgaccgattcagtggca。
（9）gtaaaacgacggccagtaatcccacctcgattcagtggc。
（10）gtaaaacgacggccagtctcaggggtcccctcgaggtt。
（11）gtaaaacgacggccagtagacactggggtcccagcca。
（12）taatacgactcactatagggacgtttgatctccaccttggtccc。
（13）taatacgactcactatagggacgtttgatatccactttggtccc。
（14）taatacgactcactatagggacgtttaatctccagtcgtgtccc。
（15）gtaaaacgacggccagtattctctggctccaagtctggca。
（16）gtaaaacgacggccagtggatccctgagcgattctctgg。
（17）taatacgactcactatagggctaggacggtgagcttggtccc。
（18）gtaaaacgacggccagtggcatccctgatcgcttctcagt。
（19）gtaaaacgacggccagtggacacctgcccggttctcagg。
（20）gtaaaacgacggccagtgtccccagccgcttctctgg。
（21）gtaaaacgacggccagtgagttcctgatcgcttctcagg。
（22）gtaaaacgacggccagtgcctccctgaccattactgg。
（23）gtaaaacgacggccagtgtccccagtcgagtctctgg。
（25）taatacgactcactatagggctaggacggtcagctcggtccc。
（26）taatacgactcactatagggcgaggacggtcagctgggtgcc。
实验流程同本实施例中实验流程，第二步连接接头所需PCR引物同本实施例中引物。
引物对照组结果分别如图3B和图3C所示，存在非特异性扩增产物，目的片段峰值较低，表明本发明设计的特定的引物组合扩增产物的特异性最好。
实施例4
本实施例进行扩增产物连接接头。
（e1）扩增产物链接接头体系使用的试剂为罗氏的FastStart High Fidelity PCRSystem试剂。
（e2）将实施例3中的扩增产物吸取2 μL至新的PCR管中，补水至100 μL，扩增产物50倍稀释；
（e3）扩增产物链接接头体系为：PCR Buffer with MgCl2（10×）加入5 μL，dNTP-Mix(10 mM)加入1 μL，接头前置引物（10 μM）加入1 μL，接头后置引物（10 μM）加入1 μL，扩增产物（稀释50倍后）加入1 μL，Fast Start High Fidelity polymerase（5U/μL）加入0.5μL，补水至50 μL；
（e4）将上述体系加入到PCR管中，转移PCR管至PCR仪中开始扩增反应体系；
（e5）根据PCR热循环程序完成扩增反应，扩增程序为：(1) 95℃预变性12min；(2)94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环；(3)72℃延伸5min， 4℃ ∞；
（e6）链接反应完成后获得的产物即为人IGK和IGL文库。
实施例5
本实施例进行文库纯化。
纯化所用磁珠为Amp XP磁珠，磁珠在使用前提前半小时25℃孵育。
（f1）向链接产物中加入50 μL 25℃孵育完全的Amp磁珠，涡旋混匀，25℃放置5min；
（f2）将反应管转移至磁力架吸附至溶液澄清，去除上清液；
（f3）向反应管中加入200 μL新配置的80%乙醇，上下轻轻吹打4次，去除上清液；
（f4）重复步骤（f3）；
（f5）瞬时离心反应管，然后将反应管重新放回磁力架吸附，去除残留80%乙醇，反应管继续放置在磁力架上；
（f6）25℃放置5 min，磁珠晾干；
（f7）向反应管中加35 μL无RNA酶的水，将反应管从磁力架去下，涡旋混匀，25℃放置5 min；
（f8）将反应管重新转移至磁力架吸附3 min至溶液澄清；
（f9）吸取上清至新的EP管中，管中既为纯化好的文库，文库4200片段化分析结果如图4A所示，目的片段大小在270bp左右，结果表明文库大小符合预期。
引物对照组结果分别如图4B和图4C所示，除270 bp左右目的文库之外存在多个非特异性扩增文库，表明本发明设计特定引物组合特异性最好。
实施例6
本实施例进行文库定量。
（g1）文库定量试剂选用的是KAPA Library Quantification Kit Ion Torrent™Platforms试剂盒；
（g2）定量仪器为ABI 7500。
实施例7
本实施例进行文库上机测试。
（h1）根据实施例6定量结果及上机要求，将构建好的文库混合到一起；
（h2）上机仪器选用的是赛默飞（Thermofisher）的Ion Torrent S5平台。
实施例8
本实施例进行文库下机数据生物信息分析
（i1）文库上机完成后先确定此次上机数据质量符合下机数据要求；
（i2）利用MIXCR软件分析下机数据。
分析结果如表4-表5所示，表4中第一位克隆% 总读数（Total reads）只有0.85，未达到2.5%要求，因此判定为非克隆性重排；表5第一位克隆% 总读数为29.24且第一克隆%总读数与第三克隆比例大于2倍关系，因此判定为克隆性重排。综合表1和表2结果，此患者为IGL轻链型淀粉样变，且IGL基因类型为IGLV1-44*01和IGLJ2*01，更容易心脏受累，后续可以监测此序列变化进而了解疾病进展。
表1
表2
/>
引物对照组由于引物效果不好，结果可能存在检测不到克隆性重排情况，如下：
表3为对照组2 IGL结果：非克隆性重排。
表3
/>
表4为本发明设计的特定的引物组合IGL结果：克隆性重排。
表4
/>
综上所述，本发明巧妙设计多组引物组合，能够保证以最少的引物扩增出所有家族的等位基因，同时降低多重PCR引物间相互作用，提高引物扩增效率，保证准确、稳定扩增得到IGK和IGL基因序列，得到基因文库，便于进行高通量测序分析，显著提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到序列信息。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测IGK和IGL基因的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括IGK引物和IGL引物；
所述IGK引物包括11条前置引物和3条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.11所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括SEQ ID NO.12~SEQ IDNO.14所示的序列；
所述IGL引物包括8条前置引物和4条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括SEQ IDNO.15~SEQ ID NO.22所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括SEQ ID NO.23~SEQ IDNO.26所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测IGK和IGL基因的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括接头引物；
所述接头引物包括Ion Torrent平台接头引物；
所述接头引物包括12条前置引物和1条后置引物，所述前置引物的核酸序列包括SEQID NO.27~SEQ ID NO.38所示的序列，所述后置引物的核酸序列包括SEQ ID NO.39所示的序列。
3.权利要求1或2所述的用于检测IGK和IGL基因的引物组合在制备检测IGK和IGL基因的产品中的应用。
4.一种检测IGK和IGL基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于检测IGK和IGL基因的引物组合；
所述试剂盒还包括反转录试剂、多重PCR扩增试剂或测序接头扩增试剂中任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR扩增试剂包括DNA聚合酶和扩增缓冲液；
所述测序接头扩增试剂包括DNA聚合酶和扩增缓冲液。
6.一种构建IGK和IGL基因文库的方法，其特征在于，所述方法包括：
取待测样本中RNA，进行反转录，得到cDNA，以所述cDNA为模板，利用权利要求1或2所述的用于检测IGK和IGL基因的引物组合进行多重PCR扩增，将多重PCR扩增产物与所述接头引物混合，进行接头PCR扩增反应，得到所述IGK和IGL基因文库。
7.根据权利要求6所述的构建IGK和IGL基因文库的方法，其特征在于，所述待测样本为骨髓；
所述多重PCR扩增的条件为：（1）93~96℃预变性8~12 min；（2）93~95℃变性1~3 min、60~65℃退火1~3 min、70~73℃延伸25~35 s，30~40个循环；（3）70~73℃延伸8~12 min；
所述接头PCR扩增反应的条件为：（1）94~96℃预变性10~14 min；（2）93~95℃变性25~35s、60~65℃退火25~35 s、70~73℃延伸25~35 s，18~23个循环；（3）70~73℃延伸3~6 min。
8.一种以非疾病诊断为目的的检测IGK和IGL基因的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求6或7所述的构建IGK和IGL基因文库的方法构建IGK和IGL基因文库，对所述IGK和IGL基因文库进行纯化，将纯化后IGK和IGL基因文库进行上机测序及数据分析，判断IGK和IGL基因情况。
9.一种检测IGK和IGL基因的装置，其特征在于，所述装置包括文库构建单元和测序单元；
所述文库构建单元用于执行包括：
利用权利要求6或7所述的构建IGK和IGL基因文库的方法构建IGK和IGL基因文库，对所述IGK和IGL基因文库进行纯化；
所述测序单元用于执行包括：
将文库构建单元纯化后IGK和IGL基因文库进行上机测序及数据分析，判断IGK和IGL基因情况。
10.一种用于IGK和IGL基因的高通量测序检测的***，其特征在于，所述***包括权利要求4所述的检测IGK和IGL基因突变的试剂盒和高通量测序平台。
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