CN117357482A - 一种外泌体缓释多孔微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,本发明首先制备了一种高分散稳定性的纳米羟基磷灰石(nHAP),可提高纳米羟基磷灰石的生物相容性以及稳定性;并通过双乳液法制备了多孔微球,然后将多巴胺(DA)原位聚合在微球表面,在微球表面形成一层PDA生物涂层,提高Exo在微球上的装载效率和释放周期,得到nHAP/PLGA‑PDA多孔微球;最后通过在多孔微球上负载Exo,得到nHAP/PLGA‑PDA@Exo缓释微球。本发明制备的nHAP/PLGA‑PDA@Exo外泌体缓释微球可以作为微支架通过微创手术或注射的方式填充到骨缺损位置,通过微球降解过程中释放的干细胞外泌体及钙离子,促进骨的再生和修复。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域,具体涉及一种外泌体缓释多孔微球及其制备方法。
背景技术
骨缺陷通常是高能量创伤、感染、肿瘤切除或先天性缺陷的结果骨。此外,它们经常伴有软组织损伤,包括肌肉、肌腱和关节损伤,给患者带来了严重的健康问题。作为全球严重的公共卫生问题,骨缺损会导致畸形、长期住院、生活质量恶化和巨大的经济负担。骨愈合是一个形成新骨骼的高度复杂、精心策划的再生过程,并参与一系列基本的细胞和分子事件。但是,骨组织的内在再生能力若没有手术干预,无法修复超过临界尺寸的骨骼缺陷。再生临界骨缺损的标准方法之一依赖于自体移植,自体移植不仅对缺陷区域的骨形成具有理想的骨导骨和骨感应特性。尽管自体和同源性骨移植已被广泛用于修复骨缺损,但这两种治疗方法仍然存在一些局限性,如炎症、自体骨受限和免疫排斥。此外,理想的骨移植替代品应具有以下特征:骨传导、骨合并、骨整合和成骨。然而,到目前为止,没有一种材料具有所有必要的特性来有效促进骨骼再生。近年来,基于干细胞治疗一直处于骨再生医学领域的前沿,这为骨骼修复和再生开辟了一条新道路。然而,它的分子机制并不精确,仍然存在一些局限性,如高成本、捐赠者有限等。因此,迫切需要新的治疗策略来满足骨骼疾病的临床要求。
研究表明,干细胞促进骨修复的功能主要归因于它们的旁分泌。大小为30-200nm的间充质干细胞(MSC)衍生外泌体(Exo)被用作重要的旁分泌通信介质,并为细胞之间的物质和信号交换提供途径,可以被骨髓间充质干细胞(BMSCs)内吞并已被证明可以刺激细胞迁移、增殖和成骨分化,促进骨缺陷的骨再生。它们具有天然归导或趋化能力,并将生理活性化学物质输送到靶细胞,通过这种方式,在传统手术技术中,可以绕过干细胞治疗和骨缺乏引起的免疫排斥的Exo被认为是一种无细胞靶向治疗的良好候选者。但由于骨修复和再生是一个长期、复杂的多阶段过程,而Exo由于其流体的流动容易造成组织内损失和失活,使得其体内治疗效果受到限制。因此,急需选择一种良好的载体来装载Exo并在受伤部位持续释放,以增加其保留力和作用时间。
研究发现,聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)因其独特的生物相容性和可调的生物降解性而被美国食品药品监督管理局批准为用于可体内植入的药物缓释载体材料。PLGA作为药物缓释载体应用,通常需要将其制备成具有纳微米尺寸的微球,进而在微球里装载药物或生物分子进行体内注射治疗。然而对于骨缺损修复治疗,PLGA在骨组织内降解所形成的酸性微环境严重抑制了新骨的再生过程,因此,在PLGA材料内部复合羟基磷灰石、碳酸钙、碳酸镁等无机材料,用于中和PLGA降解过程中所形成的酸性降解产物有效解决的PLGA在骨修复领域的使用瓶颈。另外,加入的钙、镁类无机盐在中和PLGA酸性降解产物的同时,释放出的钙镁离子还可以有效促进骨诱导和骨传导过程,加速新骨再生。
利用PLGA微球作为Exo缓释载体需要解决的问题是如何将足够剂量的外泌体装载到微球内部或表面,同时还要使外泌体与微球载体之间有一定的相互作用力,防止外泌体在植入到组织过程中或植入后发生突释效应,从而降低了外泌体在组织内部的作用时间和治疗效果。通过W/O/W复乳液技术将PLGA制备成具有微孔结构的微球载体,有利于提高PLGA微球对Exo的负载效率。特别地,如果对微球表面进行亲和涂层的修饰,不但可以进一步提高微球的负载量,同时,还可以通过涂层与Exo之间的相互作用,控制或延长Exo的释放周期,提高外泌体的治疗效果。聚多巴胺(PDA)作为生物涂层的应用,具有修饰方法简单,生物相容性好,可以通过迈克尔加成反应和席夫碱反应与生物分子间形成共价键,从而稳定、高效地负载生物分子。因此,通过PDA对多孔PLGA微球进行涂层修饰后,将极大的增加Exo在微球上的负载效率,并防止Exo的突释效应,延长外泌体在组织内的作用时间和治疗效果。
CN115252818A公开了一种药物缓释微球的制备方法,采用乳化法制备nHAP/PLGA的W/O/W乳液,进行冻干,得到nHAP/PLGA多孔微球,再经过PDA修饰的nHAP/PLGA得到nHAP/PLGA-PDA多孔微球,用于运输重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白,治疗类风湿关节炎的,该现有技术为本发明制备外泌体缓释多孔微球提供了理论基础。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种外泌体缓释多孔微球。
本发明的技术方案如下:一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,包括以下步骤:
1)将PASP溶液和CaCl2溶液混合后进行螯合30min,将PAA溶液和Na2HPO4·12H2O溶液混合后进行螯合30min,将上述螯合后的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液以一定的比例共混并充分搅拌反应后收集样品。样品离心,水洗三次,即可得到nHAP;
2)将步骤1)制备的nHAP分散于碳酸氢铵溶液中,作为内水相,将PLGA和PDLLA-PEG-PDLLA溶解在乙酸乙酯中作为油相,将内水相加入油相中进行乳化得到W/O乳液,再将所述W/O乳液加入到PVA溶液中进行乳化得到W/O/W乳液,对其进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球;
3)将步骤2)制备的nHAP/PLGA多孔微球与DA溶解于Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应,离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA-PDA多孔微球;
4)将步骤3)制备的nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,避光搅拌一段时间,水洗离心后得到可注射的nHAP/PLGA-PDA@Exo缓释多孔微球。
在一些实施方案中,所述步骤1)中PASP溶液的浓度为15mg/ml,用量为10~20ml。CaCl2溶液为CaCl2溶解于pH=7.6,1mM Tris溶液中,使得CaCl2的浓度为0.1mol/L,CaCl2溶液用量为200ml。
在一些实施方案中,所述步骤1)中PAA溶液的浓度为25mg/ml,用量为20~40ml;Na2HPO4·12H2O溶液为Na2HPO4·12H2O溶解于pH=7.1,50mM HEPES溶液中,使得Na2HPO4·12H2O的浓度为0.06mol/L,用量为200ml。
在一些实施方案中,所述步骤1)中螯合后的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液的共混比例为1:1~1:2。
在一些实施方案中,所述步骤2)碳酸氢铵溶液中nHAP的质量浓度为10-50mg/ml。
在一些实施方案中,所述步骤2)中碳酸氢铵溶液的质量分数为1-5%,用量为5ml。
在一些实施方案中,所述步骤2)油相中PLGA的质量分数为1~5%;PDLLA-PEG-PDLLA的质量分数为1~5%。
在一些实施方案中,所述步骤2)中制备W/O乳液时内水相和油相的混合体积比为1:1-1:5。
在一些实施方案中,所述步骤2)中PVA溶液的质量分数为1~5%。
在一些实施方案中,所述步骤2)中制备W/O/W乳液时W/O乳液和PVA溶液体积比为1:5-1:10。
在一些实施方案中,所述步骤3)中nHAP/PLGA多孔微球与DA的质量比为2:1~10:1。
在一些实施方案中,所述步骤3)中Tris-HCl缓冲液中nHAP-PLGA的浓度为5mg/ml。
在一些实施方案中,所述步骤3)中Tris-HCl缓冲液pH值为8~9。
在一些实施方案中,所述步骤4)中磷酸盐缓冲液的pH值为7~8。
在一些实施方案中,所述步骤4)磷酸盐缓冲液中nHAP/PLGA-PDA的浓度为5~10mg/ml。
在一些实施方案中,所述步骤4)磷酸盐缓冲液中Exo溶液的浓度为1-5mg/ml。
本发明的有益效果:1)根据本发明的方案,制备高分散稳定性的nHAP,可提高nHAP在PLGA微球中的分散性,防止颗粒聚集。
2)将nHAP有效分散在油相的内部,通过乳化制备W/O乳液,接着与聚乙烯醇溶液进行乳化,再通过溶剂挥发析出成球。微球基生物材料,作为可注射的微支架可通过微创手术填充不规则形状的骨缺损并完成进一步的再生。
3)通过将nHAP复合在PLGA微球中,能够在PLGA微球降解时有效地缓冲降解时的酸性环境,从而降低酸性环境对成骨再生的抑制作用。同时,nHAP与酸性物质反应后所释放的钙离子还可以起到骨传导和骨诱导作用,可以加速新骨再生。
4)本发明制备的PLGA微球具有多孔结构,极大提高了微球的比表面积,有利于提高Exo的负载量。进一步,通过DA在微球表面原位聚合形成PDA生物涂层,可以增加Exo与微球之间的相互作用力,进一步提高Exo的装载效率和负载稳定性,在防止Exo发生突释的同时还可以有效延长Exo的释放周期,提高Exo在体内的生物利用度。
5)通过本发明制备的nHAP/PLGA-PDA@Exo外泌体缓释微球可以作为微支架通过微创手术或注射的方式填充到骨缺损位置,通过微球降解过程中释放的干细胞外泌体及钙离子,促进骨的再生和修复。
相关说明
PASP:聚天冬氨酸
PAA:聚丙烯酸
nHAP:纳米羟基磷灰石
PLGA:聚乳酸-羟基乙酸
PDLLA-PEG-PDLLA:聚乙二醇-聚消旋乳酸
PVA:聚乙烯醇
DA:多巴胺
PDA:聚多巴胺
Exo:人脐间充质干细胞来源的外泌体
附图说明
图1nHAP/PLGA-PDA@Exo缓释微球制备的示意性流程图。
图2nHAP的XRD图
图3nHAP的透射电镜图
图4本发明中所使用的Exo的透射电镜图
图5本发明中所使用的Exo的纳米颗粒跟踪分析图
图6nHAP/PLGA-PDA多孔微球的扫描电子显微镜图
图7nHAP/PLGA和nHAP/PLGA-PDA微球在与Exo共同培育16h过程中,不同时间点Exo在两种微球上的负载量曲线图
图8nHAP/PLGA@Exo微球体外Exo释放曲线图
图9nHAP/PLGA-PDA@Exo微球体外Exo释放曲线图
图10Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo茜素红染色对比图
图11Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo碱性磷酸酶染色对比图
图12Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的碱性磷酸酶蛋白(ALP)的免疫荧光染色对比图,
图13Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的骨唾液酸蛋白(BSP)的免疫荧光染色对比图,图14Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的转录因子蛋白(RunX2)的免疫荧光染色对比图,图15Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的骨修复和再生性能
图16Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的骨修复和再生性能的三维重建分析图
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的本领域技术人员更全面地理解本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
准备15mg/ml PASP溶液20ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液40ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入反应釜中,以1:1的体积比进行混合反应,搅拌速度为600rpm,充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为50mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与20mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm,20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的30mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为1mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例2
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液20ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液40ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为40mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm/min,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm 10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与20mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm 20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的30mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为1mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例3
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液20ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液40ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm,充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为40mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm/min,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与10mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm 20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的30mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为5mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例4
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液20ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液40ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为40mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm/min,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与10mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm,20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的15mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为5mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例5
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液10ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液20ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为50mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm/min,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与20mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm,20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的30mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3ml,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为1mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例6
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液10ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液20ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为40mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与20mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm,20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的30mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为1mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例7
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液10ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液20ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为40mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000r后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与10mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm,20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的30mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为1mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例8
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液10ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液20ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为40mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与10mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm,20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的30mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为5mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
实施例9
一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,具体步骤如下:
1)nHAP的制备
将15mg/ml PASP溶液10ml和0.1mol/L CaCl2溶液200ml(溶解在pH=7.6,1mMTris溶液中),将PASP溶液滴加到CaCl2溶液中进行螯合30min,将25mg/ml PAA溶液20ml和0.06mol/LNa2HPO4·12H2O溶液200ml(溶解在pH=7.1,50mM HEPES溶液中),将PAA溶液滴加到Na2HPO4·12H2O溶液中进行螯合30min,将上述的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液分别加入到反应釜中,以1:1的体积比,转速为600rpm充分反应后收集样品。样品于8500rpm、10min离心,水洗三次,即可得到无定形的nHAP。
2)nHAP/PLGA的制备
将所制备的nHAP分散于5ml 5%碳酸氢铵溶液中,使得nHAP的浓度为40mg/ml,作为内水相,将0.5g PLGA和0.5g PDLLA-PEG-PDLLA溶解在20ml的乙酸乙酯中作为油相,将油相置于均质机下搅拌,达到8000rpm后将内水相迅速加入油相中,2min后,停止乳化,得到W/O乳液,迅速将200ml的1%PVA水溶液置于均质机下,转速稳定在15000rpm后,迅速将W/O乳液加入其中,5min后停止,得到W/O/W乳液,提前架好三颈烧瓶,并打开搅拌稳定在400rpm,迅速将W/O/W乳液倒入三颈烧瓶中,搅拌30min后用循环水式真空泵抽2h,充分去除乙酸乙酯。所制备的样品经8500rpm,10min离心后,水洗5次后进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球。
3)nHAP/PLGA-PDA的制备
将制备的100mg的nHAP/PLGA多孔微球与10mg的DA溶解于20ml,pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应12h,8500rpm 20min离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA多孔微球(nHAP/PLGA-PDA);
4)nHAP/PLGA-PDA@Exo的制备
将制备的15mg nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在3mL,pH=7.5的磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,使得Exo的浓度为5mg/ml,在预设温度4℃下避光搅拌5h,并进行水洗离心后可得nHAP/PLGA-PDA@Exo可注射外泌体缓释多孔微球;
上述的nHAP/PLGA多孔微球与DA的质量比为2:1-10:1中任一值;
上述的Tris-HCl缓冲液中nHAP-PLGA的质量分数为0.1-1%中任一值;
上述的Tris-HCl缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液,所述缓冲液的pH值为8-9中任一值。
本发明的实施例仅展示了较优的技术方案,在技术方案探索过程中尝试过不同的处方成分,不同的配比,不同的制备方法,经过大量尝试后发现本发明实施例1-9的处方成分,成分配比及制备方法最终达到的技术效果最优。研发过程中有大量失败的案例,如nHAP/PLGA多孔微球与DA的质量比不在范围2:1-10:1时,导致nHAP/PLGA多孔微球表面修饰不够影响其载药效果。Tris-HCl缓冲液的浓度和pH使用不当会影响微球的形成。
图2为nHAP的XRD图,表明nHAP被成功合成。
图3为nHAP的透射电镜图,从图中可以看出,本发明中合成的nHAP平均粒径在10-20nm之间,颗粒具有优良的单分散性。
图4为本发明中所使用的Exo的透射电镜图,从图4中可以看出,本发明使用的外泌体的平均粒径在150nm左右。图5为本发明中所使用的Exo的纳米颗粒跟踪分析图,从图5中可以看出,本发明使用的外泌体的平均粒径在150nm左右。
图6为nHAP/PLGA-PDA多孔微球的扫描电子显微镜图,从图6中可以看到,微球表面和内部具有明显的微孔结构,可以用于装载Exo。
图7为nHAP/PLGA和nHAP/PLGA-PDA微球在与Exo共同培育16h过程中,不同时间点Exo在两种微球上的负载量曲线图;从图7中可以看到,与未修饰PDA涂层的nHAP/PLGA微球相比较,具有PDA涂层的nHAP/PLGA-PDA微球上Exo的负载量明显增加,在共同培育5h时,Exo负载量达到最高的25μg/mg,而相同培育时间下,nHAP/PLGA微球的Exo负载量仅为5μg/mg左右。
图8为nHAP/PLGA@Exo微球体外Exo释放曲线图;从图8中可以看到,未修饰PDA生物涂层的nHAP/PLGA@Exo微球中,Exo在第1-3天突释现象明显,在第三天外泌体的释放量基本达到平衡。
图9为nHAP/PLGA-PDA@Exo微球体外Exo释放曲线图;从图9中可以看到,具有PDA涂层的nHAP/PLGA-PDA微球中,Exo的释放呈现出随时间逐渐增加的趋势,无明显突释,Exo的释放在第19天左右达到平衡的峰值,说明PLGA微球表面的PDA生物涂层可以控制Exo的释放,达到缓释Exo的效果。
图10为Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo茜素红染色对比图,茜素红与钙发生显色反应,产生一种深红色的带色化合物,这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节被染成了深红色,由图可以看出nHAP/PLGA-PDA@Exo组钙结节更多,成骨效果更好。
图11为Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo碱性磷酸酶染色对比图,用于检测骨细胞,如图可知nHAP/PLGA-PDA@Exo组颜色更深,骨细胞更多。
图12为Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的碱性磷酸酶蛋白(ALP)的免疫荧光染色对比图,绿色即为相应骨蛋白的染色,如图可知nHAP/PLGA-PDA@Exo组绿色更多更亮,证明细胞上的ALP蛋白更多,成骨效果更好。
图13为Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的骨唾液酸蛋白(BSP)的免疫荧光染色对比图,绿色即为相应骨蛋白的染色,如图可知nHAP/PLGA-PDA@Exo组绿色更多更亮,证明细胞上的BSP蛋白更多,成骨效果更好。
图14为Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的转录因子蛋白(RunX2)的免疫荧光染色对比图,绿色即为相应骨蛋白的染色,如图可知nHAP/PLGA-PDA@Exo组绿色更多更亮,证明细胞上的RunX2蛋白更多,成骨效果更好。
图15为Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的骨修复和再生性能,如图可知nHAP/PLGA-PDA@Exo组骨缺损面积减少,骨修复性能良好。
图16为Control和nHAP/PLGA-PDA@Exo的骨修复和再生性能,如三维重建分析图可知nHAP/PLGA-PDA@Exo组骨缺损面积减少,骨修复性能良好。
Claims (10)
1.一种外泌体缓释多孔微球的制备方法,包括以下步骤:
1)将PASP溶液和CaCl2溶液混合后进行螯合30min,将PAA溶液和Na2HPO4·12H2O溶液混合后进行螯合30min,将上述螯合后的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液以一定的比例共混并充分搅拌反应后收集样品,样品离心,水洗三次,即可得到nHAP;
2)将步骤1)制备的nHAP分散于碳酸氢铵溶液中,作为内水相,将PLGA和PDLLA-PEG-PDLLA溶解在乙酸乙酯中作为油相,将内水相加入油相中进行乳化得到W/O乳液,再将所述W/O乳液加入到PVA溶液中进行乳化得到W/O/W乳液,对其进行冷冻干燥,得到nHAP/PLGA多孔微球;
3)将步骤2)制备的nHAP/PLGA多孔微球与DA溶解于Tris-HCl缓冲液中,避光搅拌反应,离心水洗后冷冻干燥得到PDA修饰的nHAP/PLGA-PDA多孔微球;
4)将步骤3)制备的nHAP/PLGA-PDA多孔微球分散在磷酸盐缓冲液中,并加入Exo溶液,避光搅拌一段时间,水洗离心后得到可注射的nHAP/PLGA-PDA@Exo缓释多孔微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中PASP溶液的浓度为15mg/ml,用量为10~20ml;CaCl2溶液为CaCl2溶解于pH=7.6,1mM Tris溶液中,使得CaCl2的浓度为0.1mol/L,CaCl2溶液用量为200ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中PAA溶液的浓度为25mg/ml,用量为20~40ml;Na2HPO4·12H2O溶液为Na2HPO4·12H2O溶解于pH=7.1,50mM HEPES溶液中,使得Na2HPO4·12H2O的浓度为0.06mol/L,用量为200ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中螯合后的CaCl2溶液和Na2HPO4·12H2O溶液的共混比例为1:1~1:2。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)碳酸氢铵溶液中nHAP的质量浓度为10-50mg/ml;碳酸氢铵溶液的质量分数为1-5%,用量为5ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)油相中PLGA的质量分数为1~5%;PDLLA-PEG-PDLLA的质量分数为1~5%;所述步骤2)中制备W/O乳液时内水相和油相的混合体积比为1:1-1:5。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中PVA溶液的质量分数为1~5%;所述步骤2)中制备W/O/W乳液时W/O乳液和PVA溶液体积比为1:5-1:10。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中nHAP/PLGA多孔微球与DA的质量比为2:1~10:1;所述步骤3)中Tris-HCl缓冲液中nHAP-PLGA的浓度为5mg/ml;所述步骤3)中Tris-HCl缓冲液pH值为8~9。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤4)中磷酸盐缓冲液的pH值为7~8。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤4)磷酸盐缓冲液中nHAP/PLGA-PDA的浓度为5~10mg/ml;所述步骤4)磷酸盐缓冲液中Exo溶液的浓度为1-5mg/ml。
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