CN117344045A - 基于全基因组重测序开发的菜心核心kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学及植物分子育种技术领域，具体涉及基于全基因组重测序开发的菜心核心KASP分子标记及其应用。为了开发能够辅助菜心育种工作的KASP分子标记，本发明基于全基因组重测序从163份菜心种质资源中开发了菜心KASP分子标记，该菜心KASP分子标记能够快速、准确、有效地鉴定评价种质资源材料或者育成品种，可以解决因大量种质积累而带来的资源冗余、保存管理不便以及知识产权纠纷等问题。为遗传图谱构建、基因定位、分子辅助育种提供分子标记。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及植物分子育种技术领域，具体涉及基于全基因组重测序开发的菜心核心KASP分子标记及其应用。
背景技术
菜心(Brassica campestris L.ssp.chinesis var.utilis Tsen et Lee.)又名广东菜心，为十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种，是华南地区栽培面积大，复种指数高的特产蔬菜之一，是“菜篮子”的重要蔬菜供应品种。
分子标记(RAPD、SSR、Indel、SNP等)被广泛地应用于菜心种质资源遗传多样性评价、遗传图谱构建与基因定位、分子标记辅助育种等方面。其中，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度、短的引物序列，还是PCR的循环次数、基因组DNA的复杂性、技术设备等，都有可能导致RAPD结果的不稳定和难重复。SSR标记因其具有多态性高、操作简单等优点，在我国蔬菜作物遗传育种中曾经被普遍应用。但是其无法满足大规模、高通量、自动化的检测需求。SNP标记作为第三代分子标记技术，具有以下优势：一是在基因组中密度高、分布更均匀；二是高通量，检测位点可以达到几百万个；三是容易实现数据统计的自动化和数据整合比较。其中，竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specificPCR,KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。该技术现在主要被应用于SNP或Indel基因的分型研究中，正逐渐成为遗传图谱构建、基因定位、分子辅助育种、种质资源鉴评的主要技术手段。
随着我国菜心种质资源收集保护工作的不断推进，以及育成品种数量的逐年增多，传统的表型鉴定方法，因存在耗时耗力、周期长且准确性不高等问题，已成为种质资源高效利用的瓶颈。因此，开发菜心KASP分子标记，对于菜心的育种工作具有重要意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明基于全基因组重测序开发的菜心核心KASP分子标记，为菜心的遗传图谱构建、基因定位、分子辅助育种等工作提供了新的途径。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了用于扩增菜心KASP分子标记的KASP引物，所述菜心KASP分子标记包括编号为KASP1～40所示标记(共40个KASP标记)中的至少一种：
所述KASP1标记为碱基G/A，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第11610782位；
所述KASP2标记为碱基A/T，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第2704979位；
所述KASP3标记为碱基A/C，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第28651393位；
所述KASP4标记为碱基A/C，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第1698491位；
所述KASP5标记为碱基A/G，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第185869位；
所述KASP6标记为碱基A/T，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第17100560位；
所述KASP7标记为碱基C/A，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第23423862位；
所述KASP8标记为碱基A/G，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10001726位；
所述KASP9标记为碱基T/C，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10862382位；
所述KASP10标记为碱基T/G，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第8493116位；
所述KASP11标记为碱基C/G，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第19697759位；
所述KASP12标记为碱基T/C，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第27623567位；
所述KASP13标记为碱基T/C，位于菜心A04染色体上，位置为菜心全基因组序列的第18088070位；
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所述KASP39标记为碱基T/C，位于菜心A10染色体上，位置为菜心全基因组序列的第1.46E+08位；
所述KASP40标记为碱基T/A，位于菜心A10染色体上，位置为菜心全基因组序列的第19172885位；
每个KASP分子标记对应的KASP引物均由两条末端碱基不同的等位基因正向引物F1和F2与一条反向引物R构成，所述KASP1标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:1～3的核苷酸序列所示，所述KASP2标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:4～6的核苷酸序列所示，所述KASP3标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:7～9的核苷酸序列所示，所述KASP4标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:10～12的核苷酸序列所示，所述KASP5标记对应的KASP引物如SEQID NO:13～15的核苷酸序列所示，所述KASP6标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:16～18的核苷酸序列所示，所述KASP7标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:19～21的核苷酸序列所示，所述KASP8标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:22～24的核苷酸序列所示，所述KASP9标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:25～27的核苷酸序列所示，所述KASP10标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:28～30的核苷酸序列所示，所述KASP11标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:31～33的核苷酸序列所示，所述KASP12标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:34～36的核苷酸序列所示，所述KASP13标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:37～39的核苷酸序列所示，所述KASP14标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:40～42的核苷酸序列所示，所述KASP15标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:43～45的核苷酸序列所示，所述KASP16标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:46～48的核苷酸序列所示，所述KASP17标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:49～51的核苷酸序列所示，所述KASP18标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:52～54的核苷酸序列所示，所述KASP19标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:55～57的核苷酸序列所示，所述KASP20标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:58～60的核苷酸序列所示，所述KASP21标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:61～63的核苷酸序列所示，所述KASP22标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:64～66的核苷酸序列所示，所述KASP23标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:67～69的核苷酸序列所示，所述KASP24标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:70～72的核苷酸序列所示，所述KASP25标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:73～75的核苷酸序列所示，所述KASP26标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:76～78的核苷酸序列所示，所述KASP27标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:79～81的核苷酸序列所示，所述KASP28标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:82～84的核苷酸序列所示，所述KASP29标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:85～87的核苷酸序列所示，所述KASP30标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:88～90的核苷酸序列所示，所述KASP31标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:91～93的核苷酸序列所示，所述KASP32标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:94～96的核苷酸序列所示，所述KASP33标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:97～99的核苷酸序列所示，所述KASP34标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:100～102的核苷酸序列所示，所述KASP35标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:103～105的核苷酸序列所示，所述KASP36标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:105～108的核苷酸序列所示，所述KASP37标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:109～111的核苷酸序列所示，所述KASP38标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:112～114的核苷酸序列所示，所述KASP39标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:115～1117的核苷酸序列所示，所述KASP40标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:118～120的核苷酸序列所示。所述KASP引物为固态或液态。
优选地，引物F1的5’端添加FAM荧光标签序列，所述FAM荧光标签序列如SEQ IDNO:121的核苷酸序列所示，引物F2的5’端添加HEX荧光标签序列，所述HEX荧光标签序列如SEQ ID NO:122的核苷酸序列所示。
本发明第二方面提供了含有第一方面所述的KASP引物的检测产品，所述检测产品包括检测试剂、试剂盒和芯片。
本发明第三方面提供了第一方面所述的KASP引物或第二方面所述的检测产品在以下任一方面中的应用：
(1)菜心种质资源或者品种鉴定；
(2)菜心种质资源或者品种纯度检测；
(3)菜心指纹图库构建；
(4)菜心遗传多样性分析；
(5)菜心遗传图谱构建、基因分型；
(6)菜心分子基因定位；
(7)菜心分子标记辅助育种。
优选地，上述应用包括以下步骤：
S1、提取菜心样品基因组DNA；
S2、以步骤S1中的DNA为模板，采用权利要求1或2所述的KASP引物进行PCR扩增，并将PCR扩增产物放置在Bio-Rad CFX Connect实时荧光定量PCR仪上获取对应的产物荧光信号值，完成基因分型；
S3、采用数据分析软件Bio-Rad CFX Manager 3.1对步骤S2的实验结果进行分析。
更优选地，PCR扩增的反应体系为10μL，包括20ng/μL～30ng/μL的DNA 2μL，KASP引物共0.28μL，其中两条F引物各0.07μL，R引物0.14μL，2×KASP Master mixture 5μL。
更优选地，PCR扩增的反应条件为：94℃,15min；94℃,20sec，63℃～55℃,1min，每个循环降0.8℃，共10个循环；94℃,20sec，55℃,1min，共26个循环；荧光信号值的读取条件为16℃，20S。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明基于全基因组重测序从163份菜心种质资源中开发了菜心KASP分子标记，该菜心KASP分子标记能够快速、准确、有效地鉴定评价种质资源材料或者育成品种，可以解决因大量种质积累而带来的资源冗余、保存管理不便以及知识产权纠纷等问题。为遗传图谱构建、基因定位、分子辅助育种提供分子标记。
附图说明
图1为A02:KASP6标记在163份菜心种质资源中的多态性图谱；
图2为A08:KASP29标记在163份菜心种质资源中的多态性图谱；
图3为基于KASP标记的163份菜心的遗传距离聚类图；
图4为A10:KASP38标记在菜心亲本及其杂交种中的扩增效果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1基于全基因组重测序开发菜心KASP分子标记
从163份菜心种质资源组成菜心自然群体(表1)，然后按照以下方法开发菜心KASP分子标记：
(1)菜心DNA的提取：
①取菜心嫩叶约2g，用液氮研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μL 2％CTAB提取缓冲液，混匀后置于65℃水浴中温浴50min，每隔10min摇动一次；
②静置至室温后在4℃下12000rpm离心10min，将上清约800μL转移到新的2mL离心管；
③加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿：异戊醇＝24：1)，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃下12000rpm离心10min，将上清液约600μL转入新的1.5mL离心管中；
④加等体积-20℃下预冷的异丙醇，缓慢混匀，缓慢颠倒20次，置于-20℃下培养30min；
⑤在4℃下12000rpm离心10min，看到底部白色沉淀后，弃上清，先后分别加入800μL75％和95％酒精洗涤两次沉淀，弃上清，室温下于通风橱中晾干；
⑥加入100μL无菌水溶解。
(2)KASP引物设计
利用紫外/可见光光度计进行DNA纯度分析和定量检测。其中，OD值在1.8～2.0，含量在1.5μg以上的DNA样品被用于建库。
利用illumina HiSeqTM技术对2份菜心高代自交系【尖叶70天(广东省农作物种质资源保护库GDⅡ2D00187和圆叶C40(广东省农作物种质资源保护库GDⅡ2D00114)】进行全基因重测序分析(广州基迪奥生物科技有限公司进行)，将得到的重测序结果与菜心参考基因组(http://39.100.233.196:82/download_genome/Brapa_pangenome/genomes/CXA.fasta.gz)进行比对分析，选择有多态性且在染色体上均匀分布，位点前后各50bp不存在其他变异的SNP位点100个，然后设计引物将该100个SNP位点转化成KASP标记。
根据SNP位点和侧翼序列，利用软件Primer Premier 5.0按Awais等(Awais R,WenWE,Gao FM,Zhai SN,Jin H,Liu JD,Guo Q,Zhang YJ,Dreisigacker S,Xia XC,HeZH.Development and validation of KASP assays for genes underpinning keyeconomic traits inbread wheat.Theoretical and Applied Genetics,2016,129(10):1843-1860)介绍的引物设计方法对此差异位点设计KASP标记引物，开发KASP分子标记。每个标记设计2条SNP特异性引物(F1/F2)和一条通用引物(R)，F1尾部添加能够与FAM荧光结合的特异性序列(5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’)，F2尾部添加能够与HEX荧光结合的特异性序列(5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，共设计了250对KASP标记。
(3)KASP引物筛选
利用2个测序自交系为实验材料，对开发设计的250对KASP标记进行筛选。以“尖叶70天”和“圆叶C40”的DNA为模板，加入KASP引物和通用的KASP Master mix(购自广州固德生物技术有限公司)进行PCR(聚合链式反应)扩增。PCR反应体系为：10μL包括20ng/μL～30ng/μL的DNA 2μL，所述的分子标记引物(50ng·μL–1)共0.28μL，其中两条F引物各0.07μL，R引物0.14μL，以及5μL的2×KASP Master mixture。反应的条件为：94℃,15min；94℃,20sec，63℃～55℃,1min，每个循环降0.8℃，共10个循环；94℃,20sec，55℃,1min，共26个循环。待反应完成后，将PCR扩增产物放置于Bio-Rad CFX Connect实时荧光定量PCR仪上获取对应的产物荧光信号值，完成基因分型(激发HEX荧光一种纯合基因型，激发FAM为另一种纯合基因型，同时激发FAM和HEX荧光的为杂合基因型)。荧光信号值的读取条件为16℃，20s，采用数据分析软件Bio-Rad CFX Manager 3.1对实验结果进行分析。
利用上述分型成功的KASP标记再对163个菜心种质资源(表1)进行基因型检测，最终获得197个分型清晰的KASP标记。
(4)实验结果
所有KASP标记在163份种质资源中的多态性信息含量(PIC)变化范围为0.0885-0.3750，平均值为0.3288，PIC值大于0.3288的位点占所有位点的66.5％；主要等位基因频率(MAF)变化范围为0.5000-0.9512，平均值为0.6649。同时，根据基因分型结果，选择其中PIC值大于平均值0.3288的标记，剔除缺失率大于0.05、杂合率较高、连锁的标记，最后筛选出高质量、无连锁的且均匀分布在10条染色体上的标记40个。40个核心KASP标记的引物信息如表2所示。
表1 163份菜心种质资源的详情表
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表2菜心核心KASP分子标记的引物信息
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实施例2菜心KASP分子标记的应用
(1)在菜心遗传多样性分析中的应用
利用实施例1筛选的40个核心KASP标记进行菜心种质资源遗传多样性分析，将40个核心KASP标记对应的163份菜心自然群体(表1)的基因分型数据形成A-B矩阵，利用POWERMARKER V3.25软件计算种质资源间的Nei’s遗传距离，依据距离矩阵构建***发生树，进行Neighbor-Joining聚类分析，生成结果如图3所示，163份菜心种质资源可以划分三大类群。可见，本发明筛选的40个核心KASP标记可用于菜心遗传多样性分析。
(2)应用于菜心杂交种纯度鉴定
利用实施例1筛选的40个核心KASP标记，筛选在粤翠2号杂交菜心父母本之间有差异的KASP标记对杂交种进行纯度鉴定。粤翠2号杂交菜心是以18-9-5A为母本，高代自交系18-9-204为父本杂交育成的杂交一代新品种(粤评菜20220008)。随机挑选实施例1中的5个核心KASP标记对18-9-5A(广东省农作物种质资源保护库GDⅡ2D00100)和18-9-204(广东省农作物种质资源保护库GDⅡ2D00139)进行基因型检测，发现KASP38在18-9-5A和18-9-204之间基因型不同。为此，提取粤翠2号菜心单株DNA，利用KASP38对18个粤翠2号菜心单株DNA进行基因型检测。基因分型结果如图4所示，与父本基因型一致的为假杂种，其他杂种具有双亲带型，为真杂种。可见，本发明筛选的40个核心KASP标记可用于菜心杂交种纯度鉴定。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.用于扩增菜心KASP分子标记的KASP引物，其特征在于，所述菜心KASP分子标记包括编号为KASP1～40所示标记中的至少一种：
所述KASP1标记为碱基G/A，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第11610782位；
所述KASP2标记为碱基A/T，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第2704979位；
所述KASP3标记为碱基A/C，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第28651393位；
所述KASP4标记为碱基A/C，位于菜心A01染色体上，位置为菜心全基因组序列的第1698491位；
所述KASP5标记为碱基A/G，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第185869位；
所述KASP6标记为碱基A/T，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第17100560位；
所述KASP7标记为碱基C/A，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第23423862位；
所述KASP8标记为碱基A/G，位于菜心A02染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10001726位；
所述KASP9标记为碱基T/C，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10862382位；
所述KASP10标记为碱基T/G，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第8493116位；
所述KASP11标记为碱基C/G，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第19697759位；
所述KASP12标记为碱基T/C，位于菜心A03染色体上，位置为菜心全基因组序列的第27623567位；
所述KASP13标记为碱基T/C，位于菜心A04染色体上，位置为菜心全基因组序列的第18088070位；
所述KASP14标记为碱基T/C，位于菜心A04染色体上，位置为菜心全基因组序列的第6258410位；
所述KASP15标记为碱基T/C，位于菜心A04染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10026614位；
所述KASP16标记为碱基C/G，位于菜心A04染色体上，位置为菜心全基因组序列的第16218350位；
所述KASP17标记为碱基G/A，位于菜心A05染色体上，位置为菜心全基因组序列的第3145717位；
所述KASP18标记为碱基A/C，位于菜心A05染色体上，位置为菜心全基因组序列的第18572144位；
所述KASP19标记为碱基G/A，位于菜心A05染色体上，位置为菜心全基因组序列的第9463552位；
所述KASP20标记为碱基A/C，位于菜心A05染色体上，位置为菜心全基因组序列的第28192892位；
所述KASP21标记为碱基A/G，位于菜心A06染色体上，位置为菜心全基因组序列的第6852121位；
所述KASP22标记为碱基G/A，位于菜心A06染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10677734位；
所述KASP23标记为碱基A/G，位于菜心A06染色体上，位置为菜心全基因组序列的第22257476位；
所述KASP24标记为碱基G/C，位于菜心A06染色体上，位置为菜心全基因组序列的第9965983位；
所述KASP25标记为碱基C/T，位于菜心A07染色体上，位置为菜心全基因组序列的第1174293位；
所述KASP26标记为碱基G/A，位于菜心A07染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10981162位；
所述KASP27标记为碱基G/T，位于菜心A07染色体上，位置为菜心全基因组序列的第9983050位；
所述KASP28标记为碱基T/C，位于菜心A07染色体上，位置为菜心全基因组序列的第26272325位；
所述KASP29标记为碱基G/A，位于菜心A08染色体上，位置为菜心全基因组序列的第1301114位；
所述KASP30标记为碱基G/A，位于菜心A08染色体上，位置为菜心全基因组序列的第10565599位；
所述KASP31标记为碱基A/G，位于菜心A08染色体上，位置为菜心全基因组序列的第3345952位；
所述KASP32标记为碱基A/G，位于菜心A08染色体上，位置为菜心全基因组序列的第17050414位；
所述KASP33标记为碱基T/C，位于菜心A09染色体上，位置为菜心全基因组序列的第33460626位；
所述KASP34标记为碱基A/G，位于菜心A09染色体上，位置为菜心全基因组序列的第37940211位；
所述KASP35标记为碱基C/T，位于菜心A09染色体上，位置为菜心全基因组序列的第27576904位；
所述KASP36标记为碱基A/G，位于菜心A09染色体上，位置为菜心全基因组序列的第9696742位；
所述KASP37标记为碱基T/C，位于菜心A10染色体上，位置为菜心全基因组序列的第1602744位；
所述KASP38标记为碱基A/G，位于菜心A10染色体上，位置为菜心全基因组序列的第8592878位；
所述KASP39标记为碱基T/C，位于菜心A10染色体上，位置为菜心全基因组序列的第1.46E+08位；
所述KASP40标记为碱基T/A，位于菜心A10染色体上，位置为菜心全基因组序列的第19172885位；
每个KASP分子标记对应的KASP引物均由两条末端碱基不同的等位基因正向引物F1和F2与一条反向引物R构成，所述KASP1标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:1～3的核苷酸序列所示，所述KASP2标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:4～6的核苷酸序列所示，所述KASP3标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:7～9的核苷酸序列所示，所述KASP4标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:10～12的核苷酸序列所示，所述KASP5标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:13～15的核苷酸序列所示，所述KASP6标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:16～18的核苷酸序列所示，所述KASP7标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:19～21的核苷酸序列所示，所述KASP8标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:22～24的核苷酸序列所示，所述KASP9标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:25～27的核苷酸序列所示，所述KASP10标记对应的KASP引物如SEQID NO:28～30的核苷酸序列所示，所述KASP11标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:31～33的核苷酸序列所示，所述KASP12标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:34～36的核苷酸序列所示，所述KASP13标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:37～39的核苷酸序列所示，所述KASP14标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:40～42的核苷酸序列所示，所述KASP15标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:43～45的核苷酸序列所示，所述KASP16标记对应的KASP引物如SEQ IDNO:46～48的核苷酸序列所示，所述KASP17标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:49～51的核苷酸序列所示，所述KASP18标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:52～54的核苷酸序列所示，所述KASP19标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:55～57的核苷酸序列所示，所述KASP20标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:58～60的核苷酸序列所示，所述KASP21标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:61～63的核苷酸序列所示，所述KASP22标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:64～66的核苷酸序列所示，所述KASP23标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:67～69的核苷酸序列所示，所述KASP24标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:70～72的核苷酸序列所示，所述KASP25标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:73～75的核苷酸序列所示，所述KASP26标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:76～78的核苷酸序列所示，所述KASP27标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:79～81的核苷酸序列所示，所述KASP28标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:82～84的核苷酸序列所示，所述KASP29标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:85～87的核苷酸序列所示，所述KASP30标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:88～90的核苷酸序列所示，所述KASP31标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:91～93的核苷酸序列所示，所述KASP32标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:94～96的核苷酸序列所示，所述KASP33标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:97～99的核苷酸序列所示，所述KASP34标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:100～102的核苷酸序列所示，所述KASP35标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:103～105的核苷酸序列所示，所述KASP36标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:105～108的核苷酸序列所示，所述KASP37标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:109～111的核苷酸序列所示，所述KASP38标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:112～114的核苷酸序列所示，所述KASP39标记对应的KASP引物如SEQ ID NO:115～1117的核苷酸序列所示，所述KASP40标记对应的KASP引物如SEQID NO:118～120的核苷酸序列所示。
2.根据权利要求1所述的用于扩增菜心KASP分子标记的KASP引物，其特征在于，引物F1的5’端添加FAM荧光标签序列，所述FAM荧光标签序列如SEQ ID NO:121的核苷酸序列所示，引物F2的5’端添加HEX荧光标签序列，所述HEX荧光标签序列如SEQ ID NO:122的核苷酸序列所示。
3.含有权利要求1或2所述的KASP引物的检测产品，其特征在于，所述检测产品包括检测试剂、试剂盒和芯片。
4.权利要求1或2所述的KASP引物或权利要求3所述的检测产品在以下任一方面中的应用：
(1)菜心种质资源或者品种鉴定；
(2)菜心种质资源或者品种纯度检测；
(3)菜心指纹图库构建；
(4)菜心遗传多样性分析；
(5)菜心遗传图谱构建、基因分型；
(6)菜心分子基因定位；
(7)菜心分子标记辅助育种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取菜心样品基因组DNA；
S2、以步骤S1中的DNA为模板，采用权利要求1或2所述的KASP引物进行PCR扩增，并将PCR扩增产物放置在Bio-Rad CFX Connect实时荧光定量PCR仪上获取对应的产物荧光信号值，完成基因分型；
S3、采用数据分析软件Bio-Rad CFX Manager 3.1对步骤S2的实验结果进行分析。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR扩增的反应体系为10μL，包括20ng/μL～30ng/μL的DNA 2μL，KASP引物共0.28μL，其中两条F引物各0.07μL，R引物0.14μL，2×KASPMaster mixture 5μL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR扩增的反应条件为：94℃,15min；94℃,20sec，63℃～55℃,1min，每个循环降0.8℃，共10个循环；94℃,20sec，55℃,1min，共26个循环；荧光信号值的读取条件为16℃，20S。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |