CN117343999B - 基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：S1用于准备左侧自由探针、右侧自由探针和模板核酸的步骤；S2用于在试管L中生成退火后左侧探针Lp，并立即冰水浴的步骤；S3用于在试管R中生成退火后右侧探针Rp，并进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤；S4用于对试管L和试管R进行分选纯化的步骤；S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤。本发明所公开的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，扩增的核酸产物浓度高，步骤简单实验成本低、耗时短，且适用于检测探针之间的核酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增领域，具体涉及一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法。
背景技术
在对样本检测时，相比于背景核酸，感兴趣的靶核酸有时候因含量非常低而导致不能够被有效检测[1]，因此需要预先对靶核酸进行适当的富集/扩增[2]。针对靶核酸片段的富集/扩增并结合核酸检测的策略应用范围广泛，比如用于传染病的监测和诊断[3, 4]、病人样本中病毒基因组测序[5]、病原微生物基因型耐药检测[4]、肿瘤诊断和预后[6, 7]等。
对于核酸检测，常用的方法包括(毛细管)核酸电泳[8]、Sanger测序/二代测序(next-generation sequencing，NGS)/三代测序(third-generation sequencing)[9,10]、基于CRISPR/Cas[11]、使用荧光探针/核酸染料[12, 13]、核酸质谱[7]、指示PCR前后pH差异[14]等。
对于靶核酸片段的富集/扩增，常用的方法包括(多重)PCR[15]、恒温扩增[16]、CRISPR/Cas[2]、差异裂解富集病原微生物核酸[17]、固相芯片杂交捕获(microarrayhybridization)[18]、液相杂交捕获(in solution hybridization)[19]、分子倒置探针(molecular inversion prob，MIP)捕获[20, 21]、多重连接依赖探针扩增(multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)[8]等。现有技术中的常用方法，如固相芯片杂交捕获、液相杂交捕获、MIP捕获和MLPA属于靶向富集/扩增方法，其所富集/扩增靶核酸的通量均具有可扩展性，但仍然具有一定的弊端：杂交捕获的方法具有高性能，但仍然昂贵和耗时，且对核酸需求量大[8, 22]；MIP捕获法所用探针较长，其由中间的通用间隔序列和两侧的靶核酸特异序列组成，可能影响靶核酸的捕获效率，另外其亦另外包含DNA连接和核酸外切酶酶切步骤，步骤较为繁琐[13, 14]；MLPA所用的靶核酸特异的两侧探针在靶核酸退火位置相邻(即无核苷酸间隔)，其同时和靶核酸退火并被连接酶连接，因此不适用于检测探针之间的核酸序列[8, 23]。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法。
本发明所提供的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，包括如下步骤：
S1用于准备带有通用引物结合位点的左侧自由探针、带有通用引物结合位点的右侧自由探针和模板核酸的步骤；
S2用于在试管L中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针Lp（left probe，左侧探针），并立即冰水浴的步骤；
S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp（right probe，右侧探针），并用具有3’ ->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤；
S4用于对试管L和试管R分别用DNA分选磁珠进行分选纯化的步骤；
S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤。
进一步，所述S2用于在试管L中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针Lp，并立即冰水浴的步骤，包括：
S21用于对试管L进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3 - 10 分钟，优选98摄氏度，时间3分钟；
S22用于对高温变性后的试管L进行低温退火，温度为50 - 72 摄氏度，时间为 1- 60 分钟，优选65摄氏度，时间5分钟；
S23用于对低温退火后的试管L进行冰水浴，时间为1 - 60 分钟，优选5分钟。
进一步，所述S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤，包括：
S31用于对试管R进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3 - 10 分钟，优选98摄氏度，时间3分钟；
S32用于对高温变性后的试管R进行低温退火，温度为50 - 72 摄氏度，时间为 1- 60 分钟，优选65摄氏度，时间为5分钟；
S33用于向低温退火后的试管R中使用具有3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸，保持温度为65 - 72 摄氏度，时间为5 - 60秒，优选72摄氏度，时间10秒；
S34用于将延伸后的试管R进行冰水浴，时间为1 - 60 分钟，优选5分钟。
进一步，所述S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤，还包括：
S35用于向步骤S34中的试管R中加入蛋白酶K以降解DNA聚合酶，温度为37 - 65摄氏度，时间为 5 - 60分钟，优选65摄氏度，时间30分钟；
S36用于将步骤S35中的试管R进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3- 10 分钟，优选98摄氏度，时间10分钟；
S37用于将步骤S36中的试管R进行低温退火，温度50 - 72 摄氏度，时间为 1 -60 分
钟，优选65摄氏度，时间5分钟；
S38用于将步骤S37中的试管R进行冰水浴，时间为1 - 60 分钟，优选5分钟。
进一步，所述S4用于对试管L和试管R分别用DNA分选磁珠进行分选纯化的步骤，
包括：
S41分别向步骤S23中的试管L和步骤S38中的试管R中加入适量磁珠，并采用一轮法进行分选纯化。
进一步，所述S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤，包括：
S51用于超量上游引物F和模板核酸中的痕量Lp优先退火和延伸而产生痕量的F’；
S52用于F’和Rp’退火并发生F’的延伸，用的是3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶；
S53用于上游引物F和下游引物R以步骤S52后的产物为模板进行正常的PCR扩增。
本发明所提供的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，相较于传统的扩增方法具有的优点：
1、相较于杂交捕获的方法，本申请具有高性能的同时，对核酸需求量小，测试时间短且测试成本低；
2、相较于MIP捕获法，本申请所用探针短，不会影响靶核酸的捕获效率；
3、相较于MLPA捕获法，本申请适用于检测探针之间的核酸序列。
附图说明
图1为本发明所述的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法的步骤示意图；
图2为本发明实施例1所述的EGFP全长及左侧探针和右侧探针的结构和退火位置示意图；
图3为本发明实施例1所述的右侧自由探针发生退火及一次延伸后(Tube R)，和仅仅发生退火（Tube R’）的PCR扩增对比示意图；
图4为本发明实施例1所述的试管R和试管R’介导的最后PCR产物电泳胶图不同对比度的对照图；
图5为本发明实施例1所述的试管R’导致PCR产物减少的流程示意图；
图6为本发明实施例2和实施例3的电泳胶图；
图7为本发明实施例4的EGFP的GFP1、GFP2和GFP3片段的位置示意图；
图8为本发明实施例4的GFP1、GFP2和GFP3进行单独和同时扩增后的电泳胶图；
图9为本发明实施例5较大扩增产物的测序结果图；
图10为本发明实施例5较大扩增产物产生原因的示意图；
图11为本发明实施例6磁珠纯化前和磁珠纯化后的PCR产物电泳胶图；
图12为本发明实施例6磁珠纯化前后模板体系的成分差异对比图；
图13为本发明实施例6自由探针抑制PCR扩增的电泳胶图；
图14为本发明实施例7对人Cg313、Cg540、Cg929片段的单独和同时扩增的电泳胶图；
图15为本发明实施例1-实施例4、实施例6、实施例7扩增PCR产物的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1-图15所示，本实施例提供的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，包括如下步骤：
S1用于准备带有通用引物结合位点的左侧自由探针、带有通用引物结合位点的右侧自由探针和模板核酸的步骤；
S2用于在试管L中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针Lp（left probe，左侧探针），并立即冰水浴的步骤；
S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp（right probe，右侧探针），并用具有3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤；
S4用于对试管L和试管R分别用DNA分选磁珠进行分选纯化的步骤；
S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤。
本领域技术人员可以理解，采用本实施例所提供的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，扩增的核酸产物浓度高，步骤简单实验成本低、耗时短，且适用于检测探针之间的核酸序列。
进一步，所述S2用于在试管L中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针Lp，并立即冰水浴的步骤，包括：
S21用于对试管L进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3 - 10 分钟，优选98摄氏度，时间3分钟；
S22用于对高温变性后的试管L进行低温退火，温度为50 - 72 摄氏度，时间为 1- 60 分钟，优选65摄氏度，时间5分钟；
S23用于对低温退火后的试管L进行冰水浴，时间为为 1 - 60 分钟，优选5分钟。
进一步，所述S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤，包括：
S31用于对试管R进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3 - 10 分钟，优选98摄氏度，时间3分钟；
S32用于对高温变性后的试管R进行低温退火，温度为为 50 - 72 摄氏度，时间为1 - 60 分钟，优选65摄氏度，时间为5分钟；
S33用于向低温退火后的试管R中使用具有3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸，保持温度为65 - 72 摄氏度，时间为5 - 60秒，优选72摄氏度，时间10秒；
S34用于将延伸后的试管R进行冰水浴，时间为1 - 60 分钟，优选5分钟。
进一步，所述S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤，还包括：
S35用于向步骤S34中的试管R中加入蛋白酶K以降解DNA聚合酶，温度为37 - 65摄氏度，时间为 5 - 60分钟，优选65摄氏度，时间30分钟；
S36用于将步骤S35中的试管R进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3- 10 分钟，优选98摄氏度，时间10分钟；
S37用于将步骤S36中的试管R进行低温退火，温度为 50 - 72 摄氏度，时间为 1- 60 分钟，优选65摄氏度，时间5分钟；
S38用于将步骤S37中的试管R进行冰水浴，时间为 1 - 60 分钟，优选5分钟。
本领域技术人员可以理解，酶切结束后，高温失活蛋白酶K。
进一步，所述S4用于对试管L和试管R分别用DNA分选磁珠进行分选纯化的步骤，
包括：
S41分别向步骤S23中的试管L和步骤S38中的试管R中加入适量磁珠，并采用一轮法进行分选纯化。本领域技术人员可以理解，磁珠纯化的目的：回收模板，及和其退火的Lp或和其退火/延伸的Rp和Rp’；去除未发生退火的左侧自由探针和右侧自由探针。DNA磁珠纯化：用1.5 ×体积Hieff NGS DNA分选磁珠(翌圣生物，中国)，并按照说明书的纯化流程采用一轮法进行分选纯化。
进一步，所述S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤，包括：
S51用于超量上游引物F和模板核酸中的痕量Lp优先退火和延伸而产生痕量的F’；
S52用于F’和Rp’退火并发生F’的延伸，用的是3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶；本领域技术人员可以理解，F’和Rp’退火和延伸后，在PCR运行过程中自动发生，温度和时间通过PCR设备进行设置，用的是3’->5’外切酶活性的DNA聚合酶。
S53用于上游引物F和下游引物R以步骤S52后的产物为模板进行正常的PCR扩增。
本领域技术人员可以理解，所用PCR聚合酶具有3’->5’外切酶活性。PCR过程中，相比于有限的模板核酸，超量的上游引物F首先和模板核酸中的痕量Lp优先退火和延伸而产生痕量的F’，最后F、F’和下游引物R以Rp’为模板进行正常的PCR扩增。可根据后续实际需求，在F和R的5’端引入侧翼序列。PCR扩增：PCR所用聚合酶为Q5热启动高保真DNA聚合酶(Q5Hot Start High-fidelity DNA Polymerase，简称Q5聚合酶) (NEB，美国)，并按照其说明书配置反应体系和扩增。所述上游引物F和下游引物R均为现有技术，在此不在赘述。
进一步，本实施例1，实施例3-实施例6所采用的模板核酸为含有EGFP全长的质粒，即pcDNA3.1(+)-EGFP。实施例2所采用的模板核酸为含有GFP1的质粒，即pcDNA3.1(+)-GFP1。实施例1-实施例6的模板使用量为50 ng。实施例1-实施例6所用到的相关核苷酸序列如表1。
表1：实施例1-实施例6所用到的相关核苷酸序列
实施例1：
用于对试管R发生和模板核酸退火并一次延伸和仅仅发生模板核酸退火后（图2和图3），均继续完成剩余的相同步骤（图1），包括PCR。通过PCR产物的比较，发生退火程序和一次延伸后的试管R（TubeR）进行PCR扩增后，电泳胶图中的“TubeR”泳道条带的亮度明显亮于“TubeR’”泳道的条带，说明试管R扩增后的产物浓度明显高于仅仅发生退火程序的试管R’（TubeR’）（图4）。
试管L、试管R和试管R’的反应体系如表2；
表2：试管L、试管R和试管R’的反应体系
本领域技术人员可以理解，试管R’导致PCR产物减少的原因为：若右侧自由探针仅仅和模板核酸发生退火而不延伸，当将管L和试管R’分别磁珠纯化后，之后同时以两个纯化产物为模板进行的PCR扩增过程中，Rp和Lp可能同时退火到同一个模板核酸分子上，因为Q5聚合酶的链置换活性极低[24]，因此，相比于Rp’，绝大多数退火的Lp阻挡了Rp的延伸，导致所延伸的产物不包含Lp对应的退火位置，最终导致扩增产物减少（图5）。
进一步，进行磁珠纯化的目的，是通过磁珠纯化可以去除左侧自由探针和右侧自由探针；
实施例2：
用于将质粒pGFP1和右侧探针GFP2Rp（图7）混合后，1、通过磁珠纯化后，通过电泳胶图（图6）发现，胶图中“+”泳道只存在一个条带，说明磁珠纯化后试管中只存在pGFP1，GFP2Rp已经被去除了；2、不通过磁珠纯化，通过电泳胶图发现，胶图中“-”泳道仍然存在两条条带，说明没有通过磁珠纯化的试管内仍然含有pGFP1和GFP2Rp， GFP2Rp没有被去除。
pGFP1为含有所述GFP1序列的质粒(pcDNA3.1(+)-GFP1)；GFP2Rp为GFP2区段对应的右侧自由探针区段（图7）。
实施例3：
用于试管L中进行质粒pEGFP和3个左侧自由探针（图7）的退火程序，试管R中进行pEGFP和3个右侧自由探针（图7）的退火程序和一次延伸，之后混合试管L和试管R， 1、通过磁珠纯化后，电泳胶图显示“+”泳道只存在一条条带，说明混合后，试管中只存在pEGFP；2、没有通过磁珠纯化后，电泳胶图显示“-”泳道存在两条条带，说明混合后，自由探针并没有被去除（图6）。
本领域技术人员可以理解，上述实施例2和实施例3表明，经过磁珠纯化能够有效去除混管中的自由探针。
实施例4：
用于对EGFP的3个不同区段分别进行扩增，电泳胶图显示，“GFP1”、“GFP2”、“GFP3”3条泳道均得到相似的扩增条带（图8）；
用于对EGFP的3个不同区段同时进行扩增，通过电泳胶图显示，在“GFP1&2&3”泳道有明亮的主带，同时亦有较大的微弱的扩增条带出现（图8）；
用于对EGFP的3个不同区段进行扩增实施例，3个所述不同区段为EGFP上的GFP1、GFP2、GFP3三个区段（图7）。
实施例5：
就同时富集/扩增的产物进行PCR产物纯化并克隆和测序，实施例结果表明：
在所成功测序的18个克隆中，6个克隆特异比对到GFP1，4个克隆特异比对到GFP2，7个克隆特异比对到GFP3，另外还有1个克隆同时比对到GFP2和GFP3 即连接产物较大（图8和图9）；连接产物较大的原因可能是GFP3Rp延伸时，所用的Q5 DNA聚合酶因为微弱的链置换活性[24]置换掉下游的GFP2Rp所致（图10）。
本领域技术人员可以理解，DNA产物的克隆和测序：用MolPure PCR纯化试剂盒(翌圣生物，中国)回收Q5聚合酶扩增的PCR产物，然后用Hieff Taq DNA聚合酶(翌圣生物，中国)并按照其说明书配置反应体系，并于72℃处理10分钟，以便在DNA 3’末端添加碱基A。将添加碱基A的DNA产物用Hieff Clone零背景TOPO-TA克隆试剂盒(翌圣生物，中国)进行TA连接。或者回收的PCR产物直接用Hieff Clone零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(翌圣生物，中国)进行连接。连接的产物转化E. coli Top10感受态细胞、涂布加氨苄的LB平板、挑取单克隆(无需蓝白斑筛选)培养并用于测序。测序所用引物为载体通用测序引物，即M13反向测序引物。
自由探针会抑制PCR扩增，为此通过如下实施例6验证：
实施例6：
“Template: 13.4 μL”： 20 μL的PCR体系全部用磁珠纯化前或纯化后的模板补齐；“Template: 0.5 μL”：20μL的PCR体系中加入0.5 μL的磁珠纯化前或纯化后的模板，剩余体积(即12.9 μL)用水补齐。所用核酸模板为对应于GFP1、GFP2、GFP3同时进行扩增时(即3个左侧自由探针和pEGFP退火，3个右侧自由探针和pEGFP退火延伸并蛋白酶K处理)所对应的磁珠纯化前或纯化后的模板；NTC：无模板对照。本领域技术人员可以理解，不同于磁珠纯化后的模板，当加入大体积的磁珠纯化前的模板时抑制PCR的扩增，且出现了非特异扩增条带（图11）。
通过分析发现:
磁珠纯化前,体系中含有大量的Q5 Reaction Buffer（Q5反应缓冲液）、dNTPs（脱氧核糖核苷酸）和自由探针（free probes），通过磁珠纯化后，体系中不含有Q5 ReactionBuffer、dNTPs和Freeprobes（图12）；
在某些情况下，核酸中的靶核酸含量极低，因此为了捕捉到该类核酸，需要在PCR体系中尽可能的加入大体积(或者所有)的模板。不同于磁珠纯化后的模板，当加入大体积的磁珠纯化前的模板时抑制PCR的扩增，且出现了非特异扩增条带。相比于磁珠纯化后，磁珠纯化前的模板中含有Q5 Reaction Buffer、dNTPs、自由探针、Q5DNA聚合酶。为了进一步明确具体抑制PCR的成分，在PCR时模拟了加入大体积磁珠纯化前模板对应的高浓度Q5Reaction Buffer、高浓度dNTPs、高浓度自由探针，结果显示高浓度自由探针抑制了PCR扩增，该非特异扩增条带可能来自于上游引物F和左侧自由探针之间的相互退火扩增，另外，本实施例结果显示高浓度的Q5 Reaction Buffer亦对PCR扩增效率有所影响（图13），其中图13记载的conc.代表concentration/浓度。
进一步，本实施例7所采用的模板核酸为人源细胞系293T的基因组DNA（模板使用量为150 ng），检测的靶标为来自于人基因组的3个DNA片段。所用到的相关核苷酸序列如表3：
表3：实施例7用到的相关核苷酸序列
本领域技术人员可以理解，*：3’端的5个磷酸二酯键引入了硫代修饰，目的是阻断磁珠纯化过程中通过核酸间接结合到磁珠的Q5聚合酶对磁珠结合核酸的3’->5’的酶切。
对人的Cg313、Cg540、Cg929片段进行扩增实验，所用gDNA抽提自293T细胞，NTC：无模板对照：
实施例7：
对人的Cg540、Cg313、Cg929片段分别进行扩增及同时进行扩增，通过电泳胶图显示，“Cg540”、“Cg313”、“Cg929”和“Cg540&313&929”四条泳道均得到一致的扩增条带（图14）；
就同时扩增的产物进行PCR产物纯化并克隆和测序，在所成功测序的30个克隆中，7个克隆特异比对到Cg540，10个克隆特异比对到Cg313，9个克隆特异比对到Cg929，另外4个克隆为引物/探针之间的相互扩增。
实施例1 -实施例4、实施例6、实施例7的PCR产物含有额外的序列（图15），分别为P5、P7：用于在illumina平台测序的序列；i5、i7：index序列；Read1、Read2：read1和read2测序引物结合位点；TsL、TsR：靶标特异的Lp和Rp结合位点。本领域技术人员可以理解，PCR产物含有用于在illumina平台测序的P5和P7序列，因此有用于illuminaNGS平台测序的可能。当然，通过合理改变F/R引物5’端的序列和结构，该LRpM-PCR理论上可以和多种后续的核酸检测平台/技术整合，比如和其他二/三代测序平台[25]或者CRISPR/Cas检测平台整合[20]。
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最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1用于准备带有通用引物结合位点的左侧自由探针、带有通用引物结合位点的右侧自由探针和模板核酸的步骤；
S2用于在试管L中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针Lp，并立即冰水浴的步骤；
S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’ -> 5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤；
S4用于对试管L和试管R分别用DNA分选磁珠进行分选纯化的步骤；
S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤；
所述S2用于在试管L中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针Lp，并立即冰水浴的步骤，包括：
S21用于对试管L进行高温变性，温度为90 - 100摄氏度，时间为3 - 10分钟；
S22用于对高温变性后的试管L进行低温退火，温度为50 - 72摄氏度，时间为1 - 60分钟；
S23用于对低温退火后的试管L进行冰水浴，时间为1 - 60分钟；
所述S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’-> 5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤，包括：
S31用于对试管R进行高温变性，温度为90 - 100摄氏度，时间为3 - 10分钟；
S32用于对高温变性后的试管R进行低温退火，温度为50 - 72摄氏度，时间为1 - 60分钟；
S33用于向低温退火后的试管R中使用具有3’-> 5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸，保持温度为65 - 72摄氏度，时间为5 - 60秒；
S34用于将延伸后的试管R进行冰水浴，时间为1 - 60分钟；
所述S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤，包括：
S51用于超量上游引物F和模板核酸中的痕量左侧探针Lp优先退火和延伸而产生痕量的F’；
S52用于F’和Rp’退火并发生F’的延伸，用的是3’-> 5’外切酶活性的DNA聚合酶；
S53用于上游引物F和下游引物R以步骤S52后的产物为模板进行正常的PCR扩增。
2.如权利要求1所述的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，所述S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’ -> 5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤，还包括：
S35用于向步骤S34中的试管R中加入蛋白酶K以降解DNA聚合酶，温度为37 - 65 摄氏度，时间为 5 - 60分钟；
S36用于将步骤S35中的试管R进行高温变性，温度为90 - 100摄氏度，时间为3 - 10分钟；
S37用于将步骤S36中的试管R进行低温退火，温度50 - 72摄氏度，时间为1 - 60 分钟；
S38用于将步骤S37中的试管R进行冰水浴，时间为1 - 60分钟。
3.如权利要求2所述的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，所述S4用于对试管L和试管R分别用DNA分选磁珠进行分选纯化的步骤，
包括：
S41分别向步骤S23中的试管L和步骤S38中的试管R中加入适量磁珠，并采用一轮法进行分选纯化。
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