CN117337971A - 一种含鹿茸的组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鹿茸的组合物的制备方法，包括：将鹿茸研磨成粉末，加入有机酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶酶解，结束后升温并缓慢滴加碳酸氢钠溶液调节溶液pH，滴加完毕后将体系温度保持一段时间得到酶解液；将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液混合并搅拌，之后冷冻干燥，将所得固体粉末与聚氨基酸混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，在得到的混合溶液中加入磷脂分子然后于常温下搅拌，得到混合液I；在上述混合液I中加入维生素和脂肪酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到终产品。本发明的组合物成分简单，能够有效提高机体免疫力长期食用亦可以降低血脂及胆固醇水平。

Description

一种含鹿茸的组合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于保健食品技术领域，具体而言，涉及一种含鹿茸的组合物及其制备方法与应用。
背景技术
鹿茸来源于鹿科动物属花鹿(Cervus nippon)或马鹿(Cervus elaphus)的雄鹿生长中未骨化且伴有微细茸毛的幼角，为补阳益血的良药，具有极高的药用价值。鹿茸由软骨或骨及附着的皮肤、血管、神经等组成，是当前知道的唯一可以完全再生的哺乳动物器官。《素问》中记载“肾者，封藏之本，精之处也，其充在骨”。现代亦有研究发现骨骼的生长发育和肾精-脑髓-骨髓的关系密切。现代药理学发现鹿茸主要活性成分有鹿茸多肽、鹿茸多糖、鹿茸多胺、蛋白质、氨基酸、性激素及脂溶性成分。研究表明，花鹿茸因含大量的脂肪酸、蛋白质、磷脂等成分，在免疫调节、预防骨质疏松、抗癌、抗炎等方面具有重要作用；马鹿茸含有的多肽在促进表皮细胞增殖能力上优于花鹿茸。
目前，现有技术中关于鹿茸的组合物也有公开。例如，申请号为CN201410149383.9的中国发明专利公开了一种含有鹿茸和橄榄萃取物的组合物，该组合物可作为抗氧化剂在食品、健康食品或医药品使用，其中鹿茸和橄榄萃取物两者重量比例为1～50:1～1000，所述组合物能明显的抑制和清除活性氧自由基中超氧阴离子自由基和羟基自由基。又如，申请号为CN02141031.3的中国发明专利公开了一种鹿茸组合物及其制备方法，其由特定比例的β-环糊精(β-cyclodextrin)、高酯类、蛋白酶抑制剂与有机溶剂所形成的包覆基材，与鹿茸抽取物混合而制得；其中该包覆基材与该鹿茸抽取物的重量比为1∶1.5至1∶2.7。该鹿茸组合物具有良好活性与稳定性质，并可于人体中维持稳定释放。
尽管关于鹿茸及相关的产品有相当数量的公开，但是这些组合物通常还具有多种补体的其他中药成分，一方面提高制作成本，另一方面没有充分发挥鹿茸的功效。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种含鹿茸的组合物及其制备方法与应用。本发明的组合物成分简单，能够有效提高机体免疫力，改善肠道健康，长期食用亦可以降低血脂及胆固醇水平，尤其适合糖尿病人群。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的一个方面提供了一种含鹿茸的组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将鹿茸研磨成粉末，加入有机酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶，在40～60℃下酶解8～24小时；酶解结束后升温至80～100℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为80-90wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持20～60min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.03-0.05g的量加入；
将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液按照体积比1:0.01-0.05的量混合并于30-40℃下搅拌处理1-4h，之后将所得溶液于-30～-20℃下冷冻干燥，将所得固体粉末与聚氨基酸按照质量比1:0.3-0.5混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，按照体积质量比100mL：1-5g的量在得到的混合溶液中加入磷脂分子然后于常温下搅拌12-24h，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素和脂肪酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。
进一步地，所述有机酸选自柠檬酸、醋酸、苹果酸、草酸、丁二酸中的任一种。
进一步地，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或二种以上的组合。
进一步地，所述改性乳清蛋白溶液的制备方法如下：将乳清蛋白粉配置成浓度为30-50wt％的水溶液，然后在溶液中加入卤化盐并在100℃～150℃下进行热处理12-36h，得到改性乳清蛋白溶液。
进一步地，所述卤化盐选自氯化亚铁、氯化铁、氯化钙、氯化镁、氯化钙、氯化钠、碘化亚铁、碘化钙、碘化镁、碘化铵、碘化锂和碘化钠中的一种或两种以上的混合物。
进一步地，所述卤化盐按照与乳清蛋白粉质量比0.05-0.09:1的量加入。
进一步地，所述聚氨基酸选自分子量在1×106-2×107之间的聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚甲硫氨酸、聚脯氨酸、聚色氨酸、聚丝氨酸、聚酪氨酸、聚半胱氨酸、聚苯丙氨酸、聚天门冬酰胺、聚谷氨酰胺、聚苏氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚硒半胱氨酸、聚吡咯赖氨酸中的至少一种。
进一步地，所述磷脂分子选自二磷酸磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的任一种。
进一步地，按照每100mL混合液I中分别加入0.03-0.07g维生素和80-150g脂肪酸的量在所述混合液I中加入维生素和脂肪酸。
进一步地，所述维生素选自以下群组中的一种或几种的混合，该群组由维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、维生素H与泛酸组成。
进一步地，所述脂肪酸选自由以下群组中的一种或几种的混合，该群组由硬脂酸、油酸、亚麻仁油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉苴蔻酸与棕榈酸组成。
本发明预期效果与优点如下：
本发明首先对鹿茸进行预处理，将鹿茸研磨成粉末后溶于有机酸溶液中，加入蛋白酶进行酶解，酶解结束后使用碳酸氢钠调节溶液pH至弱碱性，继续保温一段时间得到酶解液，这样可以使鹿茸中所含蛋白质酶解成分子量更小的物质，碱性环境能够保持酶解液活性物质性能稳定。之后与改性乳清蛋白液混合搅拌处理，本发明的改性乳清蛋白液是以乳清蛋白粉为原料，以卤化盐为改性剂进行改性得到的一种物质，该物质中结合了矿物质元素和卤元素，且相对于乳清蛋白粉活性高，能够与酶解液进行反应，通过共价键和范德华力，可以将乳清蛋白和酶解液中的多肽、氨基酸等物质结合起来，之后与聚氨基酸混合后在氯仿/甲醇混合溶液中用磷脂分子进行包封，形成一种稳定体系的物质，该物质能够保持鹿茸中的活性物质的稳定性，可于人体中维持稳定释放，促进人体对有效物质的吸收。本发明的组合物成分简单，无毒性、能够有效提高机体免疫力，改善肠道健康，长期食用亦可以降低血脂及胆固醇水平，尤其适合糖尿病人群。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
将乳清蛋白粉配置成浓度为40wt％的水溶液，然后在溶液中加入氯化亚铁并在130℃下进行热处理24h，得到改性乳清蛋白溶液。上述氯化亚铁按照与乳清蛋白粉质量比0.07:1的量加入。
将鹿茸研磨成粉末，加入15wt％柠檬酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶按照质量比1:1:2的混合)，在50℃下酶解16小时；酶解结束后升温至90℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为85wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持40min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.04g的量加入；
将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液按照体积比1:0.03的量混合并于35℃下搅拌处理2.5h，之后将所得溶液于-25℃下冷冻干燥，将所得固体粉末与聚丙氨基酸(分子量在1×106-2×107之间)按照质量比1:0.4混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，按照体积质量比100mL：3g的量在得到的混合溶液中加入二磷酸磷脂酰肌醇然后于常温下搅拌18h，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E按照质量比1:1:1:1:1:1:1:1的混合)和硬脂酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。上述按照每100mL混合液I中分别加入0.05g维生素和115g硬脂酸的量加入。
实施例2：
将乳清蛋白粉配置成浓度为50wt％的水溶液，然后在溶液中加入氯化钙并在100℃下进行热处理36h，得到改性乳清蛋白溶液。上述氯化钙按照与乳清蛋白粉质量比0.09:1的量加入。
将鹿茸研磨成粉末，加入浓度20wt％醋酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶按照质量比1:1:2:1的混合)，在40℃下酶解24小时；酶解结束后升温至100℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为80wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持60min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.05g的量加入；
将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液按照体积比1:0.05的量混合并于40℃下搅拌处理1h，之后将所得溶液于-30℃下冷冻干燥，将所得固体粉末与聚甘氨基酸(分子量在1×106-2×107之间)按照质量比1:0.3混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，按照体积质量比100mL：5g的量在得到的混合溶液中加入二硬脂酰磷脂酰甘油然后于常温下搅拌24h，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E按照质量比1:1:1:1:1:1:1:1的混合)和月桂酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。上述按照每100mL混合液I中分别加入0.03g维生素和150g月桂酸的量加入。
实施例3：
将乳清蛋白粉配置成浓度为30wt％的水溶液，然后在溶液中加入碘化钙并在150℃下进行热处理12h，得到改性乳清蛋白溶液。上述碘化钙按照与乳清蛋白粉质量比0.09:1的量加入。
将鹿茸研磨成粉末，加入浓度10wt％苹果酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶按照质量比1:1:1的混合)，在40℃下酶解8小时；酶解结束后升温至80℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为90wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持20min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.03g的量加入；
将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液按照体积比1:0.01的量混合并于30℃下搅拌处理4h，之后将所得溶液于-20℃下冷冻干燥，将所得固体粉末与聚亮氨基酸(分子量在1×106-2×107之间)按照质量比1:0.5混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，按照体积质量比100mL：1g的量在得到的混合溶液中加入二硬脂酰磷脂酰胆碱然后于常温下搅拌12h，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E按照质量比1:1:1:1:1:1:1:1的混合)和肉苴蔻酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。上述按照每100mL混合液I中分别加入0.07g维生素和80g肉苴蔻酸的量加入。
对比实施例1：
将鹿茸研磨成粉末，加入15wt％柠檬酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶按照质量比1:1:2的混合)，在50℃下酶解16小时；酶解结束后升温至90℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为85wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持40min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.04g的量加入；
将上述酶解液于-25℃下冷冻干燥，将所得固体粉末与聚丙氨基酸(分子量在1×106-2×107之间)按照质量比1:0.4混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，按照体积质量比100mL：3g的量在得到的混合溶液中加入二磷酸磷脂酰肌醇然后于常温下搅拌18h，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E按照质量比1:1:1:1:1:1:1:1的混合)和硬脂酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。上述按照每100mL混合液I中分别加入0.05g维生素和115g硬脂酸的量加入。
对比实施例2：
将乳清蛋白粉配置成浓度为40wt％的水溶液，然后在溶液中加入氯化亚铁并在130℃下进行热处理24h，得到改性乳清蛋白溶液。上述氯化亚铁按照与乳清蛋白粉质量比0.07:1的量加入。
将鹿茸研磨成粉末，加入15wt％柠檬酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶按照质量比1:1:2的混合)，在50℃下酶解16小时；酶解结束后升温至90℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为85wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持40min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.04g的量加入；
将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液按照体积比1:0.03的量混合并于35℃下搅拌处理2.5h，之后将所得溶液于-25℃下冷冻干燥，将所得固体粉末与聚丙氨基酸(分子量在1×106-2×107之间)按照质量比1:0.4混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E按照质量比1:1:1:1:1:1:1:1的混合)和硬脂酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。上述按照每100mL混合液I中分别加入0.05g维生素和115g硬脂酸的量加入。
对比实施例3：
将乳清蛋白粉配置成浓度为40wt％的水溶液，然后在溶液中加入氯化亚铁并在130℃下进行热处理24h，得到改性乳清蛋白溶液。上述氯化亚铁按照与乳清蛋白粉质量比0.07:1的量加入。
将鹿茸研磨成粉末，加入15wt％柠檬酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶按照质量比1:1:2的混合)，在50℃下酶解16小时；酶解结束后升温至90℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为85wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持40min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.04g的量加入；
将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液按照体积比1:0.03的量混合并于35℃下搅拌处理2.5h，之后将所得溶液于-25℃下冷冻干燥，将所得固体粉末加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，按照体积质量比100mL：3g的量在得到的混合溶液中加入二磷酸磷脂酰肌醇然后于常温下搅拌18h，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E按照质量比1:1:1:1:1:1:1:1的混合)和硬脂酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。上述按照每100mL混合液I中分别加入0.05g维生素和115g硬脂酸的量加入。
试验例1：急性毒性试验
半数致死量(LD50)预试验：取清洁级昆明种小鼠20只，体质量18-22g，雌、雄各半，随机分为2组，每组10只。将实施例1的组合物按照可灌胃的最大浓度1.0g/mL、最大体积0.4mL灌胃给药1次(相当于成人临床用量的500倍)，对照组给以等体积的生理盐水，连续观察7天发现。结果发现，7天内小鼠无任何异常，因此根据预试验结果不能测出半数致死量(LD50)，遂对增强人体免疫力的组合物进行最大耐受量试验。
最大耐受量试验：取清洁级昆明种小鼠40只，体质量18-22g，雌、雄各半，分为药物组(给予实施例1的组合物)和对照组，每组20只。药物组以药物的最高浓度(1.0g/mL)于24h内灌胃3次，每次给药0.4mL，间隔6h，给药总量为1.2g/d。空白对照组给以等体积的生理盐水。给药前12h和给药期间均禁食但不禁水，末次给药4h后正常喂养，每天称小鼠体重，观察7天。观察指标如下：大鼠的精神状态、活动变化、进食情况、粪便性状及大鼠死亡只数。如果发现有大鼠死亡，立即对死亡大鼠进行尸检，并肉眼观察重要脏器的病理形态学变化。
最大给药量试验结果显示，小鼠以最高浓度(1.0g/mL)于24h内灌胃3次实施例1的组合物后，小鼠精神状态良好，毛色光亮，饮水摄食正常，给药前、后小鼠体质量均与对照组无统计学差异，表明本发明的含鹿茸的组合物对小鼠无急性毒性。
试验例2：长期毒性试验
取清洁级SPraque-Dawley健康SD大鼠40只，体质量220±5.78g，雌、雄各半，分为高、中、低3个剂量组(实施例1的组合物)和1个对照组，每组10只。剂量组浓度分别为1.0、0.5、0.25g/mL，给药量为2mL，每天1次，连续灌胃给药30d。整个试验期间，每天观察并记录大鼠一般行为表现及死亡情况，每周称量大鼠体质量1次，30d后检测动物体重、血液学、脏器质量等指标综合评价药物的毒性情况。结果见表1-3所示。
表1不同剂量组大鼠体重变化情况
表2不同剂量组大鼠白细胞、红细胞、血小板计数变化情况
组别 白细胞计数(109/L) 红细胞计数(1012/L) 血小板计数(109/L)
低剂量组 3.89±1.34 8.63±1.42 832±5
中剂量组 4.12±1.27 8.65±1.27 839±7
高剂量组 4.63±1.18 8.64±1.35 847±9
对照组 4.37±1.31 8.63±1.41 845±7
表3不同剂量组大鼠心脏系数、肾脏系数及肝脏系数
组别 心脏系数(％) 肾脏系数(％) 肝脏系数(％)
低剂量组 0.38±0.13 0.63±0.12 3.45±0.82
中剂量组 0.38±0.09 0.65±0.17 3.48±1.01
高剂量组 0.38±0.12 0.64±0.15 3.51±1.03
对照组 0.37±0.18 0.64±0.11 3.47±0.91
上述表1-3的结果显示：大鼠给药后30天，给药组(给予实施例1的组合物)大鼠体重、血液学指标(白细胞、红细胞、血小板)与对照组均无显著差别(参见表1-2)。30天后处死大鼠，解剖未发现有明显的脏器病变，各组脏器系数无明显差异(参见表3)。结果表明长期用药安全。
试验例3：不同含鹿茸组合物对高血糖小鼠的降血糖及降血脂作用效果的影响
实验对象：实施例1-3级对比实施例1-3
实验方法：
健康雄性昆明小鼠，清洁级，均购于第四军医大学实验动物中心，体重22±5g；标准饲料、自来水喂养于恒温25℃、恒湿55±5％动物实验室一周。按照随机数表法随机分组，分别为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、实施例1-3组、对比例1-3组。每组10只。
将选取的70只小鼠禁食12h，然后按200mg/kg腹腔注射2％四氧嘧啶，72h后测定血糖，若小鼠空腹血糖浓度>16.0mmol/L，判断制备高血糖小鼠动物模型造模成功。
实施例1-3组、对比例1-4组灌胃给药，每天1次，连续给药7天，给药0.5g/kg，给药体积为0.1mL/10g。空白对照组、模型对照组分别给予等量的蒸馏水；阳性对照组给予盐酸二甲双胍混悬液130mg/kg，给药2周。
各组动物给药2周后，每组小鼠禁食不禁水12h后，剪尾取血测定血糖值。并取血测定血清中总甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白的水平。实验数据均用SPSS13.0软件进行统计学处理，血糖值以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。
实验结果：见表4-5。
表4不同含鹿茸组合物降血糖作用效果
注：同一列不同字母表示相应组之间具有统计学差异，P＜0.05。
表5不同含鹿茸组合物降血脂作用效果
注：同一列不同字母表示相应组之间具有统计学差异，P＜0.05。
由表4中模型组可知，模型小鼠给药前血糖值为25.93±1.78mmol/L，相比空白组，血糖明显升高，且二者之间具有显著的统计学差异，表明造模成功。各组模型组小鼠在给药前血糖无统计学差异。给药2周后，阳性组、实施例1-3组与对比实施例1-3组、模型组间的血糖值具有显著的统计学差异(p＜0.05)，由表1-2可知，与对比实施例1-3相比，本发明实施例1-3的含鹿茸组合物在显著降低小鼠血糖的同时，还具有改善糖尿病小鼠血脂的作用。
试验例4：不同含鹿茸组合物的增强免疫力功能试验
实验对象：实施例1-3及对比实施例1-3
实验方法：
SPraque-Dawley健康SD大鼠，清洁级，均购于第四军医大学实验动物中心，体重158.79±5.63g；标准饲料、自来水喂养于恒温25℃、恒湿55±5％动物实验室一周。按照随机数表法随机分组，分别为空白对照组、实施例1-3组、对比例1-3组。每组10只。其中，实施例1-3组及对比例1-3组分别按照给药浓度0.5g/mL的量灌胃实施例1-3及对比实施例1-3的组合物，空白对照组灌胃等量的生理盐水。连续灌胃给药30d，各组给药体积均为2mL。
采用MTT法检测ConA诱导的大鼠淋巴细胞增殖转化功能，采用脱臼法处死大鼠后，剪取脾脏磨碎后过滤离心，每1份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，一孔加入ConA液，另一孔作对照，置于5％CO2、37℃培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸取上清液，加入不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT溶液，继续培养4h后，加入酸性异丙醇，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值(OD值)。以加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示淋巴细胞的增殖能力。
采用乳酸脱氢酶测定法检测NK细胞活性。实验前24h将YAC-1细胞(靶细胞)进行传代培养。大鼠处死取脾，磨碎后过滤离心，取底层细胞，加入灭菌注射用水和Hank’s液后离心。取靶细胞和效应细胞，加入96孔培养板中。靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton，上述各项均设三个平行孔，于培养箱中培养4h后离心。每孔吸取上清液加入LDH基质液，每孔加入HCL，用酶标仪在490nm波长处测定光密度值。
NK细胞活性＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％。
实验结果：具体测试数值参见下表6。
表6大鼠的淋巴细胞增值转化功能和NK细胞活性测定
组别 淋巴细胞增殖能力(OD差值) NK细胞活性(％)
空白组 0.372±0.021 24.17±1.42
实施例1 0.415±0.018 26.82±1.87
实施例2 0.417±0.048 26.39±2.15
实施例3 0.403±0.037 25.99±1.98
对比实施例1 0.381±0.026 24.97±1.76
对比实施例2 0.379±0.034 24.36±1.15
对比实施例3 0.375±0.046 24.24±1.53
由上表6可以看出，与空白组相比，本发明实施例1-3及对比实施例1-3的组合物均能提高淋巴细胞增殖转化功能和NK细胞活性；与对比实施例1-3相比，实施例1-3组各指标数值上均优于对比实施例1-3，这说明本发明实施例1-3的组合物为最佳组合方式，缺少其中的任一种成分可能会降低其增强免疫的效能。综上所述，本发明的组合物在医药、保健品领域具有良好的应用前景。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种含鹿茸的组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将鹿茸研磨成粉末，加入有机酸溶液搅拌均匀后再加入蛋白酶，在40～60℃下酶解8～24小时；酶解结束后升温至80～100℃，在升温过程中缓慢滴加浓度为80-90wt％碳酸氢钠溶液调节溶液pH＝7-8，滴加完毕后将体系温度保持20～60min得到酶解液；所述鹿茸、蛋白酶按照质量体积比1g：0.03-0.05g的量加入；
将上述酶解液与改性乳清蛋白溶液按照体积比1:0.01-0.05的量混合并于30-40℃下搅拌处理1-4h，之后将所得溶液于-30～-20℃下冷冻干燥，将所得固体粉末与聚氨基酸按照质量比1:0.3-0.5混合后加入到氯仿/甲醇混合溶液中超声分散均匀，按照体积质量比100mL：1-5g的量在得到的混合溶液中加入磷脂分子然后于常温下搅拌12-24h，得到混合液I；
在上述混合液I中加入维生素和脂肪酸搅拌均匀之后真空冷冻干燥，得到所述含鹿茸的组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机酸选自柠檬酸、醋酸、苹果酸、草酸、丁二酸中的任一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或二种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述改性乳清蛋白溶液的制备方法如下：将乳清蛋白粉配置成浓度为30-50wt％的水溶液，然后在溶液中加入卤化盐并在100℃～150℃下进行热处理12-36h，得到改性乳清蛋白溶液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述卤化盐选自氯化亚铁、氯化铁、氯化钙、氯化镁、氯化钙、氯化钠、碘化亚铁、碘化钙、碘化镁、碘化铵、碘化锂和碘化钠中的一种或两种以上的混合物。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述卤化盐按照与乳清蛋白粉质量比0.05-0.09:1的量加入。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚氨基酸选自分子量在1×106-2×107之间的聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚甲硫氨酸、聚脯氨酸、聚色氨酸、聚丝氨酸、聚酪氨酸、聚半胱氨酸、聚苯丙氨酸、聚天门冬酰胺、聚谷氨酰胺、聚苏氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚硒半胱氨酸、聚吡咯赖氨酸中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂分子选自二磷酸磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的任一种。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述维生素选自以下群组中的一种或几种的混合，该群组由维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、维生素H与泛酸组成。
10.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪酸选自由以下群组中的一种或几种的混合，该群组由硬脂酸、油酸、亚麻仁油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉苴蔻酸与棕榈酸组成。
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