CN117327774A - 一种单细胞快速测序分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单细胞快速测序分析方法,属于基因测序技术领域。本发明先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置,汇聚形成层流,再与液滴生成油汇聚,形成单分散的微滴,随后裂解微滴,最后进行PCR扩增,并进行测序分析。本发明于细胞悬浮液中添加了聚乙烯醇,于带有分子条形码的微珠悬浮液中添加了聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮,当二者被泵至同一滴液滴生成油中时,聚乙烯醇、聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮协同增加所生成的微滴的稳定性,有效降低了微滴的破损率,同时聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮还可以提高mRNA富集于Poly(dT)的效率,从而提高样本有效率,避免造成浪费。
Description
技术领域
本发明属于基因测序技术领域,涉及一种单细胞快速测序分析方法。
背景技术
细胞是生物结构与功能的基本单位,形态类型千差万别。通过细胞基因组学,可以描述细胞特性及功能,但易用性和规模的限制阻碍了其广泛应用。
单细胞(single-cell)高通量液滴测序(Drop-seq)技术,是该技术将细胞隔离在微小的液滴中,装上用于扩增的条码引物,由此检测数以千计的细胞。Drop-seq能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞,绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱,更好地了解干细胞分化,获得更多疾病的遗传学信息。但该技术中的油相不能很好地包裹水相,导致细胞被裂解前液滴已经破损,从而导致Poly(dT)不能高效富集mRNA,影响后续的测序结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单细胞快速测序分析方法,具有良好的微滴稳定性及Poly(dT)富集mRNA效率高的特点。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
一种单细胞快速测序分析方法,包含以下步骤:先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置,汇聚形成层流,再与液滴生成油汇聚,形成单分散的微滴,随后裂解微滴,最后进行PCR扩增,并进行测序分析。
作为本发明的一种优选技术方案,所述的微流体装置包含:核心为一块玻璃微流控芯片,其联通四个输入管道及一个输出管道。
作为本发明的一种优选技术方案,所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成,其引物的序列包含四个部分:PCR primer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
作为本发明的一种优选技术方案,所述的微滴具体通过以下步骤得到:
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中;在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子,通过磁力搅拌器控制;
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中,四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道,并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h,液滴生成油的流速为14mL/h;
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况;将微滴收集在离心管中;
W4.在微滴生成期间,通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
作为本发明的一种优选技术方案,所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离步骤或骨髓血PBMC分离步骤得到;
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作:
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液;
X2.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用;
X3.吸取稀释血液,在离淋巴细胞分离液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上,并与淋巴细胞分离液形成明显界面;
X4.离心,此时离心管中形成4层:第一层为稀释液层,第二层为呈白膜状的单个核细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层;
X5.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,加5倍体积的PBS缓冲液洗1~2次,每次300ⅹg离心10min;
X6.离心完成后弃上清,加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬,控制单个核细胞的浓度为60个/μL;
所述的骨髓血PBMC分离步骤包含以下操作:
Y1.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用;
Y2.按体积比5:1取骨髓血加入PBS缓冲液稀释血液,300ⅹg离心5min;然后弃上清,加入3倍体积PBS缓冲液稀释血液,300ⅹg离心10min;
Y3.离心完成后弃上清,加入2倍骨髓血体积的PBS缓冲液,重悬,过滤,得到预处理骨髓血;
Y4.吸取预处理骨髓血,在离淋巴细胞分离液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使预处理骨髓血重叠于淋巴细胞分离液上,并与淋巴细胞分离液形成明显界面;
Y5.离心,此时离心管中形成5层:最上层是血浆,血浆和淋巴细胞分离液之间是呈白膜状的单个核细胞层;
Y6.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,加5倍体积的PBS缓冲液洗1~2次,每次300ⅹg离心10min;
Y7.离心完成后弃上清,加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬,控制单个核细胞的浓度为60个/μL。
作为本发明的一种优选技术方案,所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备:
将带有分子条形码的微珠先后用100%乙醇洗两次和TE/TW洗两次,1000ⅹg离心1min,然后弃上清,再用TE/TW重悬,用100μm过滤器过滤,放入离心管中,加入的DropSeqlysis buffer洗涤,1000ⅹg离心1min,弃上清;然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mMDTT的混合液中,并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮,控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL;
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01%Tween;
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6%Ficoll PM-400、0.2%Sarkosyl及20mM EDTA。
作为本发明的一种优选技术方案,步骤X6及Y7所述的PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为3~5:2~4。
作为本发明的一种优选技术方案,所述的混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为35~40:7~9:1~3。
作为本发明的一种优选技术方案,所述的裂解微滴包含以下操作:
Z1.在室温下添加6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中,然后用移液管吸去微滴底部的油;
Z2.加全氟-1-辛醇,摇晃试管20s使微滴破乳,然后以1000ⅹg离心1min。
本发明的有益效果:
本发明于细胞悬浮液中添加了聚乙烯醇,于带有分子条形码的微珠悬浮液中添加了聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮,当二者被泵至同一滴液滴生成油中时,聚乙烯醇、聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮协同增加所生成的微滴的稳定性,有效降低了微滴的破损率,同时聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮还可以提高mRNA富集于Poly(dT)的效率,从而提高样本有效率,避免造成浪费。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合实施例,对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效,详细说明如下。
实施例1
一种单细胞快速测序分析方法,包含以下步骤:先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置,汇聚形成层流,再与液滴生成油汇聚,形成单分散的微滴,随后裂解微滴,最后进行PCR扩增,并进行测序分析。
所述的微流体装置包含:核心为一块玻璃微流控芯片,其联通四个输入管道及一个输出管道。
所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成,其引物序列包含四个部分:PCRprimer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
所述的微滴具体通过以下步骤得到:
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中;在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子,通过磁力搅拌器控制;
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中,四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道,并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h,液滴生成油的流速为14mL/h;
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况;将微滴收集在50mL离心管中;
W4.在微滴生成期间,通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离得到;
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作:
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液;
X2.取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用;
X3.吸取稀释血液,在离淋巴细胞分离液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上,并与淋巴细胞分离液形成明显界面;
X4.2000rpm离心20min,此时离心管中形成4层:第一层为稀释液层,第二层为呈白膜状的单个核细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层;
X5.小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,尽量全部吸出单个核细胞,加5倍以上体积的PBS缓冲液洗1次,300ⅹg离心10min;
X6.离心完成后弃上清,加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬,PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为3:2,控制单个核细胞的浓度为60个/μL;
所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备:
将带有分子条形码的微珠先后用30ml 100%乙醇洗两次和30mL TE/TW洗两次,1000ⅹg离心1min,然后弃上清,再用10mL TE/TW重悬,用100μm过滤器过滤,放入50mL离心管中,加入500μL的DropSeq lysis buffer洗涤,1000ⅹg离心1min,弃上清;然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中,并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮,控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL,混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为35:7:1;
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01%Tween;
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6%Ficoll PM-400、0.2%Sarkosyl及20mM EDTA。
所述的裂解微滴包含以下操作:
Z1.在室温下添加30mL 6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中,然后用移液管吸去微滴底部的油;
Z2.加600μL全氟-1-辛醇,摇晃试管20s使微滴破乳,然后以1000ⅹg离心1min。
实施例2
一种单细胞快速测序分析方法,包含以下步骤:先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置,汇聚形成层流,再与液滴生成油汇聚,形成单分散的微滴,随后裂解微滴,最后进行PCR扩增,并进行测序分析。
所述的微流体装置包含:核心为一块玻璃微流控芯片,其联通四个输入管道及一个输出管道。
所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成,其引物序列包含四个部分:PCRprimer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
所述的微滴具体通过以下步骤得到:
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中;在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子,通过磁力搅拌器控制;
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中,四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道,并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h,液滴生成油的流速为14mL/h;
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况;将微滴收集在50mL离心管中;
W4.在微滴生成期间,通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
所述的细胞悬浮液通过骨髓血PBMC分离得到;
所述的骨髓血PBMC分离步骤包含以下操作:
Y1.取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用;
Y2.按体积比5:1取骨髓血加入PBS缓冲液稀释血液,300ⅹg离心5min;然后弃上清,加入PBS缓冲液按3:1稀释血液,300ⅹg离心10min;
Y3.离心完成后弃上清,加入2倍骨髓血体积的PBS缓冲液,重悬,过滤,得到预处理骨髓血;
Y4.吸取预处理骨髓血,在离淋巴细胞分离液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使预处理骨髓血重叠于淋巴细胞分离液上,并与淋巴细胞分离液形成明显界面;
Y5.2000rpm离心20min,此时离心管中形成5层:最上层是血浆,血浆和淋巴细胞分离液之间是呈白膜状的单个核细胞层;
Y6.小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,尽量全部吸出单个核细胞,加5倍以上体积的PBS缓冲液洗2次,每次300g离心10min;
Y7.离心完成后弃上清,加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬,PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为4:3,控制单个核细胞的浓度为60个/μL。
所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备:
将带有分子条形码的微珠先后用30ml 100%乙醇洗两次和30mL TE/TW洗两次,1000ⅹg离心1min,然后弃上清,再用10mL TE/TW重悬,用100μm过滤器过滤,放入50mL离心管中,加入500μL的DropSeq lysis buffer洗涤,1000ⅹg离心1min,弃上清;然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中,并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮,控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL,混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为37:8:2;
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01%Tween;
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6%Ficoll PM-400、0.2%Sarkosyl及20mM EDTA。
所述的裂解微滴包含以下操作:
Z1.在室温下添加30mL 6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中,然后用移液管吸去微滴底部的油;
Z2.加600μL全氟-1-辛醇,摇晃试管20s使微滴破乳,然后以1000ⅹg离心1min。
实施例3
一种单细胞快速测序分析方法,包含以下步骤:先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置,汇聚形成层流,再与液滴生成油汇聚,形成单分散的微滴,随后裂解微滴,最后进行PCR扩增,并进行测序分析。
所述的微流体装置包含:核心为一块玻璃微流控芯片,其联通四个输入管道及一个输出管道。
所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成,其引物序列包含四个部分:PCRprimer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
所述的微滴具体通过以下步骤得到:
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中;在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子,通过磁力搅拌器控制;
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中,四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道,并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h,液滴生成油的流速为14mL/h;
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况;将微滴收集在50mL离心管中;
W4.在微滴生成期间,通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离得到;
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作:
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液;
X2.取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用;
X3.吸取稀释血液,在离淋巴细胞分离液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上,并与淋巴细胞分离液形成明显界面;
X4.2000rpm离心20min,此时离心管中形成4层:第一层为稀释液层,第二层为呈白膜状的单个核细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层;
X5.小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,尽量全部吸出单个核细胞,加5倍以上体积的PBS缓冲液洗2次,每次300ⅹg离心10min;
X6.离心完成后弃上清,加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬,PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为5:4,控制单个核细胞的浓度为60个/μL;
所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备:
将带有分子条形码的微珠分别用30ml 100%乙醇洗两次和30mL TE/TW洗两次,1000ⅹg离心1min,然后弃上清,再用10mL TE/TW重悬,用100μm过滤器过滤,放入50mL离心管中,加入500μL的DropSeq lysis buffer洗涤,1000ⅹg离心1min,弃上清;然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中,并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮,控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL,混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为40:9:3;
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01%Tween;
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6%Ficoll PM-400、0.2%Sarkosyl及20mM EDTA。
所述的裂解微滴包含以下操作:
Z1.在室温下添加30mL 6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中,然后用移液管吸去微滴底部的油;
Z2.加600μL全氟-1-辛醇,摇晃试管约20s使微滴破乳,然后以1000ⅹg离心1min。
对比例1
步骤X6中不添加聚乙烯醇,其余操作参照实施例3。
对比例2
不添加聚山梨酯,其余操作参照实施例3。
对比例3
不添加聚乙烯吡咯烷酮,其余操作参照实施例3。
性能检测
对实施例1~3及对比例1~3步骤W3中生成的微滴形态进行观察并记录微滴破损数(/100滴),记录结果如下表1所示。
表1微滴形态观察结果
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,包含以下步骤:先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置,汇聚形成层流,再与液滴生成油汇聚,形成单分散的微滴,随后裂解微滴,最后进行PCR扩增,并进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,所述的微流体装置包含:核心为一块玻璃微流控芯片,其联通四个输入管道及一个输出管道。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成,其引物的序列包含四个部分:PCR primer、12bp的CellBarcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
4.根据权利要求2所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,所述的微滴具体通过以下步骤得到:
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中;在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子,通过磁力搅拌器控制;
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中,四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道,并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h,液滴生成油的流速为14mL/h;
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况;将微滴收集在离心管中;
W4.在微滴生成期间,通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
5.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离步骤或骨髓血PBMC分离步骤得到;
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作:
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液;
X2.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用;
X3.吸取稀释血液,在离淋巴细胞分离液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上,并与淋巴细胞分离液形成明显界面;
X4.离心,此时离心管中形成4层:第一层为稀释液层,第二层为呈白膜状的单个核细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层;
X5.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,加5倍体积的PBS缓冲液洗1~2次,每次300ⅹg离心10min;
X6.离心完成后弃上清,加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬,控制单个核细胞的浓度为60个/μL;
所述的骨髓血PBMC分离步骤包含以下操作:
Y1.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用;
Y2.按体积比5:1取骨髓血加入PBS缓冲液稀释血液,300ⅹg离心5min;然后弃上清,加入3倍体积PBS缓冲液稀释血液,300ⅹg离心10min;
Y3.离心完成后弃上清,加入2倍骨髓血体积的PBS缓冲液,重悬,过滤,得到预处理骨髓血;
Y4.吸取预处理骨髓血,在离淋巴细胞分离液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使预处理骨髓血重叠于淋巴细胞分离液上,并与淋巴细胞分离液形成明显界面;
Y5.离心,此时离心管中形成5层:最上层是血浆,血浆和淋巴细胞分离液之间是呈白膜状的单个核细胞层;
Y6.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,加5倍体积的PBS缓冲液洗1~2次,每次300g离心10min;
Y7.离心完成后弃上清,加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬,控制单个核细胞的浓度为60个/μL。
6.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备:
将带有分子条形码的微珠先后用100%乙醇洗两次和TE/TW洗两次,1000ⅹg离心1min,然后弃上清,再用TE/TW重悬,用100μm过滤器过滤,放入离心管中,加入的DropSeq lysisbuffer洗涤,1000ⅹg离心1min,弃上清;然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中,并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮,控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL;
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01%Tween;
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6%FicollPM-400、0.2%Sarkosyl及20mM EDTA。
7.根据权利要求5所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,步骤X6及Y7所述的PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为3~5:2~4。
8.根据权利要求6所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,所述的混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为35~40:7~9:1~3。
9.根据权利要求4所述的一种单细胞快速测序分析方法,其特征在于,所述的裂解微滴包含以下操作:
Z1.在室温下添加6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中,然后用移液管吸去微滴底部的油;
Z2.加全氟-1-辛醇,摇晃试管20s使微滴破乳,然后以1000ⅹg离心1min。
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