CN117295820A - 以ccr8作为抗原识别的嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明的以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体通过使效应子细胞表达，相对于表达CCR8的细胞具有细胞损伤活性。

Description

以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体
【技术领域】
本发明涉及以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体、该嵌合抗原受体的表达细胞及含有该细胞的医药组合物。
【背景技术】
以肿瘤微小环境内的控制性T细胞(Treg细胞)媒介的免疫抑制作为开始的强力的负的调节机构对于肿瘤的治疗是大的障碍(非专利文献1)。
例如，肿瘤中浸润的CD4阳性Treg细胞有强力地抑制抗肿瘤免疫应答的可能性，可成为有效的癌治疗的大的障碍。
报告了CD4阳性FoxP3阳性Treg细胞媒介的肿瘤免疫抑制在动物肿瘤模型中充分地立证，由也含肿瘤内的全身性的Treg细胞除去得到抗肿瘤效果，一方面，在50％左右的肿瘤内浸润Treg细胞除去中确认不到效果(非专利文献2)。
报告了在人中全CD4阳性T细胞集团中的CD4阳性CD25阳性Treg细胞比(含Treg细胞的细胞集团)的增大，在以肺、***及卵巢肿瘤为首的各种癌患者的肿瘤内被检测，与存在比和患者生存率有负的相关(非专利文献3～8)。
CCR8是也称为CY6、CKR-L1或TER1的在胸腺或脾脏等表达的G蛋白共轭型7次跨膜型的CC趋化因子受体蛋白质，其基因在人染色体中存在于3p21。人CCR8由355个氨基酸构成(非专利文献9)。作为对于CCR8的内源性配体知晓CCL1(非专利文献10)。人CCR8 cDNA由Genbank ACC No.NM_005201.3所示的碱基序列构成，小鼠CCR8 cDNA由Genbank ACCNo.NM_007720.2所示的碱基序列构成。
CCR8在肿瘤内浸润Treg细胞中也特异性地表达，当向CCR8缺损小鼠和野生型小鼠移植乳腺癌细胞时显示，CCR8缺损小鼠中的乳腺癌的增殖和转移与野生型小鼠比较被抑制(专利文献1及非专利文献11)。非专利文献12～16中也记载了CCR8与癌的病态相关。再者，公开了通过向癌模型动物施用抗CCR8抗体显示抗肿瘤效果(专利文献2～12)。
由于含与肿瘤抗原结合的细胞外区域、跨膜区域及细胞内区域，细胞内区域含作为T细胞或NK细胞等的效应子细胞发挥功能的淋巴细胞表达的T细胞受体等的信号传递分子的细胞内信号区域的嵌合抗原受体(CAR)使T细胞(非专利文献17及18)或NK细胞(非专利文献19及20)表达，则对于表达该抗原的肿瘤显示细胞损伤活性，知晓对于癌治疗有用。
但是，如CCR8一样的，含与肿瘤内浸润Treg细胞表达的抗原结合的细胞外区域、跨膜区域及细胞内区域，细胞内区域含作为T细胞或NK细胞等的效应子细胞发挥功能的淋巴细胞表达的信号传递分子的细胞内信号区域的嵌合抗原受体对于癌治疗有用，至今未显示。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：美国专利第10087259号说明书
专利文献2：国际公开第2018/181425号
专利文献3：国际公开第2018/112032号
专利文献4：国际公开第2020/138489号
专利文献5：国际公开第2021/142002号
专利文献6：国际公开第2021/152186号
专利文献7：国际公开第2021/163064号
专利文献8：国际公开第2021/178749号
专利文献9：国际公开第2021/194942号
专利文献10：国际公开第2021/260208号
专利文献11：国际公开第2021/260209号
专利文献12：国际公开第2021/260210号
【非专利文献】
非专利文献1：Nat.Rev.Immunol.、2006年、第6卷、第4号、p.295-307非专利文献2：Eur.J.Immunol.、2010年、第40卷、p.3325-3335
非专利文献3：J.Clin.Oncol.、2006年、第24卷、p.5373-5380
非专利文献4：Nat.Med.、2004年、第10卷、p.942-949
非专利文献5：J.Clin.Oncol.、2007年、第25卷、p.2586-2593
非专利文献6：Cancer、2006年、第107卷、p.2866-2872
非专利文献7：Eur.J.Cancer、2008年、第44卷、p.1875-1882
非专利文献8：Cell.Mol.Immunol.2011年、第8卷、p.59-66
非专利文献9：J.Immunol.、1996年、第157卷、第7号、p.2759-63
非专利文献10：J.Biol.Chem.、1997年、第272卷、第28号、p.17251-4非专利文献11：Cancer Res.、2016年、第76卷、第4号、Supp.1,P4-04-11非专利文献12：Immunity、2016年、第45卷、p1122-1134
非专利文献13：Immunity、2016年、第45卷、p1135-1147
非专利文献14：Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2018年、第115卷、第45号、p10672-10681
非专利文献15：Targeting of CCR8 induces antitumor activity asamonotherapy that is further enhanced in combination with a Listeria-basedimmunotherapy,ASCO 2018,Daniel O Villarreal,et al.https://www.advaxis.com/wp-content/uploads/2018/04/KeystonePosterCCR 8-combo-posterFINAL.pdf
非专利文献16：Cancer Res.、2018年、第78卷、第18号、p5340-5348
非专利文献17：Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1993年、第90卷、第2号、p720-724
非专利文献18：Cell Res.、2017年、第27卷、p38-58
非专利文献19：Cell Stem Cell、2018年、第23卷、第2号、p181-192
非专利文献20：J.Hematol.Oncol.、2019年、第12卷、第1号、49
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明的目的提供以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体。再者，提供对于癌治疗有用的以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体的表达细胞。
【用于解决课题的手段】
本发明人经锐意研究的结果发现，以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体。再者，发现本发明的以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体的表达细胞对于表达CCR8的细胞具有细胞损伤活性。即，本发明的以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体的表达细胞对于癌治疗有用。
本发明涉及以下内容：
(1)嵌合抗原受体，其含与CCR8结合的细胞外区域、跨膜区域及细胞内区域，细胞内区域含作为效应子细胞发挥功能的淋巴细胞表达的信号传递分子的细胞内信号区域。
(2)(1)所述的嵌合抗原受体，其中与CCR8结合的细胞外区域含抗CCR8-scFv区域。
(3)(2)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
(1)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3；
(2)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3；
(3)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：35的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：36的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：37的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：38的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：39的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：40的氨基酸序列构成的CDR3；
(4)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：41的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：42的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：43的氨基酸序列构成的CDR3；
(5)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：44的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：45的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：46的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：47的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：48的氨基酸序列构成的CDR3；或者
(6)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：56的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：57的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：58的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：59的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：60的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：61的氨基酸序列构成的CDR3。
(4)(3)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：(1)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3；
(2)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3；或者
(4)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：41的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：42的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：43的氨基酸序列构成的CDR3。
(5)(4)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3。
(6)(4)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3。
(7)(2)或(3)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
(1)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域；
(2)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域；或者
(3)具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区域。
(8)(7)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
(1)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域；或者
(2)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域。
(9)(8)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域。
(10)(8)所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域。
(11)(2)～(10)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中在抗CCR8-scFv区域中，轻链可变区域和重链可变区域经SEQ ID NO：2的接头序列连接。
(12)(2)～(11)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中与CCR8结合的细胞外区域含CD8A信号序列区域。
(13)(12)所述的嵌合抗原受体，其中CD8A信号序列区域存在于抗CCR8-scFv区域的N末端侧。
(14)(12)或(13)所述的嵌合抗原受体，其中CD8A信号序列区域具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
(15)(2)～(14)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域和跨膜区域经间隔物序列连接。
(16)(15)所述的嵌合抗原受体，其中间隔物序列包含含有Flag表位的序列区域。
(17)(16)所述的嵌合抗原受体，其中含有Flag表位的序列区域具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
(18)(15)～(17)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中间隔物序列含CD8A铰链区域。
(19)(18)所述的嵌合抗原受体，其中CD8A铰链区域具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
(20)(1)～(19)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中跨膜区域含CD8A跨膜区域。
(21)(20)所述的嵌合抗原受体，其中CD8A跨膜区域具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
(22)(1)～(19)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中跨膜区域含CD28跨膜区域，细胞内区域含CD28细胞内信号区域。
(23)(22)所述的嵌合抗原受体，其中CD28跨膜区域具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，CD28细胞内信号区域具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
(24)(1)～(23)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含4-1BB、2B4、CD3ζ及DAP10的细胞内信号区域之中的至少1个。
(25)(24)所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含4-1BB、2B4、CD3ζ及DAP10的细胞内信号区域之中的至少2个。
(26)(25)所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含4-1BB及CD3ζ的细胞内信号区域。
(27)(25)所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含2B4及CD3ζ的细胞内信号区域。
(28)(24)～(27)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含4-1BB细胞内信号区域，所述4-1BB细胞内信号区域具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
(29)(24)～(27)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含2B4细胞内信号区域，所述2B4细胞内信号区域具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
(30)(24)～(27)之任一项所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含CD3ζ细胞内信号区域，所述CD3ζ细胞内信号区域具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
(31)(24)～(27)所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含DAP10细胞内信号区域，所述DAP10细胞内信号区域具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
(32)效应子细胞，其表达(1)～(31)之任一项所述的嵌合抗原受体。
(33)(32)所述的细胞，其中效应子细胞是NK细胞。
(34)(32)所述的细胞，其中效应子细胞是T细胞。
(35)(32)所述的细胞，其中效应子细胞是巨噬细胞。
(36)(32)～(35)之任一项所述的细胞，其中效应子细胞是末梢血来源。
(37)(32)～(35)之任一者记载的细胞，其中效应子细胞是从干细胞分化的。
(38)(36)所述的细胞，其中干细胞是iPS细胞。
(39)医药组合物，其含有(32)～(38)之任一项所述的细胞。
(40)(39)所述的医药组合物，其为了治疗癌使用。
(41)(40)所述的医药组合物，其具有表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞的除去作用。
(42)(40)所述的医药组合物，其具有表达CCR8的肿瘤细胞的除去作用。
(43)多核苷酸，其编码(1)～(31)之任一项所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列。
(44)表达载体，其含(43)所述的多核苷酸。
【发明的效果】
由于本发明的以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体的表达细胞对于表达CCR8的细胞具有细胞损伤活性，作为药品、特别，用于CCR8关联疾病的治疗或预防的医药非常地有用。
【附图的简单的说明】
【图1】抗人CCR8抗体(αCCR8-1～7)的轻链可变区域(VL)及重链可变区域(VH)中的氨基酸序列。氨基酸序列中，粗体字部顺序地是指CDR1、CDR2、CDR3。
【图2】以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体(抗CCR8-CAR)的结构。
【图3】以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用而评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-1-CAR及αCCR8-2-CAR)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性。
【图4】将导入抗CCR8-scFv区域相同且跨膜区域及细胞内区域不同的各抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-1～6)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图5】将导入抗CCR8-scFv区域相同且跨膜区域及细胞内区域不同的各抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2及αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图6】(A)将导入抗CCR8-scFv区域相同且跨膜区域及细胞内区域不同的各抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-11～13)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。(B)评价由导入抗CCR8-scFv区域相同且跨膜区域及细胞内区域不同的各抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-11～13)的mRNA的KHYG-1细胞向培养上清的干扰素-γ分泌量。
【图7】将导入抗CCR8-scFv区域不同跨膜区域及细胞内区域相同的各抗CCR8-CAR(αCCR8-1-CAR～αCCR8-6-CAR)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图8】将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-1-CAR及αCCR8-2-CAR)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的RAMOS细胞(C5细胞及C6细胞)作为目标细胞使用来评价。
表达【图9】(A)人CCR8的Treg细胞的用流式细胞仪的细胞损伤活性解析例。(B)将导入阴性对照及αCCR8-2-CAR的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Treg细胞作为目标细胞使用来评价。
【图10】将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-7-CAR)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图11】将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2)的mRNA的人末梢血来源NK细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图12】将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2及αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的人末梢血来源T细胞的细胞损伤活性以ATL细胞株来源ATN-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图13】将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2及αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的人末梢血来源T细胞的细胞损伤活性以ALL细胞株来源TALL-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图14】将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性以ATL细胞株来源ATN-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图15】将对于导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性的抗CCR8抗体的抑制活性以ATL细胞株来源ATN-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图16】评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的表达人CCR8的Rat-1细胞移植小鼠中的抗肿瘤效果。
【图17】(A)将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2)的mRNA的人iPS细胞来源NK细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。(B)将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2)的mRNA的人iPS细胞来源巨噬细胞的细胞损伤活性以表达人CCR8的Rat-1细胞作为目标细胞使用来评价。
【图18】以人卵巢癌来源肿瘤内浸润Treg细胞作为目标细胞使用来评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2)的mRNA的KHYG-1细胞的细胞损伤活性。
【图19】以人卵巢癌来源肿瘤内浸润Treg细胞作为目标细胞使用来评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2)的mRNA的人末梢血来源NK细胞的细胞损伤活性。
【图20】以人大肠癌来源肿瘤内浸润Treg细胞作为目标细胞使用来评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-2)的mRNA的人末梢血来源NK细胞的细胞损伤活性。
【图21】评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的ATL细胞株来源ATN-1细胞移植小鼠中的抗肿瘤效果。
【图22】将导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的ATL细胞株来源ATN-1细胞移植小鼠中的抗肿瘤效果用发光成像数据表示。
【图23】评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的大肠癌来源CT26细胞移植小鼠中的抗肿瘤效果。
【图24】评价导入抗CCR8-CAR(αCCR8-2-CAR-12)的mRNA的KHYG-1细胞的对于大肠癌来源CT26细胞移植小鼠中的肿瘤内浸润Treg细胞的细胞损伤活性。
【具体实施方式】
在本说明书中使用的用语，除了特别言及时之外，以本领域通常使用的含意使用。
本发明的嵌合抗原受体含与CCR8结合的细胞外区域、跨膜区域及细胞内区域，细胞内区域含作为效应子细胞发挥功能的淋巴细胞表达的信号传递分子的细胞内信号区域。
本发明的嵌合抗原受体基于“与CCR8结合的细胞外区域”、“跨膜区域”及“细胞内区域”的氨基酸序列信息确定整体的氨基酸序列，通过构建表达载体，可使用该表达载体转化效应子细胞来表达。
“与CCR8结合的细胞外区域”是指作为抗CCR8抗体的一部分，含与该抗CCR8抗体同样地与CCR8特异性地结合的抗CCR8抗体的片段的细胞外区域。
在“与CCR8结合的细胞外区域”中，也可在N末端还含信号序列区域。作为信号序列区域，例示CD8A信号序列区域、CD28信号序列区域等，优选CD8A信号序列。作为CD8A信号序列区域，优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
抗CCR8抗体能利用本领域公知的抗体制作方法。例如，可举出Immunochemistryin Practice(Blackwell Scientific Publiations)中记载的方法等。
另外，能利用本领域公知的基因操作的方法。例如，可举出Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Forth Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)、Current Protocols Essential Laboratory Techniques，Current Protocols(2012)所述的方法等。
人CCR8的氨基酸序列示于UniProtKB/Swiss-Prot：P51685(SEQ ID NO：49)。人CCR8的膜外结构域对应于由1～35位氨基酸构成的N末区域、由94～107位氨基酸构成的loop1区域、由172～202位氨基酸构成的loop2区域、由264～280位氨基酸构成的loop3区域。
产生抗CCR8抗体的杂交瘤可以人CCR8蛋白质、编码人CCR8的全长的基因、表达人CCR8的细胞等作为免疫原制作。以编码人CCR8的全长的基因作为免疫原时，例如，通过以该基因作为抗原将DNA免疫的小鼠的脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，可得到产生抗CCR8抗体的杂交瘤。
作为抗CCR8抗体之一的实施方式，可举出具有本说明书记载的CDR或重链可变区域/轻链可变区域的单克隆抗体。该抗体或抗体片段可为免疫球蛋白分子的任意的类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD或IgA，优选为IgG)或亚类来源，例如，也可从含小鼠、大鼠、鲨、兔、猪、仓鼠、骆驼、羊驼、山羊或人的任意的种取得。作为该抗体或抗体片段，优选为小鼠来源单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
抗CCR8抗体抑制CCR8和CCR8配体之任一者的结合是特征。“CCR8配体”只要是CCL1、CCL8、CCL18等与CCR8结合的物质，就不特别限制，优选为CCL1、CCL18，特别优选为CCL1。
对于CCR8和CCR8配体的结合抑制能，例如，在人CCL1的情况中，可通过使用表达人CCR8的293细胞，对由人CCL1添加的Ca2+流入进行测定，将人CCL1非添加时的信号设为抑制率100％，将人CCL1添加及抗体非添加时的信号设为抑制率0％，计算IC50值来确定。对于其他CCR8配体的结合抑制能，也可与上述人CCL1的情况同样地确定。
人CCL1具有UniProtKB/Swiss-Prot No.P22362等中所示的氨基酸序列。人CCL8具有GenBank No.AAI26243.1等中所示的氨基酸序列。人CCL18具有GenBankNo.EAW80102.1等中所示的氨基酸序列。
抗CCR8抗体还含嵌合体、人源化、完全人抗体。由于人源化单克隆抗体在人体内的抗原性降低，在以治疗目的等向人施用时有用。人源化单克隆抗体是向人抗体的框架区域(FR；framework region)移植人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补性决定区域(CDR；complementarity determining region)。从而，人源化单克隆抗体的FR来源于人。适当的FR只要是参照Kabat E.A.等的文献，就可选择。作为此时的FR，选择CDR可形成良好的抗原结合部位。根据需要，也可以再构成的人源化单克隆抗体的CDR形成适合的抗原结合部位的方式取代抗体的可变区域的FR的氨基酸(Sato、K.等，Cancer Res.1993年、第53卷、851页)。被取代的FR的氨基酸的比例是全FR区域的0～15％、优选为0～5％。
抗CCR8抗体优选CCR8的中和抗体。CCR8的中和抗体是指具有对于CCR8的中和活性的抗体。具有对于CCR8的中和活性与否可通过例如，对抑制对于CCR8配体之任一者(例如，CCL1)的CCR8的生理作用与否进行测定来判别。
抗CCR8抗体优选强识别人CCR8的抗体。在选择强识别人CCR8的抗体时，通过以中和活性的强度作为指标，选择抗体或其抗体片段，可选择更强识别人CCR8的抗体或其抗体片段。
作为“与CCR8结合的细胞外区域”中所含的抗CCR8抗体的片段，优选与CCR8特异性地结合的单链抗体(以下，表述为抗CCR8-scFv)。
抗CCR8-scFv是将一条VH和一条VL使用适当的接头序列(以下，表述为P)连接的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，具有CCR8结合活性的抗体片段。优选为VH-P-VL多肽。在本发明中使用的scFv中所含的VH及VL只要是本发明的单克隆抗体即可。在本发明中使用的scFv可通过使用本发明涉及的编码抗CCR8抗体的VH及VL的cDNA，构建scFv表达载体，通过导入到大肠杆菌、酵母或动物细胞来表达来制造。再者，作为接头序列，优选SEQ ID NO：2的接头序列。
再者，在“与CCR8结合的细胞外区域”含抗CCR8-scFv区域及信号序列区域时，信号序列区域优选存在于抗CCR8-scFv区域的N末端侧。
抗CCR8-scFv等，含CDR的肽含VH或VL的CDR的至少1区域以上而构成。多个CDR可直接或经适当的接头序列结合。在本发明中使用的含CDR的肽可通过使用编码本发明的单克隆抗体的VH及VL的cDNA，构建编码CDR的DNA，向动物细胞用表达载体***该DNA，向大肠杆菌、通过酵母或动物细胞导入该载体来表达来制造。另外，含CDR的肽也可由Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc法(t-丁基氧基羰基法)等的化学合成法制造。
“与CCR8结合的细胞外区域”与人CCR8结合是特征。特别是，优选与人CCR8特异性地结合。
特异性结合可以至少约1×10-6M或其不足的平衡解离常数(例如，Kd越小，表示越更紧密的结合)作为特征。Kd值优选为1×10-7M以下，更优选为1×10-8M以下，再优选为1×10-9M以下。对2个分子是否可特异性地结合进行测定的方法是在现有技术领域公知的，可举出竞争结合ELISA法、表面等离子体共振及同样。
“与CCR8结合的细胞外区域”可使用本说明书记载的抗CCR8抗体的CDR或重链可变区域/轻链可变区域的氨基酸序列信息确定氨基酸序列。
“与CCR8结合的细胞外区域”中所含的抗CCR8-scFv区域优选含以下之任一者的序列。
(1)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3；
(2)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3；
(3)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：35的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：36的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：37的氨基酸序列构成的CDR3；以及重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：38的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：39的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：40的氨基酸序列构成的CDR3；
(4)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：41的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：42的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：43的氨基酸序列构成的CDR3；或者
(5)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：44的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：45的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：46的氨基酸序列构成的CDR3；以及重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：47的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：48的氨基酸序列构成的CDR3。
(6)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：56的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：57的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：58的氨基酸序列构成的CDR3；以及重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：59的氨基酸序列构成的CDR1，由SEQ ID NO：60的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：61的氨基酸序列构成的CDR3更优选为，含以下之任一者的序列：
(1)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3；
(2)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3；或者
(4)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：41的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：42的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：43的氨基酸序列构成的CDR3。
另外，“与CCR8结合的细胞外区域”中所含的抗CCR8-scFv区域优选含以下之任一者的序列。
(1)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域；
(2)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域；或者
(3)具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区域
更优选为，含以下之任一者的序列：
(1)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域；或者
(2)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域
在“与CCR8结合的细胞外区域”中，可为在C末端还含间隔物序列，也可为抗CCR8-scFv区域和“跨膜区域”经间隔物序列连接。在间隔物序列区域中，优选包含含有Flag表位的序列区域和/或CD8A铰链区域。再者，含有Flag表位的序列区域优选具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，CD8A铰链区域优选具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
“跨膜区域”是指介于细胞外区域和细胞内区域之间的区域。只要是介于膜蛋白质的细胞外区域和细胞内区域之间的区域，就不特别限制，优选作为效应子细胞发挥功能的淋巴细胞表达的信号传递分子的跨膜区域。作为该信号传递分子，例示CD8A、CD28、NKG2D等。
在“跨膜区域”中，优选含CD8A跨膜区域或CD28跨膜区域。CD8A跨膜区域优选具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，CD28跨膜区域优选具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
其中，在“跨膜区域”含CD28跨膜区域时，同时细胞内区域优选还含CD28细胞内信号区域。CD28细胞内信号区域优选具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
“细胞内区域”是指含作为效应子细胞发挥功能的淋巴细胞表达的信号传递分子的细胞内信号区域，“与CCR8结合的细胞外区域”与CCR8结合，则能将对于效应子细胞的活化必要的信号传递到细胞内的区域。
作为“作为效应子细胞发挥功能的淋巴细胞”，例示NK细胞、T细胞等，优选为NK细胞或T细胞。作为该信号传递分子，例示4-1BB、2B4、CD3ζ、DAP10、DAP12等。
在“细胞内区域”中，优选含4-1BB、2B4、CD3ζ及DAP10的细胞内信号区域之中的至少1个，更优选含至少2个，更优选含4-1BB及CD3ζ的细胞内信号区域或2B4及CD3ζ的细胞内信号区域，更优选含4-1BB及CD3ζ的细胞内信号区域，特别优选含在4-1BB细胞内信号区域的末端连接CD3ζ细胞内信号区域的区域，最优选含4-1BB细胞内信号区域、DAP10细胞内信号区域及CD3ζ细胞内信号区域以此顺序连接的区域。
在“细胞内区域”含4-1BB细胞内信号区域时，所述4-1BB细胞内信号区域优选具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在“细胞内区域”含2B4细胞内信号区域时，所述2B4细胞内信号区域优选具有SEQID NO：9的氨基酸序列。
在“细胞内区域”含CD3ζ细胞内信号区域时，所述CD3ζ细胞内信号区域优选具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
在“细胞内区域”含DAP10细胞内信号区域时，所述DAP10细胞内信号区域优选具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
“与CCR8结合的细胞外区域”、“接头序列”、“间隔物序列区域”、“跨膜区域”及“细胞内区域”的各区域只要是各自氨基酸序列有90％以上的相同性，优选为有95％以上的相同性，就可显示同样的效果。
本发明的嵌合抗原受体通过使效应子细胞表达，对于表达CCR8的细胞具有细胞损伤活性。表达本发明的嵌合抗原受体的效应子细胞可通过使用编码本发明的嵌合抗原受体的cDNA，***到适当的表达载体而构建嵌合抗原受体表达载体，向效应子细胞导入该表达载体或使用该表达载体合成的本发明的嵌合抗原受体的mRNA，表达来制造。
再者，在“细胞损伤活性”中，作为含由巨噬细胞等的细胞吞噬活性。
作为本发明的表达嵌合抗原受体的效应子细胞，例示NK细胞、T细胞、巨噬细胞等，优选NK细胞或T细胞，更优选NK细胞。该效应子细胞可从自人采集的末梢血、骨髓、淋巴节组织、脐带血、胸腺组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织等得到。另外，该效应子细胞也可从iPS细胞等的干细胞分化。作为干细胞，例示造血干细胞等的成体干细胞、ES细胞等的胚胎干细胞或iPS细胞等的多能性干细胞，优选iPS细胞。该效应子细胞可在自身移植中利用，也可在由异体移植的细胞制剂的制造中利用。
作为本发明的表达嵌合抗原受体的效应子细胞的培养基，可举出DMEM培养基、RPMI1640培养基、MEM培养基、Ham's F-12培养基等。在该培养基中，为了使培养条件优化，也可添加FCS(牛胎儿血清)、HS(马血清)等的血清、IL-2等的细胞因子、氨基酸、激素等，各种有机或无机物质。
作为本发明的表达嵌合抗原受体的效应子细胞显示细胞损伤活性的表达CCR8的细胞，例示Treg细胞或肿瘤细胞等，优选Treg细胞，更优选肿瘤内浸润Treg细胞。
在表达CCR8的细胞是肿瘤内浸润Treg细胞时，该肿瘤优选实体癌。具体而言，可举出乳腺癌、子宫体癌、子***、卵巢癌、***癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大肠癌、肾癌、非霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、肉瘤、胆管癌、胆囊癌、甲状腺癌、***癌、胸腺癌、肝脏癌、皮肤癌、脑肿瘤等。优选可举出乳腺癌、子宫体癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌、肾癌、肉瘤、肝脏癌、皮肤癌及脑肿瘤。在表达CCR8的细胞是肿瘤内浸润Treg细胞时，肿瘤细胞中也可不表达CCR8。
在表达CCR8的细胞是肿瘤细胞时，该肿瘤优选黑色素瘤或血液癌。作为表达CCR8的血液癌，例示急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)等的白血病或成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL)、末梢性T细胞淋巴瘤(PTCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、弥漫性大细胞型B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤等的淋巴瘤。
在表达本发明的嵌合抗原受体的效应子细胞显示细胞损伤活性时，在该效应子细胞中细胞因子的分泌量增大，可显示细胞损伤活性。作为该细胞因子，例示IL-2或干扰素等，优选干扰素-γ。
表达本发明的嵌合抗原受体的效应子细胞作为医药组合物有用。从而，含有表达本发明的嵌合抗原受体的效应子细胞的医药组合物可全身或局部施用。作为施用通路，可选择例如，点滴等的静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等。
本发明的医药组合物可为含有使本发明的嵌合抗原受体在自身的效应子细胞表达的细胞的自身移植用的组合物，也可为由含有使本发明的嵌合抗原受体在异体的效应子细胞表达的细胞的异体移植的细胞制剂。
本发明的医药组合物作为用于CCR8关联疾病的治疗和/或预防的医药非常地有用。特别是，作为用于治疗和/或预防发生表达CCR8的Treg细胞的肿瘤内浸润的癌或表达CCR8的癌的医药非常地有用。例如，作为用于治疗和/或预防乳腺癌、子宫体癌、子***、卵巢癌、***癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大肠癌、肾癌、非霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、肉瘤、血细胞癌(白血病、淋巴瘤等)、胆管癌、胆囊癌、甲状腺癌、***癌、胸腺癌、肝脏癌、皮肤癌、脑肿瘤、等的癌、优选为乳腺癌、子宫体癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌、肾癌、肉瘤、肝脏癌、皮肤癌及脑肿瘤的医药非常地有用。另外，作为用于治疗和/或预防白血病及淋巴瘤的医药也非常地有用。
在本发明涉及的癌中，含全部的实体癌及血液癌。具体而言，可举出乳腺癌、子宫体癌、子***、卵巢癌、***癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大肠癌、肾癌、非霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、肉瘤、血细胞癌(白血病、淋巴瘤等)、胆管癌、胆囊癌、甲状腺癌、***癌、胸腺癌、肝脏癌、皮肤癌、脑肿瘤、等。优选可举出乳腺癌、子宫体癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌、肾癌、肉瘤、肝脏癌、皮肤癌及脑肿瘤。另外，还优选白血病及淋巴瘤。
再者，本发明涉及的癌不仅是卵巢癌、胃癌等的上皮性的恶性肿瘤，还是指含慢性淋巴性白血病或霍奇金淋巴瘤等的造血器癌的非上皮性的恶性肿瘤，在本说明书中，“癌(cancer)”、“癌(carcinoma)”、“肿瘤(tumor)”、“肿瘤(neoplasm)”等的用语不互相区别，能相互交换。
推定本发明的医药组合物的对象患者是癌患者或是疑似癌患者。本发明的医药组合物以治疗上有效量含有表达本发明的嵌合抗原受体的效应子细胞，例如，每一次的施用含有1×104～1×109个该细胞。但是，本发明的医药组合物不限于这些施用量。另外，施用期间可根据患者的年龄、症状适宜选择。本发明的医药组合物也可根据施用通路一同含医药学容许的载体或添加物。作为这样的载体及添加物的例，可举出二甲基亚砜(DMSO)、血清白蛋白、各种抗生物质、维生素类、细胞因子、生长因子、类固醇等的细胞的活化成分、作为医药添加物容许的表面活性剂等。使用的添加物对应于剂型而从上述之中适宜或组合选择，但不限于这些。
本发明的医药组合物可用于单独或用于与其他癌的治疗或预防的治疗或预防的组合物或方法组合。具体而言，可与用于化学疗法或免疫学治疗方法的组合物或方法组合，利用本发明的组合物或方法。或者，也可将放射线疗法、质子束治疗、温热治疗等的理化学治疗方法联用。
本发明包含编码本发明的嵌合抗原受体的氨基酸序列的多核苷酸。本发明还包含含该多核苷酸的表达载体。
该多核苷酸只要是编码本发明的嵌合抗原受体，就不特别限定，由多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的核苷酸构成的聚合物。也可含天然碱基以外的碱基。本发明的多核苷酸可为了将本发明的嵌合抗原受体及表达该嵌合抗原受体的效应子细胞由基因工程学的方法制造而使用。
【实施例】
接下来，举本发明的实施例而对本发明更详细地进行说明，但本发明不由这些限定。
【试验例：抗人CCR8抗体的制成】
基于WO2020/138489号公报的实施例1～2、4～7及9记载的方法而得到抗人CCR8抗体。得到的抗体的各可变区域的氨基酸序列示于图1，轻链可变区域、重链可变区域及CDR的序列编号示于表1。
其中，αCCR8-1及αCCR8-2是人源化单克隆抗体，αCCR8-3～6是小鼠来源单克隆抗体，αCCR8-7是大鼠来源单克隆抗体。
【表1】
【实施例1：以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体(抗CCR8-CAR)的mRNA合成】
基于试验例中得到的抗人CCR8抗体中的轻链可变区域及重链可变区域的氨基酸序列，构建抗CCR8-CAR搭载载体。抗CCR8-CAR的结构示于图2。
作为与CCR8结合的细胞外区域，自N末端侧以CD8A信号序列区域(SEQ ID NO：1)、抗CCR8-scFv区域(将抗人CCR8抗体重链可变区域、G4S肽接头(SEQ ID NO：2)及抗人CCR8抗体轻链可变区域以此顺序连接)、间隔物序列区域(将含有Flag表位的序列区域(SEQ IDNO：3)和CD8A铰链区域(SEQ ID NO：4)以此顺序连接)的顺序连接。
跨膜区域与上述与CCR8结合的细胞外区域的C末端侧连接。作为跨膜区域，使用CD8A跨膜区域(SEQ ID NO：5)或CD28跨膜区域(SEQ ID NO：6)。
细胞内区域与上述跨膜区域的C末端侧连接。作为细胞内区域，将4-1BB细胞内信号区域(SEQ ID NO：8)、2B4细胞内信号区域(SEQ ID NO：9)、CD3ζ细胞内信号区域(SEQ IDNO：10)及DAP10细胞内信号区域(SEQ ID NO：11)之中多个细胞内信号区域连接而使用。
再者，在跨膜区域含CD28跨膜区域时，同时在细胞内区域的N末端侧***CD28细胞内信号区域(SEQ ID NO：7)。
将编码上述抗CCR8-CAR的DNA由在FASMAC公司的定制合成制成。将该DNA以EcoRI部位变得基因的上游的方向克隆到pUC19载体的SmaI部位。以该克隆载体作为模板，由PCR法，使用pUC19-T7引物(SEQ ID NO：50)和pUC19-R1引物(SEQ ID NO：51)，对抗CCR8-CAR基因区域进行扩增。作为PCR条件，使用10ng模板DNA，通过使用KOD聚合酶进行35个循环的94℃→65℃→72℃的循环而对目的区域进行扩增。对扩增的抗CCR8-CAR基因的DNA量进行定量，使用iScribe T7 ARCA mRNA kit(NEW ENGLAND BioLabs公司制)，根据试剂盒记载的方法而合成mRNA，附加聚A而作为抗CCR8-CAR mRNA。
再者，作为阴性对照，使用接下来记载的引物(T7-AMP-F2引物(SEQ ID NO：52)、AMP-R1引物(SEQ ID NO：53)，以pUC19质粒作为模板而将氨苄西林基因的反链由PCR扩增。由扩增的DNA与上述同样地合成mRNA，附加聚A而作为阴性对照mRNA。
【实施例2：人NK细胞株KHYG-1细胞的培养和mRNA导入】
将作为人NK细胞株的KHYG-1细胞使用将人IL-2(PeproTech公司)以最终浓度成为100个单位/ml的方式添加的RPMI1640/10％ FCS，在抗生物质存在下，于37℃、5％CO2培养。在细胞浓度成为2～3×105/ml的时间点在mRNA导入中使用。
将KHYG-1细胞用2次OPTI-MEM清洗，以成为2.5×106个/100μl的方式悬浮。向放入100μl的细胞溶液的NEPA21专用比色杯(2mm缝隙)添加3μl(6μg)各mRNA，在以下的条件下进行NEPA21电穿孔(Nepagene公司)。导入条件根据流程记载的方法。将mRNA导入后的细胞于37℃、5％CO2培养16～18小时。
该转化细胞在mRNA导入后20小时以内，在对于成为目标细胞的表达人CCR8的细胞的细胞损伤活性评价中使用。
【实施例3：表达人CCR8的细胞的准备】
(1)表达人CCR8的Rat-1细胞及RAMOS细胞的制作
将人CCR8(SEQ ID NO：49)用定法克隆到pQCXIP(或者将pQEF、pQCXIP载体的CMV启动子变换为人EF启动子的载体)载体中，将表达该的人CCR8表达载体使用脂质体3000通过定法转化为Rat-1细胞(pQCXIP载体)及RAMOS细胞(pQEF载体)，2天后添加1μg/ml的嘌呤霉素，实施转化细胞的选择。细胞的人CCR8表达率使用被PE标记的抗人CCR8抗体(克隆名：L263G8、BioLegend公司)，使用流式细胞仪确认。
在RAMOS细胞的情况中，以药剂选择后进一步成为单细胞的方式进行细胞克隆。人CCR8的表达确认使用与上述同样地被PE标记的抗人CCR8抗体，使用流式细胞仪确认。另外每细胞的人CCR8的表达分子数使用QIFIKIT(DAKO公司)，根据试剂盒记载的方法而确定。
(2)由钙黄绿素的表达人CCR8的细胞的标记
将标记的表达人CCR8的细胞以成为5×105个/ml的方式悬浮于DMEM/10％ FCS培养基，以成为终浓度4μg/ml的方式添加溶解于DMSO的钙黄绿素(Calcein-AM、349-07201、DOJINDO公司)。DMSO的最终浓度以成为8％以下的方式调整。使细胞培养液悬浮后，于37℃、5％CO2培养30分钟。其后，将细胞用细胞损伤活性评价缓冲液(DMEM/4％ FCS)清洗2次，在细胞损伤活性评价中使用。
【实施例4：由表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的表达人CCR8的细胞的细胞损伤活性】
向KHYG-1细胞导入用实施例1的方法制成的连接将抗CCR8抗体之中与含αCCR8-1、αCCR8-2的可变区域的CCR8结合的细胞外区域、CD8A跨膜区域及2B4细胞内信号区域和CD3ζ细胞内信号区域连接的细胞内区域的抗CCR8-CAR(各自作为αCCR8-1-CAR、αCCR8-2-CAR)的mRNA。作为对照，导入用实施例1的方法制成的阴性对照mRNA。
使KHYG-1细胞转化的20小时后，以作为目标细胞实施例3中制成的钙黄绿素标记的表达人CCR8的Rat-1细胞或作为亲本细胞的Rat-1细胞和转化KHYG-1细胞和目标细胞的比率(E/T细胞比率)成为3:1的方式在细胞损伤活性评价缓冲液160μl中混合。
细胞损伤活性使用96孔圆底皿进行评价。在将转化KHYG-1细胞和目标细胞混合之后，使用板离心机以1000rpm离心2分钟，使细胞沉下。将细胞混合后，于37℃、5％CO2培养2小时。其后，从板缓慢地分取细胞上清60μl。分取的上清在30分钟以内使用荧光测定器对上清中所含的荧光量进行定量。
自各目标细胞的钙黄绿素的自然释放量(BG)通过对仅各目标细胞的孔的上清同样地进行测定来确定。另外全钙黄绿素释放量(TOTAL)通过以TritonX-100成为0.1％的方式向仅各目标细胞的孔添加1％TritonX-100，对同等量的上清进行测定确定。
以从杀伤的目标细胞释放的钙黄绿素量作为指标的细胞损伤活性的计算方法用下式算出：
[(各孔的荧光值-BG荧光值)/((TOTAL荧光值-BG荧光值)]×100(％)
减去自然释放，将全细胞被杀伤时(此时由利用Triton的细胞完全溶解释放到上清中的荧光量)的上清中荧光量设为100％，算出杀伤率(％)。
结果示于图3。将向亲本细胞的Rat-1细胞及表达人CCR8的Rat-1细胞混合阴性对照mRNA导入KHYG-1细胞时的杀伤率设为1，以相对于其的杀伤倍率显示表达αCCR8-1-CAR的KHYG-1细胞及表达αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞的杀伤率。与转化阴性对照mRNA时比较，在转化αCCR8-1-CAR或αCCR8-2-CAR的细胞中，确认到表达人CCR8的细胞依赖性并且表达抗CCR8-CAR的细胞特异性的细胞损伤活性。一方面，对于不表达人CCR8的亲本细胞(Rat-1)，确认不到由抗CCR8-CAR的特异性细胞损伤活性。
【实施例5：跨膜区域及细胞内区域的探讨(1)】
向KHYG-1细胞导入用实施例1的方法制成的表2的各抗CCR8-CAR的mRNA。作为对照，导入用实施例1的方法制成的阴性对照mRNA。
转化KHYG-1细胞的18小时后，将各抗CCR8-CAR的细胞表面上的表达率使用抗FLAG抗体(PE-anti-DYKDDDDK Tag Clone：1.5、BioLegend公司)来定量。将细胞由LIVE/DEAD(ThermoFisher公司)及抗FLAG抗体，1小时于室温染色，用细胞损伤活性评价用缓冲液清洗1次后，由流式细胞仪评价抗CCR8-CAR的细胞表面表达率。解析方法由LIVE/DEAD对活细胞进行门控，其后用FSC/SSC对主要的细胞集团区域进行门控，对于此细胞集团而解析FLAG的表达量。在对照(AMP)转化细胞中FLAG阳性率成为1～2％左右的值设定阈值，以其以上的细胞比率作为表达率算出。接下来，为了具备各抗CCR8-CAR的表达率，根据表达率最低的细胞的表达率。具体而言，将对照的转化细胞和抗CCR8-CAR转化细胞以该比率混合，以抗CCR8-CAR的表达率成为约30％的方式调整。何细胞的抗CCR8-CAR的表达率成为30％前后。使用此调整的KHYG-1细胞进行细胞损伤活性评价。
将转化KHYG-1细胞和钙黄绿素标记的表达人CCR8的Rat-1细胞在E/T细胞比率成为10:1、3:1及1:1的条件下混合，进行钙黄绿素释放评价。钙黄绿素释放评价用与实施例4同样的方法实施。在实际的细胞数是10:1时，在150μl的细胞损伤活性评价缓冲液中效应子细胞是3×104个，目标细胞是3×103个。
【表2】
抗CCR8抗体 跨膜区域 细胞内区域
αCCR8-2-CAR-1 αCCR8-2 CD8A 2B4-CD3ζ
αCCR8-2-CAR-2 αCCR8-2 CD8A 4-1BB-CD3ζ
αCCR8-2-CAR-3 αCCR8-2 CD8A CD3ζ-DAP10
αCCR8-2-CAR-4 αCCR8-2 CD28 CD28-2B4-CD3ζ
αCCR8-2-CAR-5 αCCR8-2 CD28 CD28-4-1BB-CD3ζ
αCCR8-2-CAR-6 αCCR8-2 CD28 CD28-CD3ζ-DAP10
结果示于图4。最细胞损伤活性的高的抗CCR8-CAR是αCCR8-2-CAR-2。在αCCR8-2-CAR-2和其以外的抗CCR8-CAR之间实施显著差异检验。实施Tukey多重比较检验，对于αCCR8-2-CAR-2和其以外的抗CCR8-CAR，对于任何项目也全部以P＜0.05有显著差异。
在此实验中仅变更跨膜区域(CD8A或CD28)，对于其他区域完全相同的组合，KHYG-1细胞的细胞损伤活性均确证CD8A的跨膜区域的序列优良。
在相同的跨膜区域的抗CCR8-CAR间的比较中，在跨膜区域是CD8A和CD28的任何一方的情况中均为具有4-1BB的细胞内信号区域的嵌合体受体活性最高，从而确证在KHYG-1细胞中4-1BB和CD3ζ的细胞内信号区域的组合优良。
以上确证，在表达抗CCR8-CAR的NK细胞中，CD8A的跨膜区域和4-1BB-CD3ζ的细胞内信号区域的组合细胞损伤活性最强。
【实施例6：跨膜区域及细胞内区域的探讨(2)】
用与实施例5同样的方法评价表3的表达各抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的细胞损伤活性。再者，在E/T细胞比率成为27:1及3:1的条件下进行。
结果示于图5。确证在E/T细胞比率是27:1时，表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞与表达αCCR8-2-CAR-2的KHYG-1细胞比较而杀伤活性显著地升高1.2倍左右(以Tukey多重比较检验P＜0.05)。
从以上的结果确证，通过在αCCR8-2-CAR-2的细胞内区域附加DAP10，得到了比表达αCCR8-2-CAR-2的KHYG-1细胞强的细胞损伤活性。
【表3】
抗CCR8抗体 跨膜区域 细胞内区域
αCCR8-2-CAR-2 αCCR8-2 CD8A 4-1BB-CD3ζ
αCCR8-2-CAR-12 αCCR8-2 CD8A 4-1BB-DAP10-CD3ζ
【实施例7：跨膜区域及细胞内区域的探讨(3)】
用与实施例5同样的方法评价表4的表达各抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的细胞损伤活性。再者，以抗CCR8-CAR的表达率成为约40％的方式调整，在E/T细胞比率成为10:1、3:1及1:1的条件下进行。
结果示于图6A。在E/T细胞比率是10:1及3:1时，实施Tukey多重比较检验，在αCCR8-2-CAR-12和其以外的抗CCR8-CAR之间，在任何一方的E/T细胞比率的情况中均以P＜0.05有显著差异。确证在3者间杀伤活性最优良的抗CCR8-CAR是αCCR8-2-CAR-12。
再者，实施相同的细胞损伤活性评价的实验26小时，当在26小时后将分泌到培养上清的干扰素-γ的量用IFN-γELISA试剂盒(BPS公司)测定时，在表4的表达各抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的培养上清中，确认到干扰素-γ的显著的分泌升高(图6B、Student t-test、P＜0.001)。
【表4】
抗CCR8抗体 跨膜区域 细胞内区域
αCCR8-2-CAR-11 αCCR8-2 CD8A 4-1BB-2B4-CD3ζ
αCCR8-2-CAR-12 αCCR8-2 CD8A 4-1BB-DAP10-CD3ζ
αCCR8-2-CAR-13 αCCR8-2 CD8A 4-1BB-2B4-DAP10-CD3ζ
【实施例8：抗CCR8-scFv区域的探讨(1)】
用与实施例5同样的方法进行抗CCR8-scFv区域的探讨。设计与抗人CCR8抗体的可变区域氨基酸序列相比仅细胞外区域的抗原结合区域不同的表5中所示的6种抗CCR8-CAR。抗体区域以外是全部相同的序列，跨膜区域使用CD8A跨膜区域，细胞内区域使用全部2B4-CD3ζ细胞内信号区域。再者，以抗CCR8-CAR的表达率成为36％的方式调整，在E/T细胞比率成为10:1、3:1及1:1的条件下进行。
结果示于图7。表达αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞细胞损伤活性最强，表达接下来αCCR8-1-CAR的KHYG-1细胞的活性强。由Tukey的多重检验，表达αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞对于此外的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞全部有显著差异。表达αCCR8-1-CAR的KHYG-1细胞在E/T细胞比率是10:1和3:1的条件下，对于表达αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞以外的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞全部显著地高。
【表5】
抗CCR8抗体 跨膜区域 细胞内区域
αCCR8-1-CAR αCCR8-1 CD8A 2B4-CD3ζ
αCCR8-2-CAR αCCR8-2 CD8A 2B4-CD3ζ
αCCR8-3-CAR αCCR8-3 CD8A 2B4-CD3ζ
αCCR8-4-CAR αCCR8-4 CD8A 2B4-CD3ζ
αCCR8-5-CAR αCCR8-5 CD8A 2B4-CD3ζ
αCCR8-6-CAR αCCR8-6 CD8A 2B4-CD3ζ
【实施例8-2：抗CCR8-scFv区域的探讨(2)】
向KHYG-1细胞导入用实施例1的方法制成的连接将抗CCR8抗体之中与含αCCR8-7的可变区域的CCR8结合的细胞外区域、CD8A跨膜区域及2B4细胞内信号区域和CD3ζ细胞内信号区域连接的细胞内区域的抗CCR8-CAR(作为αCCR8-7-CAR)的mRNA。作为对照，导入用实施例1的方法制成的阴性对照mRNA。
对于表达αCCR8-7-CAR的KHYG-1细胞，用与上述(1)同样的方法评价细胞损伤活性(图10)。再者，在E/T细胞比率成为9:1、3:1、1:1及0.3:1的条件下进行。
【实施例9：对于与表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞表达同程度的CCR8的表达人CCR8的RAMOS细胞的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的细胞损伤活性评价】
对于在实施例3中制成的表达人CCR8的RAMOS细胞(C5细胞及C6细胞)及亲本细胞RAMOS细胞，将人CCR8表达量用实施例3的方法使用流式细胞仪确认。再者，将每细胞大概细胞表面上的平均的表达人CCR8的分子数使用QIFIKIT(DAKO公司)及抗人CCR8抗体(未标记L263G8，BioLegend公司)，根据流程而确定。
结果，C5细胞是2630分子/细胞，C6细胞是5950分子/细胞。另外，将人肺癌的表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞的细胞表面上的表达平均CCR8的分子数用同样的方法评价，约4000分子/细胞，从而可确认到C5细胞及C6细胞与表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞表达同程度的CCR8。
以作为此表达人CCR8的RAMOS细胞的C5细胞及C6细胞作为目标细胞使用，用与实施例5同样的方法评价表达αCCR8-1-CAR的KHYG-1细胞及表达αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞的细胞损伤活性(图8)。再者，在E/T细胞比率成为10:1及3:1的条件下进行。
结果，C5细胞及C6细胞的两方的细胞在E/T细胞比率10:1及3:1的两方的比率下，表达αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞与表达αCCR8-1-CAR的KHYG-1细胞及阴性对照比较而细胞损伤活性显著地升高(以Tukey多重比较检验任何对均为P＜0.05)。在表达αCCR8-1-CAR的KHYG-1细胞的情况中，C5及C6细胞的两方仅在E/T细胞比率10:1时，与阴性对照比较而细胞损伤活性显著地升高(以Tukey多重比较检验任何一方的细胞均为P＜0.05)。
以上确证，即使表达αCCR8-1-CAR的KHYG-1细胞及表达αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞对于与在细胞表面表达的CCR8表达量同程度或50％左右的表达量的细胞，也保持充分的细胞损伤活性。
【实施例10：对于人Treg细胞的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的细胞损伤活性评价】
(1)人Treg细胞的调制
从末梢血使用Ficoll包装(Ficoll-Paque PLUS，GEW Healthcare公司)对PBMC进行分离。从其使用CD4+T Cell Isolation Kit human(Miltenyi Biotec)纯化CD4+T细胞。其后，使用FITC标记抗人CD4抗体、PerCP_Cy5.5标记抗人CD45RA抗体、PECy7标记抗人CD25抗体、Bv510标记抗人CD127抗体，由FACS_Aria的排序功能筛选CD45RA+CD127-CD4+CD25+细胞(FACS Aria、BD公司)。由此筛选分离人Treg细胞。
将根据流程添加分离的Treg细胞使用Dynabeads Human Treg Expander(Veritas公司)，根据流程的方法，使用RPMI1640/10％ FCS培养基，于37℃、5％CO2培养20天。将培养的Treg细胞的细胞表面上的人CCR8蛋白质的表达率用实施例3的方法由流式细胞仪检测的结果，确证阳性率是约20％。
(2)对于人Treg细胞的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的细胞损伤活性
以在(1)中得到的Treg细胞作为靶细胞，作为效应子细胞，使用转化αCCR8-2-CARmRNA或阴性对照mRNA的KHYG-1细胞。当用与实施例5同样的方法使用抗FLAG抗体，计算转化后24小时的KHYG-1细胞表面上的αCCR8-2-CAR表达率时，是70％。
细胞损伤活性评价在转化后7小时，使用96孔圆底板开始评价，16小时实施。细胞损伤活性评价通过将E/T细胞比率以10:1、3:1、1:1的比率混合细胞来开始。96孔中的各细胞数是，靶的Treg细胞全部作为1×104个/well。转化的KHYG-1细胞根据E/T细胞比率设为1×105～1×104个。活性评价时的培养液具有RPMI1640/10％FCS。
评价开始16小时后，为了进行Fc受体的块，向各孔添加1/20量Human TruStainFcX(BioLegend公司)，于室温静置15分钟。其后用HBSS/2％ FCS/10mM HEPES缓冲液进行清洗1次，悬浮于100μl的同缓冲液之后，使用LIVE/DEAD(ThermoFisher公司)、Bv421标记抗人CD4(BD Bioscience公司)、PE标记抗人CCR8(BioLegend公司)或PE标记同种型对照抗体(BioLegend公司)于4℃1小时染色。在同种型抗体的染色中使用的细胞使用将Treg细胞和转化KHYG-1细胞以E/T细胞比率3:1混合的细胞。另外，评价图9A的细胞损伤活性的图是全部以10:1混合的细胞的例。培养16小时后用相同的缓冲液清洗2次，通过由流式细胞仪算出生存的表达人CCR8的细胞率来进行解析。表达人CCR8的细胞的鉴定用同种型对照抗体设定背景的阈值，用抗CCR8染色，以比其阈值荧光强度强的细胞作为表达细胞。生存的表达人CCR8的细胞的鉴定是，门控表达CD4的细胞，对其用LIVE/DEAD染色门控为阴性级分，再者，其中以CCR8阳性级分作为生存的表达人CCR8的细胞。另外，将在仅放入靶细胞的孔的表达人CCR8的细胞率设为100％而算出。解析的流式细胞仪的解析例示于图9A。
结果，如图9B一样，在转化阴性对照mRNA的细胞中，在任意E/T细胞比率下杀伤率均是约15％，转化αCCR8-2-CAR的KHYG-1细胞在全部E/T细胞比率下，杀伤率是80％以上，与Control比较，确认到显著的杀伤率的升高。(用Student t-test全部以E/T细胞比率为P＜0.001)。
从以上可确认到，表达αCCR8-2-CAR的NK细胞对于表达人CCR8的Treg细胞具有细胞损伤活性。
【实施例11：使用表达抗CCR8-CAR的末梢血来源NK细胞的细胞损伤活性评价】
(1)表达人CCR8的细胞株的鉴定
将ATL患者来源细胞株ATN-1细胞以及ALL患者来源细胞株TALL-1细胞及CCRF-HSB2细胞(全部理研)用与实施例9同样的方法使用PE标记抗人CCR8抗体(PE标记L263G8、BioLegend公司)以最终浓度4μg/ml根据流程染色。由流式细胞仪解析，两细胞均检测阳性信号。此阳性信号是，在向染色开始5分钟前以250倍的浓度(1mg/ml)添加表1中所示的作为抗CCR8抗体的αCCR8-1抗体时，阳性信号完全地消失。
以上确证，确认到这些细胞的阳性信号是人CCR8的表达，这些细胞表达人CCR8。
(2)使用末梢血来源NK细胞的细胞损伤活性评价
将人末梢血来源NK细胞(生物疗法研究所)用RPMI1640/10％FCS/Nonessentialamino acid+人IL-2(200U/ml)(Peprotech)培养2周而使增殖。将培养后的CD16阳性率由PE-抗人CD16抗体(3G8、BioLegend)及FITC-抗人CD56抗体(HCD56、BioLegend)染色的结果，与同种型抗体染色(MOPC21、BioLegend)的比较，两标志物阳性的细胞比率均是95％以上。根据实施例2及4，对此细胞使用NEPA21转化5μg的αCCR8-2-CAR-2mRNA。转化16小时后的CAR阳性率是10.6％。使用此细胞，以表达人CCR8的Rat-1细胞作为靶细胞，由钙黄绿素法进行细胞损伤活性评价。
结果，与亲本细胞的未处理的末梢血来源NK细胞或对照的Amp mRNA导入末梢血来源NK细胞比较，表达αCCR8-2-CAR-2的末梢血来源NK细胞对于表达人CCR8的Rat-1细胞的细胞损伤活性显著地升高(图11)。
以上确证，通过使αCCR8-2-CAR-2mRNA在末梢血来源NK细胞表达，对于表达人CCR8的Rat-1细胞显示细胞损伤活性。
接下来，对于ALL细胞株TALL-1细胞用同样的方法评价细胞损伤活性。结果确证，与表达人CCR8的Rat-1细胞同样地，通过使αCCR8-2-CAR-2mRNA在末梢血来源NK细胞表达，可杀伤ALL细胞株TALL-1细胞。
【实施例12：使用表达抗CCR8-CAR的末梢血来源T细胞的细胞损伤活性评价】
(1)自人末梢血的T细胞的分离
从健康人对末梢血进行分离，使用人CD8阳性T细胞单离试剂盒(MojoSort、BioLegend)对T细胞进行分离。将此细胞在RPMI1640/10％ FCS/Nonessential amino acid+Dynabeads human T-Activator CD3/CD28(GIBCO)+人IL-2(200U/ml)(PeproTech)存在下培养2周。对于培养2周后的T细胞集团的各T细胞亚组，使用各种抗体由流式细胞仪评价。作为检测抗体，使用PE-CD16(B73.1、BioLegend)、APC-CD8(SK1、BioLegend)、FITC-CD4(OKT4、BioLegend)、Bv421-CD3(SK7、BioLegend)、LIVE/DEAD(APC-Cy7)、同种型抗体(MOPC-21、BioLegend)。
结果，CD3阳性、CD4阳性、CD8阳性、CD16阳性细胞的各比率各自是99.6％、51.6％、41.6％、0.5％，绝大部分是CD3阳性T细胞，几乎确认不到CD16阳性的NK细胞。
(2)使用末梢血来源T细胞的细胞损伤活性评价
根据实施例2及4，对此细胞使用NEPA21转化5μg的αCCR8-2-CAR-2或αCCR8-2-CAR-12的mRNA。根据实施例2及4，转化16小时后，以钙黄绿素标记的作为ATL细胞株的ATN-1细胞作为靶细胞，实施细胞损伤活性评价。再者，转化16小时后的末梢血来源T细胞中的αCCR8-2-CAR-2及αCCR8-2-CAR-12的CAR阳性率各自是5.9％、3.3％。
结果确证，与作为阴性对照的Amp mRNA导入末梢血来源T细胞比较，在表达αCCR8-2-CAR-2或αCCR8-2-CAR-12的末梢血来源T细胞中，任何一方均有显著地同程度的细胞损伤活性(图12)。
接下来，以同样的方法，将E/T细胞比率设定为5:1，将表达对于作为人ALL细胞株的TALL-1细胞及CCRF-HSB2细胞的αCCR8-2-CAR-2或αCCR8-2-CAR-12的末梢血来源T细胞的细胞损伤活性用钙黄绿素法评价。
结果，相对于TALL-1细胞，表达αCCR8-2-CAR-2或αCCR8-2-CAR-12的末梢血来源T细胞与阴性对照的Amp导入末梢血来源T细胞比较，确认到显著的细胞损伤活性的增大(图13)。对于CCRF-HSB2细胞也同样地确认到细胞损伤活性的增大倾向。
【实施例13：对于表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的细胞损伤活性的抗CCR8抗体的抑制活性评价】
(1)表达荧光素酶基因的ATN-1细胞(Luc/ATN-1细胞)的制作
通过向pMEI-5-Neo载体的SalI/BglII部位***pGL3载体(Clontech公司)的SalI/BglII片段，制成表达萤荧光素酶基因的载体(pMEI5-FLuc)。将此表达载体对ATN-1细胞使用NEPA21由电穿孔转导。导入3天后用G418实施药剂选择。使用Glo kit(Prω)评价药剂抗性细胞的荧光素酶活性，确认荧光素酶基因表达。
(2)利用反转录病毒向KHYG-1细胞导入抗CCR8-CAR基因
向作为反转录病毒载体的pMEI-5载体的NotI部位***αCCR8-2-CAR-12-IRES-Puromycin的基因片段(SEQ ID NO：62)，制成可表达αCCR8-2-CAR-12-IRES-PuromysinmRNA的载体。反转录病毒通过使用293GP2细胞，同时转染αCCR8-2-CAR-12反转录病毒载体和作为反转录病毒的包膜蛋白质表达载体的pE-Ampho兼嗜性env表达载体(TAKARA)得到。将得到的含反转录病毒的293GP2细胞上清与聚凝胺(终浓度10μg/ml)一同添加到KHYG-1细胞中，得到感染细胞。感染3天后用嘌呤霉素(0.5μg/ml)直接进行药剂选择，得到嘌呤霉素抗性细胞。将此细胞中的αCCR8-2-CAR-12表达量用PPE标记抗Flag抗体染色，由流式细胞仪解析。结果，CAR阳性率是86％。
以上确证，αCCR8-2-CAR-12在KHYG-1细胞表面表达。
使用表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞，将对于Luc/ATN-1细胞的细胞损伤活性与实施例4同样地用钙黄绿素法评价。
结果确认到，表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞与作为阴性对照的亲本细胞的KHYG-1细胞比较，对于ATN-1细胞有显著差异的强力的细胞损伤活性(图14)。
(3)抗CCR8抗体的抑制活性评价
由表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞的对于ATN-1细胞的损伤活性由有中和活性的抗CCR8抗体抑制与否探讨。作为抗CCR8抗体，使用表1中所示的作为抗CCR8抗体的αCCR8-1抗体及BioLegend公司抗CCR8抗体(L263G8)。再者，作为阴性对照抗体，使用SYNAGIS。抗体浓度全部调至最终纳度成为33nM。通过预先将这些抗体添加到ATN-1细胞中，在其10分钟后加作为效应子细胞的KHYG-1细胞或表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞，进行细胞损伤活性评价。钙黄绿素评价法与实施例4同样地进行。结果的显示将抗体未添加对照的杀伤率表示为100％。
结果，由KHYG-1细胞的ATN-1细胞的细胞损伤活性由任何抗体均几乎不被抑制。一方面，由表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞的对于ATN-1细胞的细胞损伤活性与抗体未添加或阴性对照的SYNAGIS抗体添加组比较，在添加αCCR8-1抗体及L263G8抗体时，任何一方均被显著地抑制50％以上。
以上的结果确证，由表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞的ATN-1细胞损伤活性经在ATN-1细胞表面表达的人CCR8分子(图15)。
【实施例14：表达人CCR8的肿瘤细胞移植小鼠中的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的抗肿瘤效果】
在作为免疫缺陷小鼠的SKID/Beige小鼠(雌、10周龄)的背部皮下移植5×106个表达人CCR8的Rat-1细胞。在移植后第8天，对肿瘤体积进行测定，以平均值变得相同的方式分为2组之后，将每小鼠3×106个亲本细胞的KHYG-1细胞或在实施例13中得到的表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞在移植第8、13及16天肿瘤内施用30μl(N＝3)。将靶细胞在移植第8、13、16、17及20天对肿瘤体积及体重进行测定。再者，肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2计量。
结果，与作为对照的亲本细胞的KHYG-1细胞的施用组比较，在表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞的施用组中，肿瘤体积的增加率被显著地抑制(图16)。再者，两施用组在体重变化中确认不到差异。
【实施例15：使用表达抗CCR8-CAR的iPS细胞来源NK细胞的细胞损伤活性评价】
(1)人iPS细胞来源NK细胞的制作
使用人iPS细胞(TkDN4-M、东京大学茎细胞库)，参考公知的方法(CancerScience、2020年、第111卷、1478-1490页)，优化培养方法而制作iPS细胞来源的NK细胞。对于培养的分化细胞，用FACS解析确认NK细胞特异性的表面抗原。在分化诱导2周后的细胞组中，确认到作为造血前驱标志物的CD34及CD45的表达的一方，在分化诱导第5周的细胞组中CD34的表达降低，一方面，还可看作成熟的造血细胞的CD45的表达量增加。另外，分化诱导第5周的细胞组是NK标志物的CD56的表达率是50％以上，也同样地确认对于细胞损伤活性重要的NKG2D、KIR2D等的表达。
(2)抗CCR8-CAR搭载慢病毒载体制作
将编码合成的αCCR8-2-CAR-2的DNA克隆到慢病毒载体pCDH-EF1-MCS(SystemBiosciences公司)的多克隆位点中，作为αCCR8-2-CAR-2慢病毒载体。
向Poly-L-Lysine(Sigma)处理的皿接种使用加10％ FCS、Penicillin-Streptomycin(ThermoFisherScientific)的DMEM培养基(Sigma)于37℃、5％CO2培养的Lenti-X293T细胞(宝生物)。使用ppPACKH1 Lentivector Packaging Kit(SystemBiosciences公司)，根据试剂盒记载的方法而包装，作为αCCR8-2-CAR-2搭载慢病毒载体。
再者，作为阴性对照，仅将慢病毒载体pCDH-EF1-MCS使用ppPACKH1LentivectorPackaging Kit(System Biosciences公司)，根据试剂盒记载的方法而合成病毒载体，作为阴性对照病毒载体。
(3)向人iPS细胞来源NK细胞导入慢病毒载体
以成为最终浓度1mg/ml的方式添加作为慢病毒导入辅助剂的Synperonic F108(SIGMA-Aldrich公司)，再者，以对于人iPS细胞来源NK细胞成为20,000vps/cell的方式添加αCCR8-2-CAR-2搭载慢病毒载体和阴性对照病毒载体，于37℃、5％CO2培养大概24小时。
该基因导入细胞导入后大概24小时以内，在对于成为目标细胞的表达人CCR8的Rat-1细胞的细胞损伤活性评价中使用。
(4)人iPS细胞来源NK细胞的抗CCR8-CAR表达解析
基因导入人iPS细胞来源NK细胞的大概24小时后，将抗CCR8-CAR的细胞表面上的表达率使用抗FLAG抗体(PE-anti-DYKDDDDK Tag Clone：L5、BioLegend公司)进行定量。将细胞由Zombie NIR Fiable Viability Kit(BioLegend公司)、抗FLAG抗体及抗CD56抗体(Brilliant Violet421-anti-human CD56 clone：HCD56、BioLegend公司)，1小时于室温染色，用细胞损伤活性评价用缓冲液(DMEM/4％FCS)清洗2次后，由流式细胞仪评价抗CCR8-CAR的细胞表面表达率。结果，在人iPS细胞来源NK细胞的表面上表达约20％的αCCR8-2-CAR-2。
(5)由钙黄绿素的表达人CCR8的细胞的标记
将标记的表达人CCR8的细胞以成为1.8×106个/3ml以下的方式悬浮于DMEM/10％FCS培养基，以成为终浓度10μg/ml的方式添加溶解于DMSO的钙黄绿素(Calcein-AM、349-07201、DOJINDO公司)。使细胞培养液悬浮后，于37℃、5％CO2培养30分钟。其后，将细胞用细胞损伤活性评价缓冲液(DMEM/4％ FCS)清洗2次，在细胞损伤活性评价中使用。
(6)由抗CCR8-CAR导入iPS细胞来源NK细胞的表达人CCR8的细胞的细胞损伤活性
向iPS细胞来源NK细胞导入基因的24小时后，以作为目标细胞在上述(5)中制作的钙黄绿素标记的表达人CCR8的Rat-1细胞和基因导入iPS细胞来源NK细胞和目标细胞的比率(E/T细胞比率)成为最大10:1的方式与细胞损伤活性评价缓冲液混合，以成为以下3倍公比的E/T细胞比率的方式阶段稀释。
细胞损伤活性使用U底96孔评价。在将基因导入iPS细胞来源NK细胞和目标细胞混合之后，使用板离心机以2000rpm离心5分钟，使细胞沉下。将细胞混合后，于37℃、5％CO2培养30分钟。其后，使用板离心机以2000rpm离心5分钟，从板缓慢地分取细胞上清70μl。分取的上清在30分钟以内使用荧光测定器对上清中所含的荧光量进行定量。
自各目标细胞的钙黄绿素的自然释放量(BG)通过对仅各目标细胞的孔的上清同样地进行测定来确定。另外，全钙黄绿素释放量(TOTAL)通过以TritonX-100成为0.1％的方式向仅各目标细胞的孔添加1％TritonX-100，对同等量的上清进行测定来确定。
以从杀伤的目标细胞释放的钙黄绿素量作为指标的细胞损伤活性的计算方法用下式算出：
[(各孔的荧光值-BG荧光值)/((TOTAL荧光值-BG荧光值)]×100(％)
减去自然释放，将全细胞被杀伤时(此时由利用Triton的细胞完全溶解释放到上清中的荧光量)的上清中荧光量设为100％，算出杀伤率(％)。
结果示于图17A。与基因导入阴性对照时比较，在基因导入αCCR8-2-CAR-2的iPS细胞来源NK细胞中，确认到表达人CCR8的细胞依赖性并且表达抗CCR8-CAR的细胞特异性的细胞损伤活性。
【实施例16：使用表达抗CCR8-CAR的iPS细胞来源巨噬细胞的细胞损伤活性评价】
(1)向人iPS细胞来源巨噬细胞的培养
将人iPS细胞(TkDN4-M、东京大学茎细胞库)参考公知的方法(Mol.Ther.NucleicAcids、2018年、第12卷、793-804页)优化，制作iPS细胞来源巨噬细胞。对于培养的分化细胞，用FACS解析确认巨噬细胞特异性的表面抗原。在分化诱导36天后的细胞组中作为造血前体细胞标志物的CD34的表达减少，一方面，也被看作成熟的造血细胞的CD45的表达量增加。另外，确认到作为巨噬细胞特有的表面抗原的CD11b、CD14的表达。
(2)向人iPS细胞来源巨噬细胞的抗CCR8-CAR的mRNA导入
将iPS细胞来源巨噬细胞用PBS(-)清洗后，通过将0.05％ Trypsin-EDTA于37℃、5％CO2处理20分钟来回收。回收的细胞用培养基清洗后，以成为5×105个/100μl的方式悬浮于P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit(Lonza)的溶液。将αCCR8-2-CAR-2mRNA和阴性对照mRNA各自0.25μl(0.5μg)与pmaxGFP Vector(Lonza)0.1μl(0.1μg)一同添加到加入100μl的细胞溶液的Single Nucleocuvette(100μl)中，选择4D-Nucleofector装置的正常人巨噬细胞基因导入流程进行基因导入。将mRNA导入后的细胞于37℃、5％CO2培养16～18小时。该转化细胞在mRNA导入后20小时以内，在对于成为目标细胞的表达人CCR8的细胞的细胞损伤活性评价中使用。
(3)表达人CCR8的细胞的标记
将标记的表达人CCR8的细胞由CTS TrypLE Select Enzyme(Gibco)回收，用未添加血清的DMEM培养基清洗1次，以成为1×106个/ml以下的方式悬浮于无添加血清的DMEM培养基。以成为稀释1000倍的方式加CellTrace Far Red staining solution，缓慢搅拌，于37℃、恒温槽静置20分钟。加等量的DMEM/10％ FCS培养基，进行离心，用iPS细胞来源巨噬细胞培养用培养基清洗1次后，以成为1.5×106个/ml的方式悬浮于iPS细胞来源巨噬细胞培养用培养基，在细胞损伤活性评价中使用。
(4)由抗CCR8-CAR导入iPS细胞来源巨噬细胞的表达人CCR8的细胞的细胞损伤活性评价
为了验证iPS细胞来源巨噬细胞的对于表达人CCR8的Rat-1细胞的细胞损伤活性，评价细胞吞噬活性。
在转化iPS细胞来源巨噬细胞的20小时后，以作为目标细胞在上述(3)中制作的作为被CellTrace Far Red staining solution染色的表达人CCR8的Rat-1细胞和转化iPS细胞来源巨噬细胞的比率的功能细胞/目标细胞比率(E/T细胞比率)成为3:1(1.5×105个:5.0×104个)的方式在iPS细胞来源巨噬细胞培养用培养基200μl中混合。混合液加到96孔圆底板，使用板离心机以100g延伸2分钟，使细胞沉下，于37℃、5％CO2培养2小时。其后，将细胞以3000rpm离心30秒钟后除上清，悬浮于加入0.05μg/ml DAPI的100μl的SFEB培养基/1％BSA。对于表达CCR8的细胞的细胞吞噬活性用流式细胞仪检测。
细胞吞噬活性的计算方法用下式算出：
[(GFP·Far Red共阳性细胞)/(GFP阳性细胞)]×100(％)
结果，与基因导入阴性对照的细胞比较，在基因导入αCCR8-2-CAR-2的细胞中，确认到表达人CCR8的细胞依赖性并且表达抗CCR8-CAR的细胞特异性的细胞损伤活性。
再者，还用将(2)往后换成以下的方法来进行的别法进行细胞损伤活性评价。
(2')向人iPS细胞来源巨噬细胞的抗CCR8-CAR的质粒导入
将iPS细胞来源巨噬细胞用PBS(-)清洗后，通过将0.05％ Trypsin-EDTA于37℃、5％CO2处理20分钟来回收。回收的细胞用培养基清洗后，以成为5×105个/100μl的方式悬浮于P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit(Lonza)的溶液。将αCCR8-2-CAR-2载体0.2μl(0.5μg)与pmaxGFP Vector(Lonza)0.1μl(0.1μg)一同添加到加入100μl的细胞溶液的Single Nucleocuvette(100μl)中，选择4D-Nucleofector装置的正常人巨噬细胞基因导入流程进行基因导入。将mRNA导入后的细胞于37℃、5％CO2培养16～18小时。该转化细胞在质粒导入后20小时以内，在对于成为目标细胞的表达人CCR8的细胞的细胞损伤活性评价中使用。
(3')表达人CCR8的细胞的标记
将标记的表达人CCR8的细胞由CTS TrypLE Select Enzyme(Gibco)回收，用未添加血清的DMEM培养基清洗1次，以成为1×106个/ml以下的方式悬浮于无添加血清的DMEM培养基。以成为稀释1000倍的方式加CellTrace Far Red staining solution，缓慢搅拌，于37℃、恒温槽静置20分钟。加等量的DMEM/10％ FCS培养基，进行离心，用iPS细胞来源巨噬细胞培养用培养基清洗1次后，以成为1.5×106个/ml的方式悬浮于iPS细胞来源巨噬细胞培养用培养基，在细胞损伤活性评价中使用。
(4')由抗CCR8-CAR导入iPS细胞来源巨噬细胞的表达人CCR8的细胞的细胞损伤活性评价
为了验证iPS细胞来源巨噬细胞的对于表达人CCR8的Rat-1细胞的细胞损伤活性，评价细胞吞噬活性。
在转化iPS细胞来源巨噬细胞的20小时后，以作为目标细胞在上述(3')中制作的作为被CellTrace Far Red staining solution染色的表达人CCR8的Rat-1细胞和转化iPS细胞来源巨噬细胞的比率的功能细胞/目标细胞比率(E/T细胞比率)成为3:1(1.5×105个:5.0×104个)的方式在iPS细胞来源巨噬细胞培养用培养基200μl中混合。混合液加到96孔圆底板，使用板离心机以100g延伸2分钟，使细胞沉下，于37℃、5％CO2培养2小时。其后，将细胞以3000rpm离心30秒钟后除上清，悬浮于加入0.05μg/ml DAPI的100μl的SFEB培养基/1％BSA。对于表达CCR8的细胞的细胞吞噬活性用流式细胞仪检测。
细胞吞噬活性的计算方法对于αCCR8-2-CAR-2而用发生基因导入的GFP阳性细胞和不发生基因导入的GFP阴性细胞如以下一样算出。
·GFP阳性细胞的细胞吞噬活性：
[(GFP·Far Red共阳性细胞)/(GFP阳性细胞)]×100(％)
·GFP阴性细胞的细胞吞噬活性：
[(GFP阴性·Far Red阳性细胞)/(GFP阴性细胞)]×100(％)
结果示于图17B。与作为阴性对照的GFP阴性细胞比较，在基因导入αCCR8-2-CAR-2的GFP阳性细胞中，确认到细胞损伤活性的显著的升高(Student t-test、P＜0.005)。
【实施例17：对于人卵巢癌来源肿瘤内浸润Treg细胞的表达抗CCR8-CAR的NK细胞的细胞损伤活性评价】
(1)人卵巢癌来源肿瘤内浸润Treg细胞的调制
使用Tumor Dissociation Kit、human(Miltenyi Biotec公司)分散人卵巢癌患者来源肿瘤组织，调制含Treg细胞或CD8阳性T细胞、Treg细胞以外的CD4阳性T细胞的细胞集团。在实验中，使用刚调制或冷冻保存后的细胞。
(2)人卵巢癌来源肿瘤内浸润Treg细胞的CCR8阳性率测定
对于在上述(1)中得到的细胞集团，使用流式细胞术，对肿瘤内浸润Treg细胞中的CCR8阳性率进行测定。使细胞悬浮于添加Human TruStain FcX(BioLegend公司)及ZombieNIR Fixable Viability Kit(BioLegend公司)的HBSS/2％FCS/10mM HEPES缓冲液中，于4℃静置30分钟。清洗后，添加各种抗体而于4℃静置30分钟(Bv785标记抗人CD45抗体、AlexaFlour700标记抗人CD3抗体、Bv711标记抗人CD4抗体、PE标记抗人CCR8抗体、Bv605标记抗人CD56抗体、Bv510标记抗人CD8抗体(全部BioLegend公司))。清洗后，使用eBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set(ThermoFisher公司)固定及膜透过处理后，添加APC标记抗人Foxp3(ThermoFisher公司)而于4℃静置30分钟。清洗后，使用流式细胞仪，对肿瘤内浸润Treg细胞(CD45·CD3·CD4·Foxp3阳性并且，ZombieNIR·CD8·CD56阴性级分)中的CCR8阳性率进行测定。
(3)由表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的人肿瘤内浸润Treg细胞损伤活性评价
以在上述(1)中得到的人卵巢癌来源肿瘤内浸润Treg细胞作为靶细胞使用，以转化αCCR8-2-CAR-2mRNA或阴性对照mRNA的KHYG-1细胞作为效应子细胞使用。当用与实施例5同样的方法计算转化后20小时的KHYG-1细胞表面上的αCCR8-2-CAR-2表达率时，是22％。
细胞损伤活性评价经转化后20小时～44小时实施。在96孔圆底板上各1×105个/well接种靶细胞及效应子细胞，培养液使用RPMI1640/10％ FCS/1％PS。
评价开始24小时后回收细胞，悬浮于添加Human TruStain FcX(BioLegend公司)及Zombie NIRTM Fixable Viability Kit(Biolegend公司)的HBSS/2％FCS/10mM HEPES缓冲液，于4℃静置30分钟。清洗后，添加各种抗体，于4℃静置30分钟(Bv785标记抗人CD45抗体、AlexaFlour700标记抗人CD3抗体、Bv605标记抗人CD56抗体、Bv711标记抗人CD4、Bv510标记抗人CD8抗体(全部Biolegend公司))。清洗后，使用eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set(ThermoFisher公司)固定及膜透过处理后，添加APC标记抗人Foxp3(ThermoFisher公司)于4℃静置30分钟。
清洗后，使用流式细胞仪，对生存的CD45阳性细胞中的肿瘤内浸润Treg细胞(CD45·CD3·CD4·Foxp3阳性，并且Zombie NIR·CD8·CD56阴性级分)的比例进行定量。
结果，与阴性对照mRNA导入细胞相比，在表达αCCR8-2-CAR-2的KHYG-1细胞中确认到肿瘤内浸润Treg细胞的显著的减少(图18、Student t-test、P＜0.005)。另外，其减少幅与肿瘤内浸润Treg细胞的CCR8阳性率大致一致。
从以上可确认到，表达αCCR8-2-CAR-2的KHYG-1细胞相对于表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞具有强力的细胞损伤活性。
(4)由表达抗CCR8-CAR的末梢血来源NK细胞的人肿瘤内浸润Treg细胞损伤活性评价
以在上述(1)中得到的人卵巢癌来源肿瘤内浸润Treg细胞作为靶细胞使用，以在实施例11中得到的转化αCCR8-2-CAR-2mRNA或阴性对照mRNA的末梢血来源NK细胞作为效应子细胞使用。
转化20小时后回收细胞，悬浮于添加Human TruStain FcX(BioLegend公司)及Zombie NIR Fixable Viability Kit(Biolegend公司)的HBSS/2％ FCS/10mM HEPES缓冲液，于4℃静置30分钟。清洗后，添加各种抗体于4℃静置30分钟(Bv785标记抗人CD45抗体、AlexaFlour700标记抗人CD3抗体、Bv605标记抗人CD56抗体、PE标记抗FLAG抗体(全部Biolegend公司))。清洗后，当使用流式细胞仪计算αCCR8-2-CAR-2表达率时，是5％。细胞损伤活性评价与上述(3)同样地进行。
结果确认到，与阴性对照mRNA导入末梢血来源NK细胞相比，在αCCR8-2-CAR-2mRNA导入末梢血来源NK细胞中肿瘤内浸润Treg细胞的显著的减少。(图19、Student t-test、P＜0.005)。另外可确认到，其减少幅与肿瘤内浸润Treg细胞的CCR8阳性率大致一致，因此表达αCCR8-2-CAR-2的末梢血来源NK细胞相对于表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞具有强力的细胞损伤活性。
【实施例18：对于人大肠癌来源肿瘤内浸润Treg细胞的表达抗CCR8-CAR的NK细胞的细胞损伤活性评价】
以用与实施例17(1)同样的方法从人大肠癌患者来源肿瘤组织得到的肿瘤内浸润Treg细胞作为靶细胞使用，以在实施例11中得到的转化αCCR8-2-CAR-2mRNA或阴性对照mRNA的末梢血来源NK细胞作为效应子细胞使用。用与实施例17(3)同样的方法接种细胞后，在第5天使用流式细胞仪对肿瘤内浸润Treg细胞的存在比、及，CD8阳性T细胞和肿瘤内浸润Treg细胞以外的CD4阳性T细胞的IFNγ产生进行定量。回收细胞后，用IFNγ检测试剂(IFN-γSecretion Assay-Detection Kits,human、Miltenyi Biotech公司)及实施例17(3)的各种标记抗体进行细胞染色。
使用流式细胞仪的测定的结果确认到，与阴性对照mRNA导入末梢血来源NK细胞相比，在αCCR8-2-CAR-2mRNA导入末梢血来源NK细胞中肿瘤内浸润Treg细胞的显著的减少(图20、Student t-test、P＜0.005)。另外确认到，CD8阳性T细胞及肿瘤内浸润Treg细胞以外的CD4阳性T细胞的IFNγ阳性率增加的倾向。
从以上可确认到，表达αCCR8-2-CAR-2的末梢血来源NK细胞具有表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞除去活性及T细胞活化效果。
【实施例19：表达人CCR8的肿瘤细胞(ATL细胞株来源ATN-1细胞)移植小鼠中的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的抗肿瘤活性评价】
向敲入人IL-15的NOG小鼠(29周龄、雌)的腹腔内移植1×107个(100μl)导入荧光素酶基因的ATN-1细胞。ATN-1细胞是自然表达人CCR8的细胞株。
肿瘤移植2、5天后，表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞施用组向腹腔内施用2×106个(100μl)在实施例13中得到的表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞，对照组向腹腔内施用2×106个(100μl)KHYG-1细胞(N＝7)。在肿瘤移植2、7、12、14天后向小鼠静脉施用D-Luciferin(住商PharmaInternational)PBS稀释液(15mg/ml)100μl，使用IVIS Spectrum(PerkinElmer)，对肿瘤的发光强度进行测定。发光强度从测定实数值减去背景的测定值来算出，测定在Exposure time：5秒钟、Binning：low、F/Stop：1的条件下进行。发光强度是使ROI的范围内的总发光强度定量化的数值，以每测定时ROI面积变得相同的方式设定。在发光图像的解析软中使用living image○R3.2。在显著差异检验中使用Mann-Whitney U法(显著水平：P＜0.05)。
结果，在肿瘤移植7、12、14天后，在表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞施用组中，与对照组比较，肿瘤的发光强度见到显著的减少(图21及22)。
以上表明，表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞在表达人CCR8的肿瘤细胞移植小鼠中显示抗肿瘤活性。
【实施例20：移植大肠癌来源CT26细胞的人CCR8敲入小鼠(以下，hCCR8-KI(KI/KI)小鼠)中的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的抗肿瘤活性评价】
向hCCR8-KI(KI/KI)小鼠(13周龄、雌)的背部皮内移植CT26细胞株。在肿瘤移植7、9、10天后，在表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞施用组中向腹腔内施用2×106个(100μl)在实施例13中得到的表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞，在对照组中向腹腔内施用2×106个(100μl)KHYG-1细胞(N＝7)。在肿瘤移植7天后起每3～4天对肿瘤体积进行测定。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2计量，进行由Mann-Whitney U法的显著差异检验(显著水平：P＜0.05)。
结果确认到，在肿瘤移植10天后，在表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞施用组中，与对照组比较显著的肿瘤体积的减少。另外，在肿瘤移植14天后也确认到减少倾向(图23、P＝0.0973)。
以上表明，表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞在大肠癌移植hCCR8-KI(KI/KI)小鼠中显示抗肿瘤活性。
【实施例21：移植大肠癌来源CT26细胞的hCCR8-KI(KI/KI)小鼠中的表达抗CCR8-CAR的KHYG-1细胞的对于肿瘤内浸润Treg细胞的细胞损伤活性评价】
向hCCR8-KI(KI/KI)小鼠(10周龄、雌)的背部皮内移植CT26细胞株。肿瘤移植8天后，在表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞施用组中向肿瘤内施用2×106个(40μl)在实施例13中得到的表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞，在对照组中向肿瘤内施用2×106个(40μl)KHYG-1细胞(N＝5)。在细胞施用1天后从小鼠回收肿瘤。用夹细切断肿瘤块，使用TumorDissociation Kit,mouse(Miltenyi)，根据试剂盒的附带流程调整肿瘤浸润细胞悬浮液。将细胞悬浮液使用Fixable Viability Dye eFluor 780试剂(eBioscience)，于4℃染色30分钟。用2％ FCS/10mM HEPES/HBSS清洗1次后，非荧光标记抗人CCR8抗体(或者isotypecontrol抗体)4℃、30分钟染色。用2％ FCS/10mM HEPES/HBSS清洗2次后，用AF647标记抗大鼠IgG抗体于4℃染色30分钟。用Bv510标记抗小鼠CD45、Bv605标记抗小鼠TCRβ、Bv785标记抗小鼠CD4抗体于4℃染色30分钟。用2％ FCS/HEPES/HBSS清洗后，将细胞使用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set(eBioscience)根据附带流程固定，使用PE标记抗小鼠FoxP3抗体对细胞内FoxP3进行染色。用所述试剂盒附带缓冲液清洗后，使用流式细胞仪选通T细胞(CD45+TCRβ+)，对肿瘤内浸润Treg细胞(CD4+Foxp3+)中的CCR8阳性率进行解析。在显著差异检验中使用Student t-test法(显著水平：P＜0.05)。接下来，显示使用的染色抗体。再者，抗人CCR8抗体使用可基于WO2020/138489号公报的实施例2记载的方法的抗体。
rat IgG2a isotype control抗体(BioXcell)
AF647 AffiniPureF(ab')Fragment Donkey Anti-Rat IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch)
PE抗小鼠/大鼠FoxP3(clone FJK-16s,eBiosciences)
Bv510抗小鼠CD45(clone 30-F11,Biolegend)
Bv605抗小鼠TCRβ(clone PC61,BioLegend)
Bv421抗小鼠CD25(clone PC61,BioLegend)
Bv785抗小鼠CD4(clone RM4-5,BioLegend)
结果确认到，在表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞施用组中，与对照组比较，肿瘤内浸润Treg细胞中的CCR8阳性细胞的显著的减少(图24)。
以上表明，表达αCCR8-2-CAR-12的KHYG-1细胞在小鼠活体内具有除去表达人CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞的倾向。
【产业上的利用可能性】
本发明的以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体通过使效应子细胞表达，相对于表达CCR8的细胞具有细胞损伤活性。即，本发明的以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体的表达细胞作为用于CCR8关联疾病的治疗或预防的医药非常地有用。
序列表
<110> SHIONOGI & CO., LTD.
OSAKA UNIVERSITY
<120> 以CCR8作为抗原识别的嵌合抗原受体
<130> P2021-00009WO01
<150> JP2021-059086
<151> 2021-03-31
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S肽接头
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头和Flag表位
<400> 3
Ala Asn Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 7
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 8
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VL
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Gln Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VH
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2 VL
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2 VH
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VL
<400> 16
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr Gln Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VH
<400> 17
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Ser Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ala Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Gln Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-4 VL
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-4 VH
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Glu Ile Arg Pro Leu Gly Asp Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-5 VL
<400> 20
Glu Ile Val Met Thr Gln Ala Val Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp
115
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-5 VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Glu Ile Arg Pro Leu Gly Asp Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-6 VL
<400> 22
Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 23
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-6 VH
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Lys Phe Gly Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VL CDR1
<400> 24
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VL CDR2
<400> 25
Arg Met Ser Gln Leu Ala Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VL CDR3
<400> 26
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VH CDR1
<400> 27
Thr Tyr Ala Leu Tyr
1 5
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VH CDR2
<400> 28
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-1 VH CDR3
<400> 29
Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2 VL CDR1
<400> 30
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2 VL CDR2
<400> 31
Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2 VL CDR3
<400> 32
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2 VH CDR1
<400> 33
Thr Tyr Ala Met Tyr
1 5
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2 VH CDR3
<400> 34
Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VL CDR1
<400> 35
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VL CDR2
<400> 36
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VL CDR3
<400> 37
Ser Gln Ser Thr Gln Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VH CDR1
<400> 38
Ala Tyr Gly Val His
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VH CDR2
<400> 39
Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-3 VH CDR3
<400> 40
Lys Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-4 VL CDR2
<400> 41
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-4 VH CDR1
<400> 42
Thr Asn Ala Met Asn
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-4 VH CDR3
<400> 43
Glu Ile Arg Pro Leu Gly Asp Phe Asp Val
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-6 VL CDR1
<400> 44
Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-6 VL CDR2
<400> 45
Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-6 VL CDR3
<400> 46
Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-6 VH CDR1
<400> 47
Ala Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-6 VH CDR3
<400> 48
His Lys Phe Gly Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 355
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
Met Asp Tyr Thr Leu Asp Leu Ser Val Thr Thr Val Thr Asp Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Pro Asp Ile Phe Ser Ser Pro Cys Asp Ala Glu Leu Ile Gln Thr
20 25 30
Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Val Phe Tyr Cys Leu Leu Phe Val Phe
35 40 45
Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Val Cys Lys
50 55 60
Lys Leu Arg Ser Ile Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser
65 70 75 80
Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Phe Pro Phe Gln Thr Tyr Tyr Leu Leu
85 90 95
Asp Gln Trp Val Phe Gly Thr Val Met Cys Lys Val Val Ser Gly Phe
100 105 110
Tyr Tyr Ile Gly Phe Tyr Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser
115 120 125
Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Val His Ala Val Tyr Ala Leu Lys Val
130 135 140
Arg Thr Ile Arg Met Gly Thr Thr Leu Cys Leu Ala Val Trp Leu Thr
145 150 155 160
Ala Ile Met Ala Thr Ile Pro Leu Leu Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser
165 170 175
Glu Asp Gly Val Leu Gln Cys Tyr Ser Phe Tyr Asn Gln Gln Thr Leu
180 185 190
Lys Trp Lys Ile Phe Thr Asn Phe Lys Met Asn Ile Leu Gly Leu Leu
195 200 205
Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met Phe Cys Tyr Ile Lys Ile Leu His Gln
210 215 220
Leu Lys Arg Cys Gln Asn His Asn Lys Thr Lys Ala Ile Arg Leu Val
225 230 235 240
Leu Ile Val Val Ile Ala Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val
245 250 255
Val Leu Phe Leu Thr Ser Leu His Ser Met His Ile Leu Asp Gly Cys
260 265 270
Ser Ile Ser Gln Gln Leu Thr Tyr Ala Thr His Val Thr Glu Ile Ile
275 280 285
Ser Phe Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly
290 295 300
Glu Lys Phe Lys Lys His Leu Ser Glu Ile Phe Gln Lys Ser Cys Ser
305 310 315 320
Gln Ile Phe Asn Tyr Leu Gly Arg Gln Met Pro Arg Glu Ser Cys Glu
325 330 335
Lys Ser Ser Ser Cys Gln Gln His Ser Ser Arg Ser Ser Ser Val Asp
340 345 350
Tyr Ile Leu
355
<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pUC19-T7引物
<400> 50
taatacgact cactataggg agaccagtga attcgagctc ggt 43
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pUC19-R1引物
<400> 51
gccaagcttg catgcctgc 19
<210> 52
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7-AMP-F2引物
<400> 52
taatacgact cactataggg agatgcttaa tcagtgaggc acc 43
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AMP-R1引物
<400> 53
attcaacatt tccgtgtcgc 20
<210> 54
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VL
<400> 54
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Arg
20 25 30
Tyr Asn Ile Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
<210> 55
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VH
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Asp Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Tyr Asp Val Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Ser Gly Asn Trp Phe Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VL CDR1
<400> 56
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Ile Met His
20
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VL CDR2
<400> 57
Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VL CDR3
<400> 58
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VH CDR1
<400> 59
Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VH CDR2
<400> 60
Thr Ile Thr Tyr Asp Val Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-7 VH CDR3
<400> 61
His Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Ser Gly Asn Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 2855
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCCR8-2-CAR-12-IRES-嘌呤霉素DNA
<400> 62
gcggccgcca ccatggccct ccctgtaact gccctgctgc ttcctctggc tcttttgttg 60
catgccgcac gacccgaagt gcaactggtg gagagtggcg gcgcgctcgt gaagcccgga 120
ggcagtctgc gcctgagctg tgccgcatca ggctttacat tctcaacata cgccatgtac 180
tgggtacgac aagccccggg caaggggttg gagtgggttg gccgcatccg ctccaagtca 240
aataattatg ccacgtacta cgcggatagc gtcaaagata ggtttacgat ttcaagggat 300
gattcaaaga atacgctgta tctgcaaatg aattccctta aaaccgagga tacagctgtc 360
tactactgca ctcgaggtgg ttatggcaac tataggtacg cgatggacta ctggggccaa 420
ggcacaaccg ttacggtgag tagcggcggt ggcggatctg gcggaggcgg gagcggaggt 480
ggcggttccg aaatagtgct cacgcaaagt cctgggacgc tgagcctcag tccaggagaa 540
cgagctacgt tgtcctgccg atcctccaag agtcttcttc attcaaacgg caacacatac 600
ctttactggt atcaacagaa acctggtcag gctccacgac tgttgatcta ccgcgtcagt 660
aacctggcta gtggtatacc tgatcgattt agcggatcag gttcaggcac agactttacc 720
cttactatca gccgcctgga acccgaggac tttgctgttt actactgcat gcaacatctt 780
gagtaccctt ttacattcgg gcagggaaca aagctggaga tcaaagctaa cgcgtcagat 840
tataaggacg atgatgataa aactactact ccagcgccac gaccaccgac cccagcgcct 900
acaattgcga gccagccgct gtctttgcgc ccagaggctt gcaggccagc agctggaggt 960
gcggtacaca cgcgcggcct ggacttcgct tgtgatatct acatttgggc cccgctggcc 1020
ggaacttgtg gtgtactcct gctgagcctg gttattacgc tgtactgtaa acggggacga 1080
aagaaactct tgtacatatt caagcaaccc tttatgaggc ccgtacagac gacacaggaa 1140
gaggacggat gcagctgtcg gttccccgag gaggaagagg gcggttgtga actcctctgc 1200
gctaggcctc gccgaagccc tgcacaggaa gacggcaaag tatacattaa tatgccgggt 1260
agaggccggg tcaaattctc taggtcagca gacgcccctg catatcaaca agggcagaat 1320
cagttgtata atgaattgaa cctgggccgc cgggaagagt acgatgtcct cgataagaga 1380
aggggccgcg acccagagat gggaggaaag ccacaacgac gaaagaaccc tcaggaaggc 1440
ctttataatg agcttcagaa ggacaaaatg gcggaggcct attctgaaat cggcatgaaa 1500
ggcgagcgca ggcggggcaa agggcacgac ggcctctacc aaggtctcag tacagcgaca 1560
aaggacacgt acgatgcact tcatatgcaa gccctcccac ctcggtgata aggatccgga 1620
attccgcccc cccccccccc ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 1680
ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 1740
ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 1800
tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 1860
tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 1920
cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 1980
ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 2040
ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 2100
atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg 2160
tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataagcttg 2220
ccacaaccca caaggagacg accttccatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc 2280
acccgcgacg acgtcccccg ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc 2340
gccacgcgcc acaccgtcga cccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa 2400
ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc 2460
gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc 2520
ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc 2580
ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg 2640
cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc 2700
gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac 2760
gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg 2820
tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgagcg gccgc 2855

Claims (44)

1.嵌合抗原受体，
其含与CCR8结合的细胞外区域、跨膜区域及细胞内区域，
其中所述细胞内区域含作为效应子细胞发挥功能的淋巴细胞表达的信号传递分子的细胞内信号区域。
2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中与CCR8结合的细胞外区域含抗CCR8-scFv区域。
3.权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
(1)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3；
(2)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3；
(3)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：35的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：36的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：37的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：38的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：39的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：40的氨基酸序列构成的CDR3；
(4)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：41的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：42的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：43的氨基酸序列构成的CDR3；
(5)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：44的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：45的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：46的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：47的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：48的氨基酸序列构成的CDR3；或者
(6)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：56的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：57的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：58的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：59的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：60的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：61的氨基酸序列构成的CDR3。
4.权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：(1)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3；
(2)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3；或者
(4)轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：41的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：42的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：43的氨基酸序列构成的CDR3。
5.权利要求4所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的CDR2，及由SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的CDR3。
6.权利要求4所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
轻链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：31的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：32的氨基酸序列构成的CDR3；以及
重链可变区域，其含：
由SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成的CDR1，
由SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的CDR2，及
由SEQ ID NO：34的氨基酸序列构成的CDR3。
7.权利要求2或3所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
(1)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域；
(2)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域；或者
(3)具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区域。
8.权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
(1)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域；或者
(2)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域。
9.权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区域。
10.权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域含：
具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区域，及
具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区域。
11.权利要求2～10之任一项所述的嵌合抗原受体，其中在抗CCR8-scFv区域中，轻链可变区域和重链可变区域经SEQ ID NO：2的接头序列连接。
12.权利要求2～11之任一项所述的嵌合抗原受体，其中与CCR8结合的细胞外区域含CD8A信号序列区域。
13.权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中CD8A信号序列区域存在于抗CCR8-scFv区域的N末端侧。
14.权利要求12或13所述的嵌合抗原受体，其中CD8A信号序列区域具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
15.权利要求2～14之任一项所述的嵌合抗原受体，其中抗CCR8-scFv区域和跨膜区域经间隔物序列连接。
16.权利要求15所述的嵌合抗原受体，其中间隔物序列包含含有Flag表位的序列区域。
17.权利要求16所述的嵌合抗原受体，其中含有Flag表位的序列区域具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
18.权利要求15～17之任一项所述的嵌合抗原受体，其中间隔物序列含CD8A铰链区域。
19.权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中CD8A铰链区域具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
20.权利要求1～19之任一项所述的嵌合抗原受体，其中跨膜区域含CD8A跨膜区域。
21.权利要求20所述的嵌合抗原受体，其中CD8A跨膜区域具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
22.权利要求1～19之任一项所述的嵌合抗原受体，其中
跨膜区域含CD28跨膜区域，
细胞内区域含CD28细胞内信号区域。
23.权利要求22所述的嵌合抗原受体，其中
CD28跨膜区域具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，
CD28细胞内信号区域具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
24.权利要求1～23之任一项所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含下列之中的至少1个：4-1BB、2B4、CD3ζ及DAP10的细胞内信号区域。
25.权利要求24所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含下列之中的至少2个：4-1BB、2B4、CD3ζ及DAP10的细胞内信号区域。
26.权利要求25所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含4-1BB及CD3ζ的细胞内信号区域。
27.权利要求25所述的嵌合抗原受体，其中细胞内区域含2B4及CD3ζ的细胞内信号区域。
28.权利要求24～27之任一项所述的嵌合抗原受体，其中
细胞内区域含4-1BB细胞内信号区域，
所述4-1BB细胞内信号区域具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
29.权利要求24～27之任一项所述的嵌合抗原受体，其中
细胞内区域含2B4细胞内信号区域，
所述2B4细胞内信号区域具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
30.权利要求24～27之任一项所述的嵌合抗原受体，其中
细胞内区域含CD3ζ细胞内信号区域，
所述CD3ζ细胞内信号区域具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
31.权利要求24～27所述的嵌合抗原受体，其中
细胞内区域含DAP10细胞内信号区域，
所述DAP10细胞内信号区域具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
32.效应子细胞，其表达权利要求1～31之任一项所述的嵌合抗原受体。
33.权利要求32所述的细胞，其中效应子细胞是NK细胞。
34.权利要求32所述的细胞，其中效应子细胞是T细胞。
35.权利要求32所述的细胞，其中效应子细胞是巨噬细胞。
36.权利要求32～35之任一项所述的细胞，其中效应子细胞来源于末梢血。
37.权利要求32～35之任一者记载的细胞，其中效应子细胞是从干细胞分化的。
38.权利要求36所述的细胞，其中干细胞是iPS细胞。
39.医药组合物，其含有权利要求32～38之任一项所述的细胞。
40.权利要求39所述的医药组合物，其用于治疗癌。
41.权利要求40所述的医药组合物，其具有表达CCR8的肿瘤内浸润Treg细胞的除去作用。
42.权利要求40所述的医药组合物，其具有表达CCR8的肿瘤细胞的除去作用。
43.多核苷酸，其编码权利要求1～31之任一项所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列。
44.表达载体，其含权利要求43所述的多核苷酸。
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