CN1172926C - 黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙在制备具有抗心肌缺血作用药物中的应用 - Google Patents

黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙在制备具有抗心肌缺血作用药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明是具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙，涉及中药技术领域。本发明提供了中药黄芪中的有效成分毛蕊异黄酮及其糖甙。该有效成分具有很好的抗心肌缺血作用，可以开发抗心肌缺血缺氧药物。

Description

黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙在制备具有抗心肌缺血作用药物中的应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域。具体涉及具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙。
背景技术
黄芪(Astragalus membranaceus)属豆科植物，性味甘、微温，归脾、肺经，主要功效为补气固表，利尿托毒、排脓，敛疮生肌，是中药补气药中最重要的药物之一。现代医学研究证明黄芪具有调节免疫功能、延缓衰老、促进骨髓造血和血细胞生成。目前，对黄芪研究最多、最广泛和最深入的是在心血管效应方面。众多的临床观察和实验研究表明黄芪对心脏具有良好的保护作用，在临床上能用于治疗冠心病心绞痛、心力衰竭、高血压、低血压、病毒性心肌炎、心律失常等。黄芪的化学研究表明黄芪中主要的活性成分为黄酮类、皂甙类、多糖类以及氨基酸、磷脂及微量元素。黄芪中的主要黄酮有芒柄花素、毛蕊异黄酮、黄芪异黄烷甙等近20种。
尽管黄芪对心血管的作用是肯定的，但就目前的研究而言，黄芪对心血管效应方面的药效物质是不清楚的。因此，有必要在现有的研究基础上进行深入的研究，阐明黄芪在心血管疾病治疗方面的药效物质基础和作用机制，
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于对黄芪中的有效成分进一步研究，开发具有抗心肌缺血作用的药物。
本发明提供了一种具有下列结构式的黄芪毛蕊异黄酮(Calycosin)及其糖甙(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)在制备抗心肌缺血作用药物中的应用。
Figure C0112660800041
毛蕊异黄酮(calycosin)MW＝284
毛蕊异黄酮糖甙HPCL图谱见图4。
毛蕊异黄酮糖甙(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)MW＝446
毛蕊异黄酮糖甙HPLC图谱见图5。
本发明的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙的药理作用如下：
毛蕊异黄酮糖甙对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用：
Wistar种大鼠离体心脏的LVDP(左室发展压力)、LEDVP(左室舒张末压)、±dP/dtmax(左室内压的最大上升和下降速率)和冠脉灌注压(CPP)经压力换能器连接生理信号处理***记录。实验结果见表1。结果表明10-4M的毛蕊异黄酮糖甙能够抑制LVDP、±dP/dtmax的下降，抑制LVDP和CPP的上升。该研究说明毛蕊异黄酮糖甙具有较明显的抗心肌缺血和缺血-再灌注损伤的作用，生化指标正在测试中。此外，对急性心肌缺血的作用和心肌梗塞后的心肌重构作用，已经开始。
表1毛蕊异黄酮糖甙(10-4M)对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤作用的血流动力学观察(x±s)
组别 n 时间   LVDP(mmHg)  LVEDP(mmHg)   +dp/dtmax(mmHg/s)   -dp/dtmax(mmHg/s)  CPP(mmHg)
对照组  8 缺血前   66.3±3.5  4.8±1.7   2650.1±173.2   1050.1±100.0  57.0±3.6
 8 再灌注5′   9.0±2.3  66.3±6.3   11887.5±47.9   137.5±75.1  73.8±4.8
 8 再灌注10′   9.8±2.1  72.5±6.5   175.0±28.9   115.0±43.6  78.0±4.3
 8 再灌注15′   12.5±2.9  73.8±10.3   186.5±25.1   115.6±43.6  76.3±4.7
 8 再灌注20′   12.0±4.3  76.7±12.6   177.0±64.5   109.5±42.5  79.5±6.4
 8 再灌注25′   14.5±5.2  77.8±14.2   162.5±45.9   97.5±45.0  80.8±8.1
 8 再灌注30′   17.1±3.6  78.3±13.1   187.2±100.2   94.3±40.0  81.8±9.5
治疗组  8 缺血前   67.3±2.3  5.0±2.6   2766.2±115.5   1066.1±67.7  54.3±1.7
 8 再灌注5′   21.7±5.8*  46.7±12.6*   900.3±264.6*   400.0±101.2*  65.7±4.1*
 8 再灌注10′   30.0±8.7*  43.7±14.2*   1033.3±404.1*   433.3±152.8*  67.0±2.6*
 8 再灌注15′   45.0±10.1*  36.7±7.6*   1066.7±152.8*   600.1±173.2*  65.3±2.2*
 8 再灌注20′   46.7±10.4*  41.3±11.0*   1031.3±152.8*   633.2±152.8*  63.7±3.5*
 8 再灌注25′   43.3±7.6*  44.7±13.8*   933.4±115.5*   600.2±173.2*  64.7±4.0*
 8 再灌注30′   46.7±5.8*  45.2±12.1*   900.2±100.3*   533.0±152.8*  67.3±2.5*
与对照组比较*P＜0.05
毛蕊异黄酮对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)缺氧的保护作用：
血管内皮细胞经缺氧处理60-480分钟，HUVEC单层对分子量4,4000及77,000 FITC-右旋糖苷的通透性与对照值比较，明显增加(表2、3)。当内皮细胞在缺氧的同时，加入毛蕊异黄酮，HUVEC单层对右旋糖苷通透性明显减少，毛蕊异黄酮抑制HUVEC单层通透性增加是浓度依赖性的(表4)，说明毛蕊异黄酮具有保护内皮缺氧的作用。
表2毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层通透性(分子量＝4,4000FITC-右旋糖苷，P)作用(x±s)
           剂  量                             P(cm·s-1)
                      n
          (mol/L)          60min       120min         240min         480min
对照       -          6    10.3±0.60  10.6±0.70     10.9±0.70     15.5±0.80
缺氧       -          7    13.6±0.90  18.3±0.80     23.3±1.30     28.9±1.00
           3×10-4   3    13.8±0.70  15.6±0.42**   17.4±0.58**   29.2±0.60
毛
           1×10-4   3    13.9±0.32  16.5±1.30*    19.9±0.56*    29.2±0.60
蕊
           3×10-5   3    14.2±0.91  17.2±0.55     19.9±1.04*    30.6±0.47
异
           3×10-6   4    13.5±1.01  17.2±1.25     20.4±0.81*    10.8±0.89
黄
           3×10-7   4    14.1±0.59  17.9±0.59     21.8±1.36     11.7±1.14
酮
           3×10-8   4    13.7±0.84  18.6±0.98     24.5±1.81     10.±0.59
与缺氧比较：*p＜0.05、**p＜0.01
表3毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层通透性(分子量＝77,000FITC-右旋糖苷，P)作用(x±s)
              剂量                           P(cm·s-1)
                       n
             (mol/L)         60min       120min      240min       480min
对照          -        6     3.8±0.50   3.8±0.41   4.6±0.55    6.5±0.57
缺氧          -        7     4.4±0.60   6.4±0.36   8.7±0.33    11.2±0.99
             3×10-4  3     4.2±0.32   5.2±0.21*  6.1±0.31**  10.1±0.25
毛
             1×10-4  3     4.2±0.40   5.4±0.20*  6.8±0.21**  10.4±0.46
蕊
             3×10-5  3     4.1±0.47   5.8±0.15*  7.0±0.22*   10.8±0.93
异
             3×10-6  4     4.3±0.59   5.8±0.20   7.2±0.49*   10.8±0.89
黄
             3×10-7  4     4.5±0.97   6.1±0.38   7.6±0.47    11.7±1.14
酮
             3×10-8  4     4.3±1.03   6.6±0.41   8.4±0.55    10.5±0.59
与缺氧比较：*p＜0.05、**p＜0.01
LDH含量的测定表明HUVEC单层缺氧240分钟，引起内皮细胞LDH大量释放，LDH大量释放证明了细胞的损伤程度，而毛蕊异黄酮能够显著地抑制内皮细胞LDH释放，其抑制是浓度依赖性的(表4、图6)。
表4毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层LDH释放的抑制作用(x±s)
              剂量
                      n        LDH(IU/μl)
             (mol/L)
缺氧         -        8        3827.63±721.46
             3×10-4 8        698.75±201.43**
             1×10-4 8        650.50±177.78**
毛
             3×10-5 8        706.50±244.59**
蕊
             1×10-5 8        764.25±248.71**
异
             1×10-6 8        778.75±243.46**
黄
             3×10-7 8        1244.25±341.15**
酮
             1×10-7 8        1856.37±428.63*
             1×10-8 8        2641.75±641.04*
             3×10-8 8        3021.00±548.28
与缺氧比较：*p＜0.05、**p＜0.01
ELISA法测定HUVEC单层细胞内cAMP含量表明毛蕊异黄酮能够明显地抑制缺氧引起的HUVEC单层细胞内cAMP含量的降低(表5)。
表5毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层细胞内cAMP含量的影响(x±s)
组别             n                cAMP(pmol/mg)
对照             8                590±72.8
缺氧             8                407±34.4
10-4M毛蕊异黄酮 6                549±59.8**
与缺氧比较：**p＜0.01
HUVEC单层细胞的F-肌球钙蛋白(F-actin)的荧光显微镜观察表明在正常对照的单层融合细胞，F-actin纤维是彼此平行地围绕整个细胞，其纤维的染色较深；这些纤维束通常延伸至邻近的细胞。在细胞间隙处的纤维荧光强度很强，表明这些纤维是连接纤维的接头，它们起源于细胞的外周端，通常能够分叉或再聚合(n＝6)。当血管内皮细胞经缺氧240分钟后，F-actin纤维收缩，某些地方呈断裂状，细胞间隙增宽和细胞旁路开放(n＝6)。当内皮细胞在缺氧情况下，经10-4M毛蕊异黄酮孵育240分钟，F-actin纤维出现轻微的收缩，但其形态基本正常(n＝6)。说明毛蕊异黄酮具有很强的抑制缺氧引起的F-actin纤维的收缩和细胞骨架的变化。
以上研究结果说明毛蕊异黄酮及其糖甙具有较明显的抗心肌缺血和缺血—再灌注损伤的作用，以往的文献中未见报道，因此毛蕊异黄酮及其糖甙是前景很好的抗心肌缺血缺氧的药物，具有很大市场开发前景。
附图说明
图1  正常内皮细胞骨架
图2  缺氧4小时后内皮细胞骨架
图3  毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞骨架的影响
图4  毛蕊异黄酮HPLC图谱
图5  毛蕊异黄酮糖甙HPLC图谱
图6  毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层LDH释放的抑制作用
具体实施例
抗心肌缺血的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙(细胞缺氧)
一、毛蕊异黄酮糖甙对心肌缺血再灌注损伤的作用
毛蕊异黄酮糖甙对心肌缺血再灌注损伤的作用
                                                毛蕊异黄酮
指标           时间(分钟)       缺血模型
                                          10μM    30μM      100μM
               给药前           67        60       65         65
左室发展压
               给药后           67        60       65         65
(mmHg)
               再灌30           10        18       25         45
左室舒张末     给药前           4         8        5          5
压             给药后           4         8        5          5
(mmHg)         再灌30           79        80       65         60
               给药前           56        55       58         60
冠脉压
               给药后           56        55       58         60
(mmHg)
               再灌30           81        74       75         70
最大收缩速     给药前           1600      2000     1900       1800
率             给药后           1700      2000     1900       1800
(mmHg/s)       再灌30           150       300      600        1000
最大舒张速     给药前           900       800      700        1000
率             给药后           900       800      700        1000
(mmHg/s)       再灌30           100       100      400        600
二、毛蕊异黄酮对内皮细胞缺氧的作用
正常细胞
1.跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性
荧光物质分                通透系数(cm/s)
子量         1小时         2小时        4小时      8小时
MW＝4400     10.4          10.7         11.6       15.6
MW＝77000    3.5           3.8          4.3        6.9
2.正常内皮细胞胞浆内cAMP含量645×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)
3.正常内皮细胞细胞骨架见图1.
缺氧细胞
1.跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性
荧光物质分                    通透系数(cm/s)
子量          缺氧1小时    缺氧2小时     缺氧4小时  缺氧8小时
MW＝4400      13.4         18.5          23.7       28.4
MW＝77000     4.8          6.6           9.0        12.6
2.缺氧4小时后内皮细胞胞浆内cAMP含量423×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)
3.缺氧4小时后内皮细胞骨架见图2.
4.缺氧4小时后内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放量4625单位/毫升(IU/l)
应用毛蕊异黄酮处理后的细胞
1.毛蕊异黄酮对跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性的影响
荧光物质分          毛蕊异黄酮                    通透系数(cm/s)
子量                (mmol/L)      缺氧1小时     缺氧2小时   缺氧4小时  缺氧8小时
MW＝4400             3×104      13.9          16.1        17.2       29.4
                     1×105      13.6          15.9        19.3       28.6
                     3×105      13.4          16.0        18.7       30.5
                     3×106      13.8          16.8        20.1       32.3
                     3×107      14.3          18.1        21.6       31.6
                     3×108      13.7          18.4        24.9       29.8
MW＝77000            3×104      4.3           5.1         6.2        10.1
                     1×105      4.1           5.8         6.8        10.7
                     3×105      4.0           5.5         7.0        10.5
                     3×106      4.6           5.7         7.2        10.9
                     3×l07      4.0           6.1         7.5        11.9
                     3×108      4.9           6.7         8.6        10.9
2.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞胞浆内cAMP含量的作用523×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)
3.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞骨架的影响见图3.
4.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放量
药物剂量(mmol/L)                       LDH(IU/l)
3×104                                642
1×104                                955
3×104                                686
1×105                                759
1×106                                1071
1×107                                2375
3×107                                3271
1×108                                2119
3×108                                3014

Claims (1)

1.一种具有下列结构式的黄芪毛蕊异黄酮或糖甙在制备抗心肌缺血缺氧药物中的应用：
毛蕊异黄酮(calycosin)MW＝284
Figure C011266080002C2
毛蕊异黄酮糖甙(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)
MW＝446。
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