CN117233393A - 双重免疫组化染色试剂盒及其在鉴别良恶性胆管上皮肿瘤中的应用 - Google Patents
双重免疫组化染色试剂盒及其在鉴别良恶性胆管上皮肿瘤中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于免疫组化技术领域，具体涉及一种双重免疫组化染色试剂盒及其在鉴别良恶性胆管上皮肿瘤中的应用。本发明要解决的技术问题是良恶性胆管上皮肿瘤难以快速准确判断的技术问题。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种双重免疫组化染色试剂盒,该试剂盒包括一抗试剂、二抗试剂和染色剂；所述一抗试剂包括有EZH2抗体和CK7抗体，所述二抗试剂包括EZH2二抗和CK7二抗。本发明技术方案在鉴别良恶性胆管上皮肿瘤细胞系别、分型和恶性程度判断、提高诊断灵敏度和准确性有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫组化技术领域，具体涉及一种双重免疫组化染色试剂盒及其在鉴别良恶性胆管上皮肿瘤中的应用。
背景技术
免疫组织化学（Immunohistochemisty，IHC）又称免疫细胞化学，简称免疫组化，是病理学诊断、鉴别诊断，肿瘤特异性分子靶标筛选、鉴定的最重要平台性技术。常规的免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。一般是一张切片观察一个抗原的染色结果。多色免疫组化能在一张切片上观察多个抗原的染色结果，不同抗原之间的关系对比直接，有利于节省组织与肿瘤微浸润的观察。目前，多色免疫组化技术已经应用到***、乳腺、消化道等多种疾病的病理诊断中，技术难点在于找到合适的两种或多种合适的标记物以使用一抗和二抗共同标记在同一组织切片上，以达到颜色对比鲜明，定位准确的效果。
肝内胆管癌（ICC）约占原发性肝癌的10%～20%，占胆管癌的6%～20%，是发生率仅次于肝细胞癌（HCC）的第二常见肝脏恶性肿瘤。ICC具有高度恶性的生物学行为，目前ICC患者的术后5年生存率一般在30%～50%之间。已知许多致病因素与ICC的发生有密切关系，包括华支睾吸虫、肝内胆管结石、慢性胆管炎、HBV/HCV感染，原发性硬化性胆管炎、寄生虫感染、胆管畸形（胆总管囊肿和Caroli病）、肝硬化、先天性肝纤维化等。对于这些具有慢性肝损伤的基础疾病的患者，包括胆汁淤积性肝损伤、肝内和/或肝外胆道狭窄以及其他胆道异常的患者，由于炎症的反复刺激，可引起细胆管的反应性增生，亦可进一步恶变，继发ICC或HCC。
细胆管反应是界板门管区的反应性病变，包括细胆管增生，伴有间质纤维化及炎细胞浸润，可见于晚期慢性肝病（如慢性病毒性肝炎），也见于晚期慢性肝病中出现的HCC和ICC等肝肿瘤周围。当ICC的细胞异型性不明显时，ICC的组织学与胆管反应极其相似，且ICC通常表现为浸润替代生长模式，有时很难对ICC和旺炽性胆管增生进行鉴别。
胆管腺瘤是一种良性肿瘤或瘤样增生性病变，约82.9%为单发，少数可以多发。大小通常<1cm，多位于肝包膜下，也可存在肝实质深部，大体呈白色或灰白色，圆形或卵圆形，质地较硬，边界清晰，无真性包膜。镜下由大小较一致的小胆管聚集构成，管腔狭小，弯曲状或实性条索状，多不含浓缩胆汁，类似于胆管反应，可能是ICC的前期病变。目前为止，胆管腺瘤的生物学性质尚未完全阐明，且胆管腺瘤与ICC的区别诊断有时也是极其困难。
新版WHO肿瘤（2019年版）消化***肿瘤分类标准(WHO Classification ofTumours Editorial Board: Digestive System Tumours, 5thedition, 2019，vol.1；Http://pubications.iarc.fr/529)中的ICC的特殊亚型细胆管癌（CLC），特指起源于细胆管或Hering管的腺癌，组织学上有时可类似小胆管或反应性小胆管增生。CLC癌细胞呈小立方形，细胞核/浆比增高，核卵圆形，胞浆淡染，缺乏黏液，异型性小，呈高分化状态，在组织学上排列成较规则的成角小导管、裂隙状或条索状，以在透明变性的胶原纤维间质内呈稀松的分枝状或“鹿角状”排列为特征。对于高分化CLC有时需要与胆管错构瘤及胆管腺瘤相鉴别。
炎症引起的反应性旺炽性增生、胆管错构瘤、胆管板畸形、胆管腺瘤或是高分化ICC，有时诊断可能极具挑战性。而在肝脏恶性肿瘤中有时会同时存在的胆管上皮，这些胆管上皮到底是肿瘤性的还是反应的，是混合性HCC-ICC，还是伴胆管反应的HCC，鉴别这些对恶性肿瘤的准确分型及正确诊断同样至关重要。因此，本领域极其需要免疫组织化学染色等其他工具来提高诊断灵敏度和准确性。
果蝇zeste基因增强子的人类同源物 2(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)具有DNA甲基转移和组蛋白脱乙酰化酶的调控作用，可参与调控癌症进展和干细胞的多潜能性等生命活动。研究发现，其在ICC中表达明显升高。Sasaki等发现，EZH2在全部CLC高表达，在胆管腺瘤和反应性小胆管增生中不表达（Am JSurg Pathol 2014;38：364)。因此，EZH2的免疫组化染色可用于鉴别ICC（阳性）、胆管反应旺炽性增生、胆管错构瘤、胆管板畸形、胆管腺瘤（阴性）。CK7(细胞角蛋白7 )为角蛋白基因家族的一员，可用于勾勒出胆上皮（PatholRes Pract 2003;199：65)。
目前，在日常病理诊断中，经常需要做多种免疫组化检测。但由于技术的限制，常用的免疫组化方法是在1张病理组织玻片上用一种颜色（一般为棕色）标记一种蛋白。当分析多种蛋白指标时，需要用对应的抗体分别在多张不同的玻片上标记。这样的单一标记的免疫组化染色方法，缺点如下：①每一个标记需要一张组织切片，标本浪费；②分别染色在两个玻片上的两个免疫组化指标是否同时表达于同一群细胞，靠经验和推测，需要反复对比HE及免疫组化切片，阅片难度大。没有经验的医师往往将恶性肿瘤中轻度异性增生的胆管上皮误认为恶性，从而导致误诊。
发明内容
本发明要解决的技术问题是良恶性胆管上皮肿瘤难以快速准确判断的技术问题。
本发明首先提供了一种双重免疫组化染色试剂盒。该试剂盒包括一抗试剂、二抗试剂 和染色剂；所述一抗试剂包括有EZH2抗体和CK7抗体；所述二抗试剂包括组合二抗（HRP标记抗小鼠IgG/HRP+兔抗IgG/AP）或组合二抗（HRP标记抗小鼠IgG/AP+兔抗IgG/HRP），所述二抗试剂包括EZH2二抗和 CK7二抗。
其中，所述EZH2抗体和CK7抗体来源于两种不同种属的动物。进一步的，两种不同种属的动物分别为鼠或兔。
其中，所述染色剂为过氧化物酶HRP 辣根介导的染色剂和碱性磷酸酶AP介导的染色剂。
其中，所述一抗试剂和二抗试剂中的针对同一抗原的抗体来源相匹配。进一步的，所述EZH2抗体来源于鼠或兔，CK7抗体来源于兔或鼠，EZH2抗体和CK7抗体来源动物不同。
进一步的，上述二抗试剂含有与上述一抗试剂中的EZH2或CK7抗体种属来源相匹配的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗聚合物；上述二抗试剂含有与上述一抗试剂中的EZH2或CK7抗体种属来源相匹配的碱性磷酸酶（AP）标记的二抗聚合物；所述二抗试剂中的EZH2二抗和CK7二抗的标记不同。
比如，上述二抗试剂包括组合二抗（HRP标记抗小鼠IgG/HRP+兔抗IgG/AP）或组合二抗（HRP标记抗小鼠IgG/AP+兔抗IgG/HRP）。
其中，上述双重免疫组化染色试剂盒中还包括染色剂，所述染色剂包括辣根过氧化物酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液。
其中，上述辣根过氧化物酶底物染色液包括3,3-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）；或者所述碱性磷酸酶底物染色液包括红色碱性磷酸酶底物（具体可以为Fast Red A和Fast RedB）。
进一步的，上述染色剂还包括复染染色液，所述复染染色液的显色不掩盖所述辣根过氧化物酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液的显色。
其中，上述的双染免疫组化试剂盒中还可以含有抗原修复剂和/内源性过氧化氢酶封闭试剂。
进一步的，上述双重免疫组化染色试剂盒用于对组织切片进行染色。进一步的，所述的组织切片为石蜡组织切片和冰冻组织切片。
可以理解的是上述试剂盒中的各种试剂为独立包装。
本发明还进一步地提供了上述所述的双重免疫组化染色试剂盒在制备鉴别良恶性胆管上皮肿瘤的试剂中的应用。
本发明还在上述方案基础上提供了一种肝脏组织切片进行双重免疫组化染色的方法。该方法其特征在于包括以下步骤三种操作方式：
A：
(1) 准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；
(2)使用一抗试剂对组织切片进行孵育：采用鸡尾酒一抗，该鸡尾酒一抗包含鼠来源EZH2一抗和兔来源CK7一抗，或者包括兔来源EZH2一抗和鼠来源CK7一抗；
（3）二抗孵育与显色反应：先使用与EZH2或CK7抗体种属来源相匹配的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗进行孵育，介导3,3-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）反应，产生不溶于水和乙醇的棕黄色或棕褐色沉淀；再进行与剩余的CK7或EZH2抗体种属来源相匹配的碱性磷酸酶（AP）标记二抗进行孵育介导红色底物显色***染色；
（4）切片复染；保存备用。
根据酶标二抗不同可呈现不同的结果：
HRP标记二抗与EZH2结合/AP标记二抗与CK7结合：EZH2棕色核染色和CK7红色胞浆染色；
HRP标记二抗与CK7结合/AP标记二抗与EZH2结合：CK7棕色胞浆染色和EZH2红色核染色。
或者B：
（1）准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；
（2）使用一抗试剂对组织切片进行孵育：采用鸡尾酒一抗，该鸡尾酒一抗包含鼠来源EZH2一抗和兔来源CK7一抗，或者包括兔来源EZH2一抗和鼠来源CK7一抗；
（3）二抗孵育与显色反应：采用鸡尾酒二抗，同时介导酶促显色反应；该鸡尾酒二抗包含分别针对EZH2或CK7的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗和碱性磷酸酶（AP）标记二抗，并与对应的一抗的种属来源相匹配； HRP介导生成棕黄色或棕褐色沉淀，AP介导生成红色沉淀；
（4）切片复染；保存备用。
根据酶标二抗不同可呈现不同的结果：
HRP标记二抗与EZH2结合/AP标记二抗与CK7结合：EZH2棕色核染色和CK7红色胞浆染色；
HRP标记二抗与CK7结合/AP标记二抗与EZH2结合：CK7棕色胞浆染色和EZH2红色核染色。
或者C：
（1）准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；
（2）使用鼠或兔来源EZH2或CK7一抗孵育，使用与一抗种属来源相匹配的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗进行孵育，介导3,3-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）反应，产生不溶于水和乙醇的棕黄色或棕褐色沉淀；
（3）二抗孵育与显色反应：然后与用前述一抗来源不同且针对的抗原不同的，鼠或兔来源的CK7或EZH2的一抗进行孵育；孵育后用与一抗种属来源相同的碱性磷酸酶（AP）标记二抗进行孵育，介导基于AP催化的生成红色沉淀；
（4）复染；保存备用。
根据一抗选择先后顺序呈现不同的结果：
步骤一选择EZH2/步骤二选择CK7：EZH2棕色核染色和CK7红色胞浆染色；
步骤一选择CK7/步骤二选择EZH2：CK7棕色胞浆染色和EZH2红色核染色。
使用该方法制备的双重染色切片，可用于进行显微观察，以鉴别良恶性胆管上皮肿瘤。
本发明的有益效果：本发明技术方案利用双重免疫组化技术，针对两个有关联抗原蛋白指标CK7和EZH2，在一张切片上能同时勾勒出反应性胆管与癌变的胆管上皮，且能观察到两者之间的关系，能帮助识别肿瘤与非肿瘤性胆管，从而有助于正确的病理诊断。利用本发明技术方案，使得同时标记的两个抗原指标是否同时表达于同一群细胞变得所见即所得，直接以显微镜下观察的结果做判断，而不再靠经验和推测做判断，降低了阅片难度，提高了工作效率及判断准确性，达到了“1+1>2”的效果。另一方面，由于一张玻片可以同时检测两个蛋白指标，也减少了组织切片的使用量，具有好的技术效果。本发明技术方案经的临床实验，证实在鉴别良恶性胆管上皮肿瘤细胞系别、分型和恶性程度判断提高诊断灵敏度和准确性有较好的应用前景。
附图说明
图1、病例1肝包块HE低倍照片 （4× ）。
图2、病例1肝包块HE中倍照片（10× ）。
图3、病例1肝包块双染免疫组化低倍照片（4× ）。
图4、病例1肝包块双染免疫组化中倍照片（10× ）。
图5、病例2肝占位HE中倍照片（10× ）。
图6、病例2肝占位单染的CK7免疫组化中倍照片（10× ）。
图7、病例2肝占位单染的EZH2免疫组化中倍照片（10× ）。
图8、病例2肝占位双重染色免疫组化中高倍照片（20× ）。
图9、病例3肝包块HE低倍照片 （4× ）。
图10、病例3肝包块HE中倍照片（10× ）。
图11、病例3肝包块双染免疫组化低倍照片（4× ）。
图12、病例3肝包块双染免疫组化中高倍照片（20× ）。
具体实施方式
对本领域而言，在血液***疾病的诊断中，可以通过新鲜标本的流式细胞术技术，检测某群细胞是否有相关蛋白标记的共表达或某些标记的缺失。但在实体肿瘤中，首先新鲜标本获取不易，其次也不是所有的免疫组化蛋白抗体标记均有流式细胞术抗体，故精准的诊断还是要依赖组织切片。因此如能在一张组织切片上同时辨认出胆管上皮的良性及恶性成分，对本领域而言有重大的实践意义，对一线临床的工作有很大的帮助。
而本发明创造性地开发了针对两种不同的标志物EZH2和CK7双重免疫组化染色技术，发现选择EZH2和CK7作为抗原蛋白指标，进行不同颜色的抗原免疫染色，可在一张切片上同时辨认出胆管上皮的良性及恶性成分，加深对ICC及反应性胆管的进一步认识，有助于肿瘤的正确诊断。
本发明双重免疫组化染色试剂盒。该试剂盒包括一抗试剂、二抗试剂 和染色剂；所述一抗试剂包括有EZH2抗体和CK7抗体；所述二抗试剂包括组合二抗（HRP标记抗小鼠IgG/HRP+兔抗IgG/AP，此二抗混合液可以让鼠来源一抗标记的部位与DAB显色为棕色而兔来源一抗标记的部位与AP红显色为红色）或组合二抗（HRP标记抗小鼠IgG/AP+兔抗IgG/HRP，此二抗混合液可以让鼠来源一抗标记的部位与AP红显色为红色而兔来源一抗标记的部位与DAB显色为棕色）。一般来说，所述EZH2抗体和CK7抗体最好来源于两种不同种属的动物。比如，两种不同种属的动物分别为鼠或兔。染色剂可以选用本领域常用的各种染色剂。比如使用广泛运用的过氧化物酶HRP 辣根介导的染色剂和碱性磷酸酶（AP）介导的染色剂。而对具体染色的操作进行一定的优化以获得更为对比更为清晰鲜明的成片也是需要进行的工作。
本发明方法能在同一张组织切片上分别或同时进行双重显色，染色对比鲜明直观。经过多因素（不同技术人员、不同组织等）对比验证，抗原没有丢失，抗体之间互不干扰，专家判读结果完全一致。具有很好的推广价值。
以下通过的实施例对本发明技术方案进行进一步的详细说明，并非对本发明保护范围的限制。
本发明实施例中具体使用的主要试剂名称及其购买的厂家为：
CK7一抗，克隆号：UMAB161，鼠单抗，即用型，中杉金桥；
EZH2一抗，克隆号：SP129，兔单抗，即用型，基因科技；
ultraView Universal DAB Detection Kit，Roche（罗氏），REF:760-500，其为Ventana染色平台使用的HRP标记的二抗试剂盒，试剂盒包括DAB显色液。
ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit，Roche（罗氏），REF:760-501，其为Ventana染色平台使用的AP标记二抗试剂盒，试剂盒包括AP红显色液。
Roche（罗氏）Ventana BenchMark 免疫组化仪。
实施例1 使用本发明技术制备术后双染免疫组化切片
本实施例中的待诊断病例1为一名66岁女性患者，因“皮肤及巩膜黄染3+月，检查发现肝占位1+月”入院；术后病理参见图1和图2。
图1为HE低倍（4×）：肝被膜下见较多增生的胆管上皮，排列呈较不规则的实性条索状、鹿角或分枝状，间质疏松，纤维化不明显，边界不清楚。这些管腔到底是反应性的还是肿瘤性的，鉴别诊断包括：胆管腺瘤，肝内胆管癌（细胆管癌）。
图2为HE中倍（10×）：胆管细胞呈小立方状，类似细胆管上皮细胞，大小一致，部分胞质少，核浆比增大，核卵圆形，核***罕见，诊断困难。
为了能够进行清晰的诊断，对患者的组织进行了CK7和EZH2 双染免疫组化。
具体的制备的步骤如下：
1、制备4μm的石蜡切片，65℃烤片30分钟；
2、使用Roche Ventana BenchMark 进行脱蜡和抗原修复；
3、EZH2一抗滴加，孵育36分钟后ultraView Universal DAB Detection Kit二抗孵育并完成DAB显色；
4、CK7一抗滴加，孵育64分钟后ultraView Universal Alkaline PhosphataseRed Detection Kit二抗孵育并完成AP红显色；
5、苏木素复染4分钟后反蓝液反蓝；
6、自来水冲洗后65℃烤箱烘干3小时，中性树胶封片后镜下观察。
2~5染色步骤均在Roche Ventana BenchMark染色平台操作完成。
双染后的结果参见图3和图4。
图3为双染免疫组化低倍（4×）：可见周边胆管上皮及右侧胆管上皮CK7+EZH2-（蓝色箭头所指，显示红色，仅细胞膜染成红色），而中央及左上角则为红色+棕色，即CK7+EZH2+（红棕色，红色的细胞膜+棕色的细胞核），提示中央及左上角的胆管为胆管腺癌。而周边及右上角的则为反应性/残留的胆管上皮，而非肿瘤性的。
图4为双染免疫组化中倍（10×）：蓝色箭头为反应性胆管上皮，红色箭头为胆管癌，对比分明，有助于诊断。
从该病例的各种染色图中可以看出，使用双染染色后的细胞形态清晰，细胞核、细胞膜和胞浆的颜色分明，阳性定位准确，信号表达清晰，能够应用于在胆管腺癌和反应性/残留的胆管上皮的鉴别诊断中。
实施例2 使用本发明技术制备术后双染免疫组化切片
本实施例中的待诊断病例2为一名60岁男性患者，因“体检发现肝占位20天”入院；
术后病理参见图5至图7。
图5为HE中倍（10×）：可见梭形细胞排列呈束状及片状，异型性明显。其内隐约可见散在的单层立方上皮形成的管腔样结构或条索样结构，细胞有一定的异型性。这些隐约可见的管腔到底是反应性的还是肿瘤性的，不同的医生各执一词、争议较大。诊断考虑为梭形细胞恶性肿瘤。鉴别诊断包括：肉瘤样肝细胞癌、肝内胆管癌+肉瘤样癌、肉瘤等。
图6为单染的CK7免疫组化中倍（10×）：CK7示瘤体中胆管上皮，可见腺样排列、少数不规则，可见鹿角样及不规则型，但仍不清楚这些胆管到底是反应性的还是肿瘤性的。
图7为单染的EZH2免疫组化中倍（10×）：EZH2示瘤体中梭形细胞高表达，经反复对比HE切片，CK7的免疫组化，找到大致相同部位的胆管上皮，经仔细对比辨认，可见胆管上皮细胞为阴性表达（箭头所指）。
为了能够进行清晰的诊断，是用本发明技术对组织进行了CK7和EZH2 双染免疫组化。
具体的染色成片的步骤如下：
1、制备4μm的石蜡切片，65℃烤片30分钟；
2、使用Roche Ventana BenchMark 进行脱蜡和抗原修复；
3、EZH2一抗滴加，孵育36分钟后ultraView Universal DAB Detection Kit二抗孵育并完成DAB显色；
4、CK7一抗滴加，孵育64分钟后ultraView Universal Alkaline PhosphataseRed Detection Kit二抗孵育并完成AP红显色；
5、苏木素复染4分钟后反蓝液反蓝；
6、自来水冲洗后65℃烤箱烘干3小时，中性树胶封片后镜下观察。
2~5染色步骤均在Roche Ventana BenchMark染色平台操作完成。
双染后的结果参见图8。图8为双重染色免疫组化中高倍照片（20×），可见单层立方上皮围绕形成的管腔样结构CK7+EZH2-（红色，细胞膜）、和梭形细胞CK7-EZH2+（棕色，细胞核）在一张切片上显示，颜色对比鲜明，不需要反复对比查看。这表明梭形细胞肿瘤中存在的胆管上皮为反应性/或残留的胆管上皮，而不是恶性成分。即不是ICC，也不是混合性HCC-ICC，有助于正确的病理诊断。而且可见使用双染染色后的细胞形态清晰，细胞核、细胞膜和细胞浆的颜色分明，阳性定位准确，信号表达清晰，能够应用于在胆管腺癌和反应性/残留的胆管上皮的鉴别诊断中。
实施例3 使用本发明技术制备术后双染免疫组化切片
本实施例中的待诊断病例3为一名39岁女性患者，因“间断腹胀腹痛10+年，确诊胃窦腺癌1月”入院手术；术中发现左肝缘表面见1枚直径约0.3cm灰白色结节，术中取该结节送病理，希望明确是否为胃原发的转移性腺癌。术后石蜡切片病理参见图9和图10。
图9为HE低倍（4×）：肝被膜下见孤立结节，为较多增生的胆管上皮，大小较一致，管腔狭小，弯曲状或呈较不规则的实性条索状，无囊性空腔或胆管扩张，间质可见淋巴细胞浸润，边界欠清楚。这些管腔到底是反应性的还是肿瘤性的，鉴别诊断包括：胆管腺瘤，肝内胆管癌（细胆管癌），转移性腺癌。
图10为HE中倍（10×）：可见胆管细胞呈立方状或矮柱状，无明显异型性，胞浆丰富，细胞核小圆形，大小均匀，无明显核***像，诊断困难。
为了能够进行清晰的诊断，对患者组织进行了CK7和EZH2 双染免疫组化。本实例中仍按以上实施例的染色方案完成双染免疫组化染色。双染后的结果参见图11和图12。
图11为双重染色免疫组化低倍照片（10×），可见单层立方上皮围绕形成的管腔样结构CK7+EZH2-（红色，细胞膜）、并显示周边肝组织的门管区的正常胆管上皮，而未见CK7+EZH2+（棕色，细胞核）的棕色胆管上皮，颜色鲜明。表明这些胆管上皮为良性病变，而不是恶性成分。有助于正确的病理诊断。
图12为双重染色免疫组化中高倍照片（20×），可见单层立方上皮围绕形成的管腔样结构CK7+EZH2-（红色，细胞膜）、CK7-EZH2+（棕色，细胞核）为反应性的淋巴细胞，也可以当成自身阳性对照，二者在一张切片上显示，颜色对比鲜明，可见使用双染染色后的细胞形态清晰，细胞核、细胞膜和细胞浆的颜色分明，阳性定位准确，信号表达清晰，能够应用于在胆管腺癌、反应性/残留的胆管上皮及转移性腺癌的鉴别诊断中。
Claims (10)
1.一种双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于：包括一抗试剂、二抗试剂和染色剂；所述一抗试剂包括有EZH2一抗抗体和CK7一抗抗体，所述二抗试剂包括EZH2二抗抗体和 CK7二抗抗体；所述EZH2抗体和CK7抗体分别来源于鼠和兔。
2.根据权利要求1所述的双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于：所述染色剂为辣根过氧化物酶HRP介导的染色剂和碱性磷酸酶AP介导的染色剂。
3.根据权利要求1所述的双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于：所述一抗试剂和二抗试剂中的针对同一抗原的抗体来源相匹配；或者，所述EZH2抗体来源于鼠或兔，CK7抗体来源于兔或鼠，EZH2抗体和CK7抗体不同源。
4.根据权利要求1所述的双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于：
所述二抗试剂含有与上述一抗试剂中的EZH2或CK7抗体种属来源相匹配的辣根过氧化物酶HRP标记的二抗聚合物；
所述二抗试剂含有与上述一抗试剂中的EZH2或CK7抗体种属来源相匹配的碱性磷酸酶AP标记的二抗聚合物；
所述二抗试剂中的EZH2二抗和CK7二抗的标记不同。
5.根据权利要求1所述的双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于：还包括染色剂，所述染色剂包括辣根过氧化物酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液。
6.根据权利要求5所述的双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶底物染色液包括3,3-二氨基联苯胺盐酸盐DAB；或者所述碱性磷酸酶底物染色液包括红色碱性磷酸酶底物。
7.根据权利要求6所述的双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于：所述染色剂还包括复染染色液，所述复染染色液的显色不掩盖所述辣根过氧化物酶底物染色液和碱性磷酸酶底物染色液的显色。
8.权利要求1所述的双重免疫组化染色试剂盒，其特征在于，所述的双重免疫组化染色试剂盒用于对组织切片进行染色；所述的组织切片为人体石蜡组织切片或冰冻人体组织切片。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的双重免疫组化染色试剂盒在制备鉴别良恶性胆管上皮肿瘤的试剂中的应用。
10.肝脏组织切片双重免疫组化染色的方法，其特征在于包括以下步骤：
A：
(1) 准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；
(2)使用一抗试剂对组织切片进行孵育：采用鸡尾酒一抗，该鸡尾酒一抗包含鼠来源EZH2一抗和兔来源CK7一抗，或者包括兔来源EZH2一抗和鼠来源CK7一抗；
（3）二抗孵育与显色反应：先使用与EZH2或CK7抗体种属来源相匹配的辣根过氧化物酶HRP标记二抗进行孵育，介导3,3-二氨基联苯胺盐酸盐DAB反应，产生不溶于水和乙醇的棕黄色或棕褐色沉淀；再进行与剩余的CK7或EZH2抗体种属来源相匹配的碱性磷酸酶AP标记二抗进行孵育介导红色底物显色***染色；
（4）切片复染；保存备用；
或者B：
（1）准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；
（2）使用一抗试剂对组织切片进行孵育：采用鸡尾酒一抗，该鸡尾酒一抗包含鼠来源EZH2一抗和兔来源CK7一抗，或者包括兔来源EZH2一抗和鼠来源CK7一抗；
（3）二抗孵育与显色反应：采用鸡尾酒二抗，同时介导酶促显色反应；该鸡尾酒二抗包含分别针对EZH2或CK7的辣根过氧化物酶HRP标记二抗和碱性磷酸酶AP标记二抗，并与对应的一抗的种属来源相匹配； HRP介导生成棕黄色或棕褐色沉淀，AP介导生成红色沉淀；
（4）切片复染；保存备用；
或者C：
（1）准备组织切片，进行抗原修复、内源性过氧化氢酶封闭；
（2）使用鼠或兔来源EZH2或CK7一抗孵育，使用与一抗种属来源相匹配的辣根过氧化物酶HRP标记二抗进行孵育，介导3,3-二氨基联苯胺盐酸盐DAB反应，产生不溶于水和乙醇的棕黄色或棕褐色沉淀；
（3）二抗孵育与显色反应：然后与用前述一抗来源不同且针对的抗原不同的，鼠或兔来源的CK7或EZH2的一抗进行孵育；孵育后用与一抗种属来源相同的碱性磷酸酶AP标记二抗进行孵育，介导基于AP催化的生成红色沉淀；
（4）复染；保存备用。
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