CN117210582B - 一种用于荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的特异性分子标记及检测方法 - Google Patents
一种用于荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的特异性分子标记及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的特异性分子标记及检测方法，涉及分子生物学技术领域。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了扩增该分子标记的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。通过该分子标记引物组对样品cDNA进行PCR扩增，当可特异性扩增得到如SEQ ID NO.4所示序列时，表示所测样品为荔枝粗胫翠尺蛾雄虫；当未能扩增序列时，则所测样品为荔枝粗胫翠尺蛾雌虫。本发明提供的荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的分子标记及其及检测方法，可实现便携、快速、准确的荔枝粗胫翠尺蛾雌雄鉴定，为该虫的各项研究提供可靠参考。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的特异性分子标记及检测方法。
背景技术
荔枝、龙眼原产于中国，分别为我国第一大、第四大亚热带水果。2022年全国荔枝种植面积近800万亩，龙眼种植面积约410万亩，是世界最大规模的荔枝、龙眼生产国。荔枝和龙眼生长于热带和亚热带地区，温暖湿润的气候环境和常年不落叶的特点使其易遭受多种病虫的为害。
尺蛾科Geometridae害虫是荔枝和龙眼食叶类害虫重点防控对象之一。该类害虫中以荔枝粗胫翠尺蛾（Thalassodes immissariaWalker）发生量为最大，该种害虫以幼虫（尺蠖）取食叶片或花穗为害，中高龄幼虫具暴食性，可造成嫩叶缺刻、幼果脱落甚至秃枝，严重影响荔枝、龙眼结果母枝的营养积累；其成虫飞行能力强，分布范围广、蔓延迅速，不仅给当年造成减产，还会影响来年的成花坐果。在荔枝园中，粗胫翠尺蛾虫为害所造成的叶片损失在全部病虫害所造成的叶片损失占比超过60%，给荔枝高产稳产造成威胁，是荔枝产业首要食叶害虫。粗胫翠尺蛾属鳞翅目、尺蛾科，一年发生7-8代，在果园世代重叠，具有幼虫期长、蛹期参差不齐和成虫期长且高峰期不明显等特点，防控难度较大。目前，仅我国有粗胫翠尺蛾相关研究报道7篇，文献资料有限，急需开展相关形态学鉴定、生物学特征、生态学及防治技术等方面研究。
昆虫的生活***和抗逆机能等均与性别息息相关。当前，对昆虫性别鉴定主要通过其形态差异进行判断。但田间捕捉的荔枝粗胫翠尺蛾多为其虫蛹，雌雄难辩；即使通过灯诱捕获少量成虫，也由于该虫活跃，鳞羽容易掉落，给性别的鉴定带来困难。因此，亟需开发出一种用于荔枝粗胫翠尺蛾早期性别鉴定的分子标记，借助分子生物学的手段，实现高效且准确的荔枝粗胫翠尺蛾雌雄鉴定，为该虫的各项研究提供可靠参考。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于荔枝粗胫翠尺蛾早期性别鉴定的分子标记。
本发明提供的性别特异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ATGCCGGGGCCAGATGTGAAAGCTAAGGACAATGTTTTTGAAATGTCGGCGGAGGCTACTGCGGCCGTACACAGCGGCGCGGAGTCGAAAGCAGAAAAAAAACTCACTGTACTCGAAACCCACGGATATATTCTCGGTAGAACTATCGGGTCTGGCTCATACGCTACCGTTAAGGTCGCTACAAGTGATAGACACAACTGTCAAGTTGCAATAAAAATAATAAGCAAGTTCCAAGCCCCCGGAGATTATTTGAAAAAGTTTCTACCGAGAGAAATAGAAGTGGTCAAAGGACTGAAACATGAGAACCTTATACGATTCTTGCAAGCTATTGAAACAACACACAGGGTATACATAGTAATGGAATATGCACAAAACGGTAGCCTCTTGGATATAATACGTAAAGACCAACATATAGACGAGGTTCGCGGCCGACGATGGTTTCGACAACTGGTCGAGGCTGTTGAATATTGTCATGAACGAGGAGTCGTTCACAGGGATATAAAATGCGAAAACCTTCTAATGGACCACGGCTTAAACATAAAACTGTCGGATTTCGGTTTCGCTCGCGGTCACATGAAGCCAAAGAACGGAATGTATGTGTTGAGTGAAACATTTTGTGGGAGTTACGCATACGCTTCCCCTGAAATACTAAAGGGGGTTCCGTATAAGCCTCAGGACTCTGATGTATGGAGTATGGGCGTGGTTCTGTACGCTATAGTGTACGGTCGGCTGCCGTTTGATGATACCAATTATACGCAACTACTGAAGCAAGTCCAAAACAAAGTATCATTTCCACGCGAACCGAAAGTAACAGCTGATTGTCGCAAGCTGGTCACCAAGATATTGGCCCCACTCAAGTTACGCGTCAAAATACCTCAAATCCTCGCTGACCCTTGGCTCAATCCTAGCCAAACACCTTCTAAAGACGATGACGAAACAAAGGAAAGTAGCAATGAAATCAAGAGCGCGAATATTGGCACTGCATTCGACAGAAACATGGAACACAAAATGGAAGAAGTCAAAATTTAA。
本发明还提供了扩增该分子标记的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。通过该分子标记引物组对荔枝粗胫翠尺蛾RNA反转录后的cDNA文库进行扩增，根据扩增产物可便携、快速、准确鉴定出荔枝粗胫翠尺蛾的性别。
本发明的另一个方面，提供了一种用于荔枝粗胫翠尺蛾早期性别鉴定的检测方法，包括以下步骤：
S1：提取荔枝粗胫翠尺蛾样品的RNA；
S2：利用反转录PCR反应将S1提取的RNA反转录成cDNA文库；
S3：以S2中获得的cDNA文库为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的引物组进行PCR扩增，分别得到不同cDNA文库对应的PCR产物；
S4：取S3中所述PCR产物8μL在琼脂糖凝胶中进行电泳，并分析电泳结果，判断荔枝粗胫翠尺蛾雌雄虫，其中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物组可扩增出条带为荔枝粗胫翠尺蛾雄虫，未扩增出条带则为荔枝粗胫翠尺蛾雌虫。
本发明的一些实施方式中，所述引物组SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为雄虫特异性引物，用于检测雄虫特异性表达分子标记SEQ ID NO.1序列片段。
本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中，通过试剂盒提取法提取所述待测荔枝粗胫翠尺蛾样品的RNA。
本发明的一些实施方式中，所述反转录PCR反应，其反转录PCR反应体系为：
5×EvoM-MLVRT Master Mix 2μL
RNA 1μg
RNase free water 补足至10μL。
本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中，所述反转录PCR反应，其反转录PCR反应的程序为：37°C变性15分钟；85°C 反应5s，4°C 终止反应。
本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中，PCR扩增，扩增反应体系为：
2×Master Mix 12.5μL
SEQ ID NO.2引物 1μL
SEQ ID NO.3引物 1μL
cDNA模板 1μL
ddH2O 补足至25μL。
本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中，所述PCR扩增，其PCR扩增反应的程序为：94°C 预变性5分钟；94°C 变性30s，56°C 退火15s，72°C 延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72°C 延伸5分钟。
本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述琼脂糖凝胶电泳，其琼脂糖凝胶的浓度为2%。
本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述琼脂糖凝胶电泳，其电压为100-120V，所述电泳时间为30-40分钟。
本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述琼脂糖凝胶电泳，其分析方法为：如果所述引物组SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的电泳结果显示大小为212bp的条带，则判断所述待测荔枝粗胫翠尺蛾为雄虫，如果未扩增出条带则判断待测荔枝粗胫翠尺蛾为雌虫。
本发明提供的检测方法可用于荔枝粗胫翠尺蛾早期雌雄鉴定。
本发明提供的荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的分子标记及其及检测方法，填补了荔枝粗胫翠尺蛾性别分子检测技术的空白，具有以下优点：
因缺乏有效可靠的性别鉴定手段，田间捕捉的荔枝粗胫翠尺蛾多为其虫蛹，形态相似、雌雄难辩；即使通过灯诱捕获少量成虫，也由于该虫活跃，鳞羽容易掉落，给性别的鉴定带来困难；未经性别鉴定提取的荔枝粗胫翠尺蛾核酸样本更是难分雌雄。本发明通过提供的引物对待测荔枝粗胫翠尺蛾的cDNA文库进行PCR扩增，根据扩增结果可判断出这个待检测的荔枝粗胫翠尺蛾的性别，能过雄性荔枝粗胫翠尺蛾特异性扩增产物的有或无即可判断出结果。
本发明的分子标记操作简便，对于田间捕获的荔枝粗胫翠尺蛾虫蛹、成虫以及未经过性别鉴定的荔枝粗胫翠尺蛾核酸样本，均可高效、快速、准确地进行性别鉴定，为荔枝粗胫翠尺蛾研究工作提供可靠参考。
附图说明
图1为荔枝粗胫翠尺蛾虫蛹实拍图；
图2为本发明实施例利用提供的性别鉴定引物对不同的荔枝粗胫翠尺蛾虫蛹进行性别鉴定示意图（M：DL2000DNA Marker；1：蛹1；2：蛹2；3：蛹3；4：蛹4）；
图3为本发明实施例利用提供的性别鉴定引物对不同的荔枝粗胫翠尺蛾成虫进行性别鉴定示意图（M：DL2000DNA Marker；1：成虫1；2：成虫2；3：成虫3；4：成虫4；5：成虫5；6：成虫6）。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
下列实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
下列实验例中采用的磁珠法RNA快速提取试剂盒由深圳迈科斯生物科技有限公司提供，EvoM-MLV反转录试剂盒由艾科瑞生物科技有限公司提供，2×Tag PCR MasterMix试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司提供，TS-Gelred核酸凝胶染料由北京擎科生物有限公司提供。
实施例1 荔枝粗胫翠尺蛾虫蛹性别的鉴定
引物的设计和特异性检测
（1）引物的设计
利用DESeq2软件在荔枝粗胫翠尺蛾的转录组数据中寻找睾丸特异性丝氨酸（苏氨酸激酶3）的基因序列，利用Primer 6.0软件进行引物设计，筛选得到1对特异性引物设计并由广州艾基生物技术有限公司合成。
其中，正向引物为 TGGAGTATGGGCGTGGTTCTGT（SEQ ID NO.2），反向引物为AGCCAAGGGTCAGCGAGGATT（SEQ ID NO.3）；
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增的序列（212bp）的核苷酸序列为：5’-TGGAGTATGGGCGTGGTTCTGTACGCTATAGTGTACGGTCGGCTGCCGTTTGATGATACCAATTATACGCAACTACTGAAGCAAGTCCAAAACAAAGTATCATTTCCACGCGAACCGAAAGTAACAGCTGATTGTCGCAAGCTGGTCACCAAGATATTGGCCCCACTCAAGTTACGCGTCAAAATACCTCAAATCCTCGCTGACCCTTGGCT-3’ (SEQ ID NO.4)。
（2）样品RNA的抽提
从荔枝园中收集荔枝粗胫翠尺蛾虫蛹，装入封口袋中带回实验室，使用无菌水清洗2遍后放入1.5mL离心管中，采用的磁珠法RNA快速提取试剂盒单头提取样品RNA，具体步骤按照说明书进行。用2%琼脂糖凝胶检测所提RNA的完整性。用酶标仪对所提RNA的纯度及浓度进行检测，存储在-80℃备用。
（3）cDNA文库构建
以步骤（2）中抽提合格的样品RNA为反转录核酸模板，在冰上进行操作，于0.2mlPCR管中配制反转录反应体系如下：
5×EvoM-MLVRT Master Mix 2μL
虫蛹RNA 1μg
RNase free water 补足至10μL；
将配置好的反转录反应液置于PCR仪中，程序设定为37°C变性15分钟；85°C 反应5s，4°C 终止反应。反应结束即获得相应样品的cDNA文库，存储在-20℃备用。
（4）PCR扩增
以步骤（3）中获得的不同样品的cDNA为检测对象，按以下反应体系和扩增程序进行PCR扩增反应。SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3引物组的反应体系如下：
2×Master Mix 12.5μL
SEQ ID NO.2引物 1μL
SEQ ID NO.3引物 1μL
虫蛹cDNA模板 1μL
ddH2O 补足至25μL
PCR扩增反应的程序为：94°C 预变性5分钟；94°C 变性30s，56°C 退火15s，72°C延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72°C 延伸5分钟。
反应结束即获得相应样品的PCR扩增产物，存储在-20℃备用。
（5）特异性检测
取8μL步骤（4）中PCR反应所得的反应产物，加样于2%琼脂糖凝胶中进行电泳，110V恒压，35分钟。电泳结束后，将琼脂糖凝胶于稀释后的TS-Gelred核酸凝胶染料中浸泡30分钟，将染色后的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察。
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3引物组对不同的荔枝粗胫翠尺蛾虫蛹的性别鉴定结果如图2所示；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3引物组对不同的荔枝粗胫翠尺蛾成虫的性别鉴定结果如图3所示。
由图2可知，虫蛹样品1-3可扩增出212bp的特异性条带，故虫蛹样品1-3为荔枝粗胫翠尺蛾雄虫；虫蛹样品4未扩增出条带则为荔枝粗胫翠尺蛾雌虫。与实际情况相符。
实施例2 已知性别的荔枝粗胫翠尺蛾成虫的鉴定
引物的设计和特异性检测
（1）引物的设计
利用DESeq2软件在荔枝粗胫翠尺蛾的转录组数据中寻找睾丸特异性丝氨酸（苏氨酸激酶3）的基因序列，利用Primer 6.0软件进行引物设计，筛选得到1对特异性引物设计并由广州艾基生物技术有限公司合成。
其中，正向引物为 TGGAGTATGGGCGTGGTTCTGT（SEQ ID NO.2），反向引物为AGCCAAGGGTCAGCGAGGATT（SEQ ID NO.3）；
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增的序列（212bp）的核苷酸序列为：5’-TGGAGTATGGGCGTGGTTCTGTACGCTATAGTGTACGGTCGGCTGCCGTTTGATGATACCAATTATACGCAACTACTGAAGCAAGTCCAAAACAAAGTATCATTTCCACGCGAACCGAAAGTAACAGCTGATTGTCGCAAGCTGGTCACCAAGATATTGGCCCCACTCAAGTTACGCGTCAAAATACCTCAAATCCTCGCTGACCCTTGGCT-3’ (SEQ ID NO.4)。
（2）样品RNA的抽提
于成虫盛发期，以糖醋液诱捕荔枝粗胫翠尺蛾成虫共6头，将成虫随机取出并通过尾器识别雌雄，将其编号为♂1、♂2、♀3、♀4、♂5、♂6，分头装入封口袋中带回实验室，使用无菌水清洗3遍后放入1.5mL离心管中，采用的磁珠法RNA快速提取试剂盒单头提取样品RNA，具体步骤按照说明书进行。用2%琼脂糖凝胶检测所提RNA的完整性。用酶标仪对所提RNA的纯度及浓度进行检测，存储在-80℃备用。
（3）cDNA文库构建
以步骤（2）中抽提合格的样品RNA为反转录核酸模板，在冰上进行操作，于0.2mlPCR管中配制反转录反应体系如下：
5×EvoM-MLVRT Master Mix 2μL
成虫RNA 1μg
RNase free water 补足至10μL；
将配置好的反转录反应液置于PCR仪中，程序设定为37°C变性15分钟；85°C 反应5s，4°C 终止反应。反应结束即获得相应样品的cDNA文库，存储在-20℃备用。
（4）PCR扩增
以步骤（3）中获得的不同样品的cDNA为检测对象，按以下反应体系和扩增程序进行PCR扩增反应。SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3引物组的反应体系如下：
2×Master Mix 12.5μL
SEQ ID NO.2引物 1μL
SEQ ID NO.3引物 1μL
成虫cDNA模板 1μL
ddH2O 补足至25μL
PCR扩增反应的程序为：94°C 预变性5分钟；94°C 变性30s，56°C 退火15s，72°C延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72°C 延伸5分钟。
反应结束即获得相应样品的PCR扩增产物，存储在-20℃备用。
（5）特异性检测
取8μL步骤（4）中PCR反应所得的反应产物，加样于2%琼脂糖凝胶中进行电泳，110V恒压，35分钟。电泳结束后，将琼脂糖凝胶于稀释后的TS-Gelred核酸凝胶染料中浸泡30分钟，将染色后的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察。
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3引物组对不同的荔枝粗胫翠尺蛾成虫的性别鉴定结果如图3所示。
由图3可知，成虫样品1-2和5-6可扩增出212bp的特异性条带，故成虫样品1-2和5-6为荔枝粗胫翠尺蛾雄虫；成虫样品3-4未扩增出条带则为荔枝粗胫翠尺蛾雌虫。与实际情况相符。
本实施例提供的检测方法具有很好的灵敏性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (8)
1.一种荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的引物在荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定中的应用。
3.一种荔枝粗胫翠尺蛾性别早期鉴定的方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1：提取荔枝粗胫翠尺蛾样品的RNA；
S2：将S1提取的RNA反转录成cDNA；
S3：以S2中获得的cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物组进行PCR扩增；
S4：以S3中所述PCR扩增得到的产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，根据电泳结果判断雌雄虫，其中SEQ ID NO.2-3所示的引物组可扩增出条带为荔枝粗胫翠尺蛾雄虫，未扩增出条带则为荔枝粗胫翠尺蛾雌虫。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述荔枝粗胫翠尺蛾样品为荔枝粗胫翠尺蛾虫蛹。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述反转录反应体系为10μL扩增体系：5×Evo M-MLV RT Master Mix 2μL，样品RNA 1μg，加RNase free water至10μL。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述反转录程序为：37°C变性15分钟；85°C 反应5s，4°C 终止反应。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述PCR扩增反应体系为25μL扩增体系：2×Master Mix 12.5μL，10μM的分子标记引物组的引物各1μL，cDNA模板1μL，加ddH2O至25μL。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述PCR扩增程序为：94°C 预变性5分钟；94°C 变性30s，56°C 退火15s，72°C 延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72°C 延伸5分钟。
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