CN117187118A - 一株支气管败血波氏杆菌a1218及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株支气管败血波氏杆菌A1218及其应用，属于生物制品和预防兽医领域。所述支气管败血波氏杆菌A1218于2023年07月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231122。本发明提供的支气管败血波氏杆菌A1218株毒力较强，低剂量感染可导致幼龄犬、猫的严重感染甚至死亡。该菌株的灭活制品免疫犬、猫均可产生良好的免疫应答，具有良好的免疫原性，对支气管败血波氏杆菌的攻击能够提供较高的免疫保护率，具备开发疫苗的基本潜质。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品和预防兽医领域，特别是涉及一株支气管败血波氏杆菌A1218及其应用。
背景技术
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)是一种革兰氏阴性杆菌，是引起呼吸道感染和疾病的重要致病菌，广泛存在于多种动物的呼吸道中，包括犬、猫、猪、兔等。支气管败血波氏杆菌是一种非胶原酶产生的革兰氏阴性杆菌，具有多株毛(pili)和鞭毛(flagella)。该菌通过多株毛附着在宿主上皮细胞表面，通过鞭毛的运动进行移动。该菌菌体大小约为0.5～1微米宽，1～3微米长，能够在富含血液和营养物的培养基上生长。支气管败血波氏杆菌主要引起呼吸道感染和疾病。在犬中，该菌是引起犬窝咳(Kennel cough)的常见致病菌之一，也可以导致支气管炎和肺炎等疾病。病犬通常表现为咳嗽、打喷嚏、流涕、眼结膜炎等呼吸道症状。在猫中，该菌主要引起猫呼吸道感染和疾病，特别是在多猫户和繁殖场等密集饲养环境中更为常见。猫感染该菌后，常表现为咳嗽、喷嚏、流涕、眼结膜炎和食欲不振等呼吸道症状。
支气管败血波氏杆菌该菌通过飞沫传播，通过接触受感染的犬、猫或被细菌污染的环境或直接接触感染的猫传播给其他犬、猫。支气管败血波氏杆菌很难根除，由于外界环境诱导还有一定的复发概率。目前国内没有犬、猫支气管败血波氏杆菌相关疫苗。所以，需要探寻国内犬、猫支气管败血波氏杆菌的流行菌株，并据此开发出针对国内犬、猫支气管败血波氏杆菌的相关疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一株支气管败血波氏杆菌A1218及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的支气管败血波氏杆菌A1218对犬、猫的致病性强，经灭活后具有良好的免疫原性，对波氏杆菌的攻击能够提供较高的免疫保护率，具有开发疫苗的基本潜质。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)A1218，其于2023年07月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231122。
本发明还提供所述的支气管败血波氏杆菌A1218在制备疫苗中的应用。
进一步地，所述疫苗用于预防由支气管败血波氏杆菌引发的疾病。
进一步地，所述疫苗为犬、猫通用疫苗。
本发明还提供一种犬、猫通用支气管败血波氏杆菌灭活疫苗，包括灭活的支气管败血波氏杆菌A1218，所述支气管败血波氏杆菌A1218的保藏编号为CCTCC NO：M 20231122。
本发明还提供一种犬、猫通用支气管败血波氏杆菌灭活疫苗的制备方法，包括制备所述的支气管败血波氏杆菌A1218的菌液，将所述菌液灭活后加入佐剂制备成疫苗的步骤。
进一步地，所述菌液由所述支气管败血波氏杆菌A1218在含有新生牛血清的TSA培养基中培养获得，所述TSA培养基中新生牛血清的体积分数为4％。
进一步地，所述菌液灭活的方法，包括在所述菌液中加入β-丙内酯灭活。
进一步地，所述β-丙内酯在所述菌液中的体积分数为0.125％。
进一步地，所述灭活为4℃避光灭活36h。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的支气管败血波氏杆菌A1218株毒力较强，低剂量感染可导致幼龄犬、猫的严重感染甚至死亡。该菌株的灭活制品免疫犬、猫可产生良好的免疫应答，具有良好的免疫原性，对支气管败血波氏杆菌的攻击能够提供较高的免疫保护率，具备开发疫苗的基本潜质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为支气管败血波氏杆菌在含有10％新生牛血清TSA平板上生长形态图；
图2为支气管败血波氏杆菌PCR鉴定结果，其中，+代表阳性对照，-代表阴性对照，1～9代表采集样品；
图3为革兰氏染色镜检图；
图4为小鼠气雾攻毒时间与肺组织菌量之间的线性关系图；
图5为8株支气管败血波氏杆菌小鼠免疫原性比较结果，其中，A：不同野毒株灭活苗免疫后小鼠血清的IGg抗体水平，B：各毒株免疫小鼠攻毒后的生存曲线；
图6为3株支气管败血波氏杆菌犬免疫原性比较结果，其中，A：犬免疫A1203、A1218、A1224灭活苗和PBS后血清IgG抗体水平，B：犬免疫A1203、A1218、A1224灭活苗和PBS后对A1218株攻击发病得分；
图7为支气管败血波氏杆菌A1218株对犬的效力，其中，A：犬免疫不同剂量A1218灭活苗和PBS后血清IgG抗体水平，B：犬免疫不同剂量A1218灭活苗和PBS后对A1218株攻击发病打分；
图8为支气管败血波氏杆菌A1218株对猫的效力，其中，A：猫免疫不同剂量A1218灭活苗和PBS后血清IgG抗体水平，B：猫免疫不同剂量A1218灭活苗和PBS后对A1218株攻击发病打分；
图9为灭活疫苗超剂量组、免疫对照组和空白对照组免疫后试验犬体温变化；
图10为灭活疫苗超剂量组、免疫对照组和空白对照组免疫后试验猫体温变化。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述“每头份”或“/头份”是指每只犬或猫每次所用疫苗剂量。未作特别说明指出，在本发明的实施方式中所述“每头份”或“/头份”均为1mL。
本发明实施例中的动物试验由华中农业大学伦理道德委员会批准(伦理编号：HZAUMO-2021-0020)，试验遵照湖北省和科技部《实验动物管理条例》有关实验动物福利和伦理规定，动物试验在华中农业大学实验动物中心实施。
实施例1毒株的分离
2019年9月～2022年6月，用无菌棉拭子采集湖北武汉流浪犬基地以及宠物市场犬、猫的鼻咽拭子，收集宠物医院病死犬、猫尸体的肺组织样本，加入含有5％新生牛血清和20％甘油的TSA培养基中，混匀后吸取200μL，其余样本于-70℃以下保存备用，根据OMEGAViral DNA Kit操作手册提取DNA，-15℃以下保存备用。设计支气管败血波氏杆菌鉴定引物，扩增Fla基因保守区。引物序列为：
上游引物F：5’－TGGCGCCTGCCCTATC－3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物R：5’－AGGCTCCCAAGAGAGAAA－3’(SEQ ID NO.2),
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
反应条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为：94℃30s，56℃30s，72℃30s；35个循环后72℃延伸10min。扩增产物取10μL进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增产物大小为237bp，与预期大小相符(图2)。
将采集的阳性样品用灭菌PBS稀释3个梯度，铺板到含有10μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD；Sigma,St.Louis,MO)和10％新生牛血清的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA；Becton，Dickinson and Company，MD，USA)上。置于37℃培养箱培养48小时。然后按照《ManualofClinical Microbiology,Eleventh Edition》对生长在平板上的分离物进行纯化和培养。在每个琼脂平板上，挑取5个与支气管败血病杆菌具有相似形态特征的菌落(图1)，即直径为0.5至1.0mm的圆形发光或粗糙的小菌落进行生化试验和聚合酶链式反应(PCR)，并进行革兰氏染色镜检(图3)。最终获得犬支气管败血波氏杆菌分离株12株，猫支气管败血波氏杆菌分离株2株，均从犬、猫鼻咽拭子和患有呼吸道疾病综合症发病犬、猫肺组织中分离，鉴定，菌株信息列于(表1)。
表1犬、猫支气管败血波氏杆菌菌株信息
实施例2毒株的毒力试验
1.支气管败血波氏杆菌小鼠毒力试验
实验小鼠为18～22g健康雌性昆明小鼠(SPF级)，获自华中农业大学动物实验中心。
取145只小鼠分成29组，每组5只，编号1～29，编号1～14的每组分别腹腔注射表1中的14株支气管败血波氏杆菌(0.2mL/只)，每组1×107CFU/只；编号15～28的每组分别腹腔注射表1中的14株支气管败血波氏杆菌(0.2mL/只)，每组1×108CFU/只，第29组注射等量的PBS作为对照，注射后每天观察食欲和精神状况并记录死亡情况。结果表明大多数支气管败血波氏杆菌犬、猫分离株在1×108CFU/只剂量下对小鼠致死，部分毒株在1×107CFU/只剂量下对小鼠致死，只有两株支气管败血波氏杆菌在1×108CFU/只剂量下对小鼠表现为不致死(表2)。
表2犬、猫支气管败血波氏杆菌对小鼠的致死率
| 菌株名称 | 攻毒剂量 | 致死率 | 攻毒剂量 | 致死率 |
| A1201 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 5/5 |
| A1218 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 5/5 |
| A1206 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 4/5 |
| A1224 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 4/5 |
| C1811 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 4/5 |
| C1816 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 3/5 |
| A1212 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 3/5 |
| A1203 | 1×108 | 5/5 | 1×107 | 3/5 |
| CB1131 | 1×108 | 4/5 | 1×107 | 2/5 |
| D1191 | 1×108 | 4/5 | 1×107 | 2/5 |
| D1192 | 1×108 | 3/5 | 1×107 | 1/5 |
| CB1132 | 1×108 | 2/5 | 1×107 | 0/5 |
| A1220 | 1×108 | 0/5 | 1×107 | 0/5 |
| C1808 | 1×108 | 0/5 | 1×107 | 0/5 |
2.A1218株小鼠毒力试验
将SPF级小鼠58只，分为5组，攻毒组每组12只，空白组10只，为模拟正常感染，采用气雾攻毒方式攻毒，将A1218株的菌量调整到1×1012CFU/mL，第1组气雾攻毒15min，第2组气雾攻毒30min，第3组气雾攻毒45min，第4组气雾攻毒60min，每组攻毒后取2只小鼠断颈处死，取肺进行细菌计数，得到攻毒时间与肺组织菌量之间成线性关系(图4)，每组之间隔离饲养，攻毒后临床观察14天。结果表明15min攻毒组1/10死亡；30min攻毒组7/10死亡；45min攻毒组9/10死亡；60min攻毒组10/10死亡；对照组全部存活。
3.A1218株犬毒力试验
将A1218株菌液分别稀释至1×108CFU/mL、1×109CFU/mL和1×1010CFU/mL，选取支气管败血波氏杆菌血清Elisa抗体值、鼻咽拭子抗原均为阴性的6～8周龄试验犬20只，分为4组，采用气雾攻毒方式攻毒，统一在密闭空间内(长60cm，宽50cm，高50cm)雾化35min，第1组为1×108CFU/mL攻毒组，第2组为1×109CFU/mL攻毒组，第3组为1×1010CFU/mL攻毒组，第4组为对照组，隔离饲养，并于攻毒后临床观察14天并对发病犬打分。结果表明1×108CFU/mL攻毒组3/5试验犬出现精神沉郁、浆液性或脓性眼鼻分泌物，咳嗽，干呕等临床症状；1×109CFU/mL和1×1010CFU/mL攻毒组分别有4/5和5/5精神沉郁、浆液性或脓性眼鼻分泌物，咳嗽，干呕等临床症状；对照组无明显症状。说明A1218株对犬的致病力较强。
4.A1218株猫毒力试验
将A1218株菌液分别稀释至1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL，选取支气管败血波氏杆菌血清Elisa抗体值、鼻咽拭子抗原均为阴性的10～12周龄试验猫20只，分为4组，采用气雾攻毒方式攻毒，统一在密闭空间内(长60cm，宽50cm，高50cm)雾化35min，第1组为1×107CFU/mL攻毒组，第2组为1×108CFU/mL攻毒组，第3组为1×109CFU/mL攻毒组，第4组为对照组，隔离饲养，并于攻毒后临床观察14天并对发病猫打分。结果表明1×107CFU/mL攻毒组3/5试验猫出现精神沉郁、浆液性或脓性眼鼻分泌物，咳嗽，干呕等临床症状；1×108CFU/mL攻毒组4/5试验猫出现精神沉郁、浆液性或脓性眼鼻分泌物，咳嗽，干呕等临床症状；1×109CFU/mL攻毒组5/5精神沉郁、浆液性或脓性眼鼻分泌物，咳嗽，干呕等临床症状；其中1×109CFU/mL攻毒组有两只10周龄幼猫死亡，剖检气管淤血、出血，肺部严重病变，整个肺出血，水肿。对照组无明显症状。说明相较于犬，A1218株对猫致病力更强。
实施例3毒株的免疫原性研究
1.支气管败血波氏杆菌小鼠免疫原性比较
将90只18-22g SPF级小鼠随机分为9组，每组10只，将8株毒力较强的支气管败血波氏杆菌(A1201、A1203、A1206、A1212、A1218、A1224、C1811和C1816)菌液菌量统一调整到108.0CFU/mL，灭活，使用铝胶佐剂配制疫苗(铝胶终浓度为0.5mg/mL)，对小鼠进行大腿肌肉注射100μL；第9组注射等量的PBS作为阴性对照。每周采血，第四周菌量调整到1012CFU/只攻毒45min，观察并记录其临床症状，发病及死亡情况，剖检死亡小鼠并进行细菌的分离鉴定。筛选出免疫原性较强的菌株作为候选疫苗株。结果表明，各菌株之间Elisa抗体无显著性差异，但攻毒保护数据有差异，其中A1218株4/5保护，A1203株3/5保护，A1224株3/5保护(图5)。
2.支气管败血波氏杆菌犬免疫原性比较
将20只4～6周龄健康易感犬随机分为4组，每组5只，选取在小鼠上免疫原性最优的A1218株，A1203株和A1224株免疫犬进行免疫原性比较试验。配置灭活苗对试验犬进行免疫，第1组为A1218株灭活疫苗免疫组，第2组为A1203株灭活疫苗免疫组，第3组为A1224株灭活疫苗免疫组，第4组为空白对照组，对犬进行颈部皮下免疫(1×108CFU/只)，21天后以同样方式进行二免，二免后14天用A1218株气雾攻毒(1×1010CFU/mL在密闭空间雾化35min)，攻毒前每周采血，分离血清。攻毒后14天内观察试验犬有无出现浆液性或脓性眼鼻分泌物、咳嗽和干呕等典型支气管败血波氏杆菌特征症状，并于攻毒后第7天采集上呼吸道拭子(若试验犬存在死亡，则当天取样检测)，使用PCR进行Bb病原鉴定。结果显示，A1218株，A1203株和A1224株血清IGg抗体值无显著性差异(图6A)，攻毒保护数据来看，A1218株5/5保护，A1203株4/5保护，A1224株3/5保护，对照组5/5发病(图6B)，出现浆液性或脓性眼鼻分泌物、咳嗽和干呕等典型支气管败血波氏杆菌特征症状，得分数据如图所示(图6C)，免疫组平均得分显著低于对照组。
本实施例说明A1218株的免疫原性最优。
实施例4支气管败血波氏杆菌A1218株的效力研究
1.A1218株犬效力研究
将20只4～6周龄健康易感犬随机分为4组，每组5只，A1218株菌液计数灭活，用PBS稀释，加入水佐剂调整浓度为1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL。犬颈部皮下注射1mL/只；第1组为1×107CFU/mL免疫组，第2组为1×108CFU/mL免疫组，第3组为1×109CFU/mL免疫组，第4组注射等量的PBS作为阴性对照。第三周采用与一免相同的方式进行二免，二免后14天气雾攻毒(1×1010CFU/mL在密闭空间雾化35min)。攻毒前每周采血，分离血清。攻毒后14天内根据试验犬有无出现浆液性或脓性眼鼻分泌物、咳嗽和干呕等症状进行打分，并于攻毒后第7天采集上呼吸道拭子(若试验犬存在死亡，则当天取样检测)，使用PCR进行Bb病原鉴定。结果表明，1×107CFU/mL免疫组0/5保护，1×108CFU/mL免疫组3/5保护，1×109CFU/mL免疫组5/5保护，空白对照组全部发病(图7的C)。随着抗原剂量的增加，血清中IGg抗体显著增加，二免后第四周抗体值显著性升高(图7的A)。1×109CFU/mL免疫组犬平均得分为0，1×107CFU/mL免疫组虽然犬只发病，但平均得分比空白组显著降低(图7的B)。并且攻毒后第7天上呼吸道拭子采样Bb病原鉴定均为阳性。
2.A1218株猫效力研究
将20只4-6周龄健康易感猫随机分为4组，每组5只，A1218株菌液计数灭活，用PBS稀释，加入水佐剂调整浓度为1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL。犬颈部皮下注射1mL/只；第1组为1×107CFU/mL免疫组，第2组为1×108CFU/mL免疫组，第3组为1×109CFU/mL免疫组，第4组注射等量的PBS作为阴性对照。第三周采用与一免相同的方式进行二免，二免后14天气雾攻毒(1×1010CFU/mL在密闭空间雾化35min)。攻毒前每周采血，分离血清。攻毒后14天内根据试验犬有无出现浆液性或脓性眼鼻分泌物、咳嗽和干呕等症状进行打分，并于攻毒后第7天采集上呼吸道拭子(若试验猫存在死亡，则当天取样检测)，使用PCR进行Bb病原鉴定。结果表明，1×107CFU/mL免疫组2/5保护，1×108CFU/mL免疫组4/5保护，1×109CFU/mL免疫组5/5保护，空白对照组全部发病，与在犬上Elisa抗体值相似随着抗原增加而增高，免疫组平均得分显著低于对照组，并且攻毒后第7天上呼吸道拭子采样Bb病原鉴定均为阳性(图8)。
综上所述，本发明所述的支气管败血波氏杆菌A1218株，生长状态良好，该菌株对健康易感犬、猫的毒力较强，可引起咳嗽，浆液性或脓性眼鼻分泌物和支气管肺炎等症状；该菌株的灭活制品免疫小鼠，犬，猫可产生良好的免疫应答，具有良好的免疫原性，作为灭活疫苗可较好的刺激机体产生针对支气管败血波氏杆菌的高水平Elisa抗体，对支气管败血波氏杆菌的攻击能够提供较高的免疫保护率，具备开发疫苗的基本潜质。
该菌株于2023年07月06日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20231122，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例5灭活疫苗的制备及检验
1.菌液的制备
将A1218菌株接种于含4％新生牛血清的TSA培养基中，37℃培养24h，挑取单菌落转接纯化培养1次，然后挑取单菌落接种于含4％新生牛血清的TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养16h作为种子液；按1：100的比例将种子液转接至含4％新生牛血清的TSB液体培养基中，37℃振荡培养12h获得菌液。
2.菌液的灭活
按照0.1％、0.2％和0.3％的终浓度将β-丙内酯分别加到支气管败血波氏杆菌A1218菌液中，置于4℃冰箱旋转仪上，以60rpm分别作用12h，24h和36h；灭活后37℃水浴锅水解2h，避免β-丙内酯残留。将灭活后的菌液分别接种在含4％牛血清的TSB液体培养基和5％牛血清的TSA固体培养基中，37℃培养24h，检验灭活效果(表3)。
表3菌液的灭活
注：“+”代表灭活成功，“-”代表未灭活成功。
由表3可知，当β-丙内酯的终浓度为0.125％，灭活时间为36h，菌液的灭活效果最好。
3.疫苗的制备及检验
将灭活完全并检验合格的菌液，根据佐剂使用说明加入购自法国赛彼科(SEPPIC)的MONTANIDETM GEL-02佐剂，制备灭活疫苗。选取血清IgG抗体、鼻咽拭子抗原均为阴性的4～6周龄健康易感犬和猫各15只，各自分为3组，第1组为超剂量组，每只试验犬或试验猫颈部皮下注射2头份A1218株灭活疫苗；第2组为免疫对照组，每只试验犬或试验猫颈部皮下注射1头份A1218株灭活疫苗；第3组为空白对照组，接种等量PBS，临床观察14天并记录体温，均为5/5健活，未见不良反应(图9-10)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一株支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)A1218，其特征在于，其于2023年07月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231122。
2.如权利要求1所述的支气管败血波氏杆菌A1218在制备疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗用于预防由支气管败血波氏杆菌引发的疾病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为犬、猫通用疫苗。
5.一种犬、猫通用支气管败血波氏杆菌灭活疫苗，其特征在于，包括灭活的支气管败血波氏杆菌A1218，所述支气管败血波氏杆菌A1218的保藏编号为CCTCC NO：M 20231122。
6.一种犬、猫通用支气管败血波氏杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括制备权利要求1所述的支气管败血波氏杆菌A1218的菌液，将所述菌液灭活后加入佐剂制备成疫苗的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述菌液由所述支气管败血波氏杆菌A1218在含有新生牛血清的TSA培养基中培养获得，所述TSA培养基中新生牛血清的体积分数为4％。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述菌液灭活的方法，包括在所述菌液中加入β-丙内酯灭活。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述β-丙内酯在所述菌液中的体积分数为0.125％。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述灭活为4℃灭活36h。
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