CN117143998A - 用于儿童喘息性疾病用药的检测引物组、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于儿童喘息性疾病用药的检测引物组、试剂盒。本发明提供的检测引物组包含扩增引物组和单碱基延伸引物组；试剂盒可用于检测儿童常用抗喘息药物相关的16个基因的18个基因多态性位点；覆盖的儿童喘息性疾病用药种类最全面，包含β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素、抗组胺药、抗感染药物、抗胆碱能药物、解热镇痛药，可为合理给药提供科学的参考依据。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于儿童喘息性疾病用药的检测引物组、试剂盒。
背景技术
儿童喘息性疾病是一组临床综合征，其典型症状为喘息，常在患有呼吸道疾病时出现。在很多儿童呼吸道疾病，如支气管哮喘（简称哮喘）、支气管炎、肺炎中，都可表现为以喘息为主的临床特征。数据表明，约34%的儿童在3周岁之前出现过至少1次喘息，有近一半儿童在6岁前会出现喘息。因为治疗不及时或治疗不彻底常会导致迁延不愈、反复发作，给儿童及家长造成了很大的负担。尤其对于6个月以下的婴儿来说，更会使他们呼吸困难导致呼吸衰竭、心力衰竭而危及生命。
《儿童喘息性疾病合理用药指南》中指出儿童喘息性疾病的常用药物包括支气管扩张剂（β2受体激动剂、抗胆碱药物等）、糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂、抗组胺药物等。《儿童常见喘息性疾病抗病原微生物药物合理应用专家共识》中提到，一些抗感染药物如利巴韦林、妥布霉素是儿童喘息性疾病的抗病原微生物药物。喘息性儿童患者如果出现发烧疼痛症状时需要使用布洛芬等解热镇痛的药物。不同药物的治疗效果和毒副作用风险在不同个体间存在很大的差异，造成这些差异的主要原因是基因多态性，如何根据儿童患者的情况进行精准治疗成为喘息性疾病治疗的关键。例如，（1）ADRB2基因是G蛋白受体家族的成员之一，其编码β2肾上腺素能受体，产物表达于人体不同组织和细胞，包括肺平滑肌组织和炎症细胞等。其中rs1042713突变能增高气道反应性，并通过显著下调受体数量而影响β2受体激动剂的疗效，rs1042713 AA基因型患者在使用β2受体激动剂治疗时的疗效较GG/AG基因型差，大概28%的中国人携带AA基因型，对于这些患者应考虑避免使用沙丁胺醇、沙美特罗等β2受体激动剂，更换使用其他药物。（2）ITPA基因编码三磷酸肌苷焦磷酸酶，其中rs1127354位点基因多态性与溶血性贫血的发生相关，rs1127354 CC基因型患者在使用利巴韦林治疗时发生贫血的风险比AA/AC基因型高，在中国69%的人群携带CC基因型，对于这些患者应考虑避免使用利巴韦林，更换使用其他药物。（3）线粒体 MT-RNR1基因突变主要引起药物性非综合征型母系遗传性聋，其导致的耳聋为双侧、程度不等且与氨基糖苷类药物的使用有关。携带MT-RNR1(1555A>G)(rs267606617)和MT-RNR1(1494C>T)(rs267606619)突变的儿童在成长过程中应严格避免使用妥布霉素等氨基糖苷类药物，否则极有可能出现药物性耳聋。（4）CYP2C9是人体内代谢药物的主要酶细胞色素P450超家族的一员，主要存在于肝脏和肠道中。临床使用的药物大约16% 通过其代谢。CYP2C9*3对布洛芬的代谢速率减慢，发生毒副反应的风险较高，携带CYP2C9*3的患者应尽量避免使用布洛芬，选择其他解热镇痛的药物。
目前尚未检索到儿童喘息性疾病用药基因检测试剂盒相关的专利，相近的试剂盒全部集中于儿童哮喘用药基因检测方向，例如，专利CN202210375807.8公开了用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法，通过ARMS-PCR法检测了3个基因的3个单核苷酸多态性（SNP）位点，检测的位点偏少，且指导的药物种类少（β2受体激动剂、糖皮质激素）；专利CN202010904926.9公开了与哮喘相关基因的分子标记及其检测引物组和应用，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法，检测了哮喘用药相关的4个基因的4个基因多态性位点，仅覆盖3类哮喘药物（β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂和糖皮质激素）。专利CN202110560173.9公开了一种用于儿童哮喘个体化用药的基因检测试剂盒及其应用，通过二代测序的方法，检测了哮喘用药相关的31个基因的41个多态性位点，但是时效性差、成本较高、检测项目较为冗余，且仅覆盖儿童常用平喘药物，包括沙美特罗、糖皮质激素、沙丁胺醇、特布他林。这些专利都仅覆盖2-3类儿童常用哮喘药物，并未涉及到儿童喘息性疾病其他种类的药物。因此，有必要开发一种检测位点多、操作简单、低成本且能够覆盖儿童喘息性疾病常见药物的基因检测试剂盒，提高药物疗效，降低毒副作用风险，指导喘息性疾病儿童精准用药。
发明内容
本发明提出用于检测儿童喘息性疾病用药基因SNP位点的成套引物，使用飞行时间核酸质谱技术法，能够在同一个反应孔内快速完成18个SNP分型，不涉及探针、荧光标记和凝胶电泳等手段，检测准确、快速，性价比高；通过对儿童常用7大类药物(β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素、抗组胺药、抗感染药物、抗胆碱能药物、解热镇痛药)相关的药物基因进行检测，了解儿童对不同类药物的敏感性及毒副作用风险，为合理给药提供科学的参考依据。
本发明采用的技术方案为：
本发明实施例的第一个目的：提供一种用于儿童喘息性疾病用药的检测引物组，所述儿童喘息性疾病用药的基因及位点具体为：ADRB2基因上的rs1042713位点和rs1042714位点；ABCB1基因上的rs1045642位点；CYP2C9基因上的rs1057910位点；CYP2D6基因上的rs1065852位点；ITPA基因上的rs1127354位点；SLC22A8基因上的rs11568482位点；SLCO2B1基因上的rs12422149位点；HDAC1基因上的rs1741981位点；ADCY9基因上的rs2230739位点；ABCC2基因上的rs2273697位点；MT-RNR1基因上的rs267606617位点和rs267606619位点；FCER2基因上的rs28364072位点；CYP3A4基因上的rs35599367位点；GLCCI1基因上的rs37973位点；SERPINE1基因上的rs6092位点；CYP3A5基因上的rs776746位点。
所述检测引物组包含扩增引物组和单碱基延伸引物组，所述扩增引物组包括：
rs1042713上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
rs1042713下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
rs1042714上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
rs1042714下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；
rs1045642上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；
rs1045642下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
rs1057910上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；
rs1057910下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；
rs1065852上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；
rs1065852下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；
rs1127354上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；
rs1127354下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；
rs11568482上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；
rs11568482下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示；
rs12422149上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示；
rs12422149下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16所示；
rs1741981上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:17所示；
rs1741981下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；
rs28364072上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；
rs28364072下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:20所示；
rs2230739上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；
rs2230739下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示；
rs2273697上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:23所示；
rs2273697下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；
rs267606617上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示；
rs267606617下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；
rs267606619上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示；
rs267606619下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示；
rs35599367上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；
rs35599367下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示；
rs37973上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示；
rs37973下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；
rs6092上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示；
rs6092下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:34所示；
rs776746上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:35所示；
rs776746下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:36所示；
所述单碱基延伸引物组包括：
rs1042713延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:37所示；
rs1042714延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:38所示；
rs1045642延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:39所示；
rs1057910延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:40所示；
rs1065852延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:41所示；
rs1127354延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:42所示；
rs11568482延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:43所示；
rs12422149延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:44所示；
rs1741981延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:45所示；
rs28364072延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:46所示；
rs2230739延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:47所示；
rs2273697延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:48所示；
rs267606617延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:49所示；
rs267606619延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:50所示；
rs35599367延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:51所示；
rs37973延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:52所示；
rs6092延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:53所示；
rs776746延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:54所示。
本发明实施例的另外一个目的：提供一种用于儿童喘息性疾病用药的试剂盒，包括上述的用于儿童喘息性疾病用药的检测引物组。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述儿童喘息性疾病的相关药物包括：β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素、抗组胺药、抗感染药物、抗胆碱能药物、解热镇痛药。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述试剂盒包括PCR反应液、SAP反应液、扩增引物组及树脂纯化预制板。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述 PCR 反应液和扩增引物组的反应体系配置为，
PCR 反应液：PCR Buffer 0.5μL，MgCl2 0.4μL，dNTP 0.1μL，ddH2O 1.8μL，PCR 酶0.2μL；
扩增引物组：Primer forward mix 0.5μL，Primer reverse mix 0.5μL；
Total：4.0μL。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述 SAP 反应液的体系配置为，SAP 试剂：SAP
Buffer 0.17μL，SAP 酶 0.3μL，ddH2O 1.53μL。
本发明实施例的另外一个目的：上述任一项试剂盒在儿童喘息性疾病用药基因检测中的应用，检测过程如下：
S1、从样本中提取基因组DNA；
S2、基因组DNA的PCR扩增反应；
S3、PCR扩增产物的SAP消化；
S4、单碱基延伸反应；
S5、单碱基延伸产物的树脂纯化；
S6、飞行时间质谱检测；
S7、分析步骤S6得到的检测数据结果，结合报告***出具检测报告。
相比于现有技术，本发明具有以下特点：（1）本发明方法方便快捷，使用飞行时间核酸质谱技术技术，能够在同一个反应孔内快速完成18个儿童喘息性疾病用药基因SNP分型，不涉及探针、荧光标记和凝胶电泳等手段，检测通量高、效率高、准确度高且成本较低，适合规模化人群筛查。（2）覆盖的儿童喘息性疾病用药种类最全面，包括β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素、抗组胺药、抗感染药物、抗胆碱能药物、解热镇痛药，可为合理给药提供科学的参考依据。
附图说明
图1为ADRB2基因rs1042713位点复孔1基因型核酸质谱峰图；
图2为ADRB2基因rs1042713位点复孔2基因型核酸质谱峰图；
图3为ADRB2基因rs1042713位点复孔3基因型核酸质谱峰图；
图4为CYP2C9基因rs1057910位点复孔1基因型核酸质谱峰图；
图5为CYP2C9基因rs1057910位点复孔2基因型核酸质谱峰图；
图6为CYP2C9基因rs1057910位点复孔3基因型核酸质谱峰图。
具体实施方案
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白 ，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供的基于核酸质谱技术检测儿童喘息性疾病药物相关基因的核酸组合物，其包括用于进行多重PCR扩增儿童喘息性疾病药物相关基因的扩增引物组以及用于进行单碱基延伸反应的延伸引物组。
其中，扩增引物组包括如下引物对：rs1042713上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；rs1042713下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；rs1042714上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；rs1042714下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；rs1045642上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:5所示；rs1045642下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；rs1057910上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；rs1057910下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；rs1065852上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；rs1065852下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；rs1127354上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；rs1127354下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:12所示；rs11568482上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；rs11568482下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示；rs12422149上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示；rs12422149下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16所示；rs1741981上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:17所示；rs1741981下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；rs28364072上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；rs28364072下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:20所示；rs2230739上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；rs2230739下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示；rs2273697上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:23所示；rs2273697下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；rs267606617上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示；rs267606617下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；rs267606619上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示；rs267606619下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示；rs35599367上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；rs35599367下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示；rs37973上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示；rs37973下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；rs6092上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示；rs6092下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:34所示；rs776746上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:35所示；rs776746下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:36所示。
另外，单碱基延伸引物组包含以下序列：rs1042713单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:37所示；rs1042714单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:38所示；rs1045642单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:39所示；rs1057910单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:40所示；rs1065852单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:41所示；rs1127354单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:42所示；rs11568482单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:43所示；rs12422149单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:44所示；rs1741981单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:45所示；rs28364072单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:46所示；rs2230739单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:47所示；rs2273697单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:48所示；rs267606617单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:49所示；rs267606619单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:50所示；rs35599367单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:51所示；rs37973单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:52所示；rs6092单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:53所示；rs776746单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:54所示。
实施例2
一、为验证本发明的儿童喘息性疾病基因检测试剂盒中扩增引物及延伸引物的有效性及检测结果与样本实际符合度，选取2个具有喘息症状的儿童血卡样本，分别编号为JM-01和JM-02，每个样本设置3个复孔，在核酸质谱平台上进行SNP分型，过程如下：
Step1、血卡DNA提取：利用嘉兴医脉赛科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒进行血卡中血液DNA的提取。按标签所示，吸取PK溶解液至蛋白酶K干粉中配置成蛋白酶K溶解液40mg/ml，颠倒混匀数次，将血卡裁剪到离心管中，加入400μL裂解液和20μL蛋白酶K，70℃孵育1h，而后吸取200μL孵育后的液体加入到提取试剂盒中含裂解吸附液对应孔中；将预制板放入核酸提取仪相应位置，在相应位置放置磁棒套；选取相应的自动化提取程序，开始提取，提取参数如表1；提取程序结束后吸出核酸的洗脱液到离心管中，离心管内液体含有基因组DNA。测定DNA浓度和纯度：DNA的A260/A280在1.6~2.0之间，浓度为5ng/μL以上。如 DNA纯度低于或者高于检测范围，必须重抽；浓度低于检测范围，必须重抽，浓度高于检测范围则需要稀释再进行试验。具体操作参照《Nanodrop 2000 紫外分光光度计标准操作规程》。
表1 提取程序参数
| 模组 | 流程号 | 搅拌强度(级) | 搅拌时间(秒) | 下降吸磁(秒) | 液底吸磁(秒) | 吸磁次数(次) | 晾干时间(秒) | 暂停(关/开)(0/1) | 板1(℃) | 板2(℃) | 板3(℃) | 板4(℃) | 板5(℃) | 板6(℃) | 板7(℃) | 板8(℃) | 风扇(关/开)(0/1) |
| 0 | 17 | 5 | 5 | 5 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 4 | 5 | 5 | 5 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 10 | 100 | 20 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 420 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 10 | 100 | 20 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 180 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 3 | 480 | 100 | 10 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 60 | 100 | 10 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 180 | 100 | 10 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 180 | 100 | 10 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 70 | 0 |
| 0 | 0 | 4 | 180 | 100 | 10 | 1 | 120 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 70 | 0 |
| 0 | 1 | 3 | 600 | 100 | 40 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 70 | 0 |
| 0 | 5 | 5 | 5 | 5 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Step2、配制PCR Mix(ddH2O 1.8μL，10×PCR Buffer 0.5μL，MgCl2 0.4μL，dNTP0 .1μL，PCR酶0.2μL)，震荡混匀后按照多重PCR扩增的反应体系(5μL)：PCR Mix 3μL，扩增上下游引物Mix 1μL，模板DNA 1μL依次添加至384孔板，封板膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀离心；将384孔板置于Bio-Rad T100 384Well进行扩增反应，反应条件：95℃预变性2min，(95℃30s，56℃30s，72℃1min)45个循环，72℃5min，4℃保持；得到PCR扩增产物，离心，备用。
Step3、SAP消化：取出Step2步骤中PCR扩增产物，离心后去封板膜，置于4℃冰板备用；配制SAP Mix(ddH2O 1.53μL，SAP Buffer 0.17μL，SAP酶0.3μL)，震荡混匀后添加至384孔板的每个反应孔2μL，使用封板膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于Bio-Rad T100 384Well上进行SAP消化反应，反应条件：37℃ 40min，85℃ 5min，4℃保持；得到SAP消化产物，离心备用。
Step4、单碱基延伸反应：配制iPLEX Mix (ddH2O 0.7395μL，iPLEX Buffer 0.2μL，Termination Mix 0.1μL，iPLEX酶0.0205μL)，震荡混匀后添加至384孔板的每个反应孔1.06μL，然后在每个反应孔中分别加入对应的单碱基延伸引物Mix 0 .94μL，使用封板膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于Bio-Rad T100 384Well上进行延伸反应，反应条件：95℃预变性30s，(52℃5s，80℃5s)5个重复，[95℃变性5s，(52℃5s，80℃5s)5个重复]40个重复；72℃ 3min，4℃保持；得到延伸产物，离心备用。
Step5、树脂纯化：将步骤Step4中得到的单碱基延伸产物的384孔板，轻轻撕下封板膜后，每孔加入11μL ddH2O，震荡混匀，离心置于4℃冰板上备用；取干净的A4纸将6MG384板置于其上，用小勺取适量纯化树脂，用塑料板反复左右推平纯化树脂，压实，使每孔树脂含量均匀；将384板倒置压在6MG 384板上，两板对调，6MG板在上，敲打6MG板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中；封板膜封好后，摇床上60rpm/min翻转20分钟，充分纯化。
Step6、芯片点样：将步骤Step5中的384孔板置于离心机中，4000rpm离心5min，去封板膜备用；启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上；点样后的芯片使用MALDI-TOF分析，使用TYPER4 .0软件分型并输出检测结果。
二、上述检测结果分析如下
利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法进行SNP基因分型，经TYPER4 .0软件分型并输出检测结果，如表2和表3所示。表2和表3分别为实施例JM-01和JM-02的SNP位点基因检测结果，由表2和表3可以看出，上述实施例1提供的18个位点的基因型均能准确检出，检出率均为100％；所有位点3个复孔基因型进行比对后，符合率达到100％，随机选取实施JM-02样本2个位点的3个复孔质谱图谱在附图中进行展示说明，详见附图1～6。
表2 样本JM-01的SNP位点基因检测结果
| SNP位点 | 检测结果 | SNP位点 | 检测结果 | SNP位点 | 检测结果 |
| rs1042713 | AG | rs11568482 | T | rs267606619 | C |
| rs1042714 | C | rs12422149 | AG | rs28364072 | AG |
| rs1045642 | AG | rs1741981 | CT | rs35599367 | G |
| rs1057910 | A | rs2230739 | T | rs37973 | A |
| rs1065852 | A | rs2273697 | G | rs6092 | G |
| rs1127354 | CA | rs267606617 | A | rs776746 | C |
表3 样本JM-02的SNP位点基因检测结果
| SNP位点 | 检测结果 | SNP位点 | 检测结果 | SNP位点 | 检测结果 |
| rs1042713 | AG | rs11568482 | T | rs267606619 | C |
| rs1042714 | GC | rs12422149 | A | rs28364072 | A |
| rs1045642 | G | rs1741981 | C | rs35599367 | G |
| rs1057910 | A | rs2230739 | C | rs37973 | A |
| rs1065852 | GA | rs2273697 | AG | rs6092 | G |
| rs1127354 | CA | rs267606617 | A | rs776746 | CT |
三、上述检测结果解读：
参照PharmGKB数据库中的基因多态性与药物关联性研究，对受检者的各类喘息常见药物疗效及副作用风险进行基因检测结果解读，如表4所示，上述解读均以实施例样本JM-01的基因检测结果为例。
表4 样本JM-01哮喘药物关联基因解读
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.用于儿童喘息性疾病用药的检测引物组，其特征在于，所述儿童喘息性疾病用药的基
因及位点具体为：ADRB2 基因上的 rs1042713 位点和 rs1042714 位点；ABCB1 基因上的
rs1045642 位点；CYP2C9 基因上的 rs1057910 位点；CYP2D6 基因上的 rs1065852位点；
ITPA 基因上的 rs1127354 位点；SLC22A8 基因上的 rs11568482 位点；SLCO2B1 基因上
的 rs12422149 位点；HDAC1 基因上的 rs1741981 位点；ADCY9 基因上的 rs2230739位
点；ABCC2基因上的rs2273697位点；MT-RNR1基因上的rs267606617位点和rs267606619
位点；FCER2 基因上的 rs28364072 位点；CYP3A4 基因上的 rs35599367 位点；GLCCI1
基因上的 rs37973 位点；SERPINE1 基因上的 rs6092 位点；CYP3A5 基因上的rs776746
位点；
所述检测引物组包含扩增引物组和单碱基延伸引物组，所述扩增引物组包括：
rs1042713 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:1 所示；
rs1042713 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:2 所示；
rs1042714 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:3 所示；
rs1042714 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:4 所示；
rs1045642 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:5 所示；
rs1045642 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:6 所示；
rs1057910 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:7 所示；
rs1057910 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:8 所示；
rs1065852 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:9 所示；
rs1065852 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:10 所示；
rs1127354 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:11 所示；
rs1127354 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:12 所示；
rs11568482 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:13 所示；
rs11568482 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:14 所示；
rs12422149 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:15 所示；
rs12422149 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:16 所示；
rs1741981 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:17 所示；
rs1741981 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:18 所示；
rs28364072 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:19 所示；
rs28364072 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:20 所示；rs2230739 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:21 所示；
rs2230739 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:22 所示；
rs2273697 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:23 所示；
rs2273697 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:24 所示；
rs267606617 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:25 所示；
rs267606617 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:26 所示；
rs267606619 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:27 所示；
rs267606619 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:28 所示；
rs35599367 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:29 所示；
rs35599367 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:30 所示；
rs37973 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:31 所示；
rs37973 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:32 所示；
rs6092 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:33 所示；
rs6092 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:34 所示；
rs776746 上游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:35 所示；
rs776746 下游引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:36 所示；
所述单碱基延伸引物组包括：
rs1042713 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:37 所示；
rs1042714 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:38 所示；
rs1045642 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:39 所示；
rs1057910 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:40 所示；
rs1065852 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:41 所示；
rs1127354 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:42 所示；
rs11568482 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:43 所示；
rs12422149 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:44 所示；
rs1741981 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:45 所示；
rs28364072 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:46 所示；
rs2230739 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:47 所示；
rs2273697 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:48 所示；
rs267606617 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:49 所示；rs267606619延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:50 所示；
rs35599367 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:51 所示；
rs37973 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:52 所示；
rs6092 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:53 所示；
rs776746 延伸引物，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:54 所示。
2.用于儿童喘息性疾病用药的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于儿童喘息性疾病用药的检测引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述儿童喘息性疾病的相关药物包括：β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素、抗组胺药、抗感染药物、抗胆碱能药物、解热镇痛药。
4.根据权利要求 2 所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 PCR 反应液、SAP 反应液、扩增引物组及树脂纯化预制板。
5.根据权利要求 4 所述的试剂盒，其特征在于，所述 PCR 反应液和扩增引物组的反应体
系配置为，
PCR 反应液：PCR Buffer 0.5μL，MgCl2 0.4μL，dNTP 0.1μL，ddH2O 1.8μL，PCR 酶0.2μL；
扩增引物组：Primer forward mix 0.5μL，Primer reverse mix 0.5μL；
Total：
4.0μL。
6.根据权利要求 4 所述的试剂盒，其特征在于，所述 SAP 反应液的体系配置为，
SAP 试剂：SAP Buffer 0.17μL，SAP 酶 0.3μL，ddH2O 1.53μL。
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