CN117110613A - 诊断试剂盒及LMWK-Fc在制备肝纤维化诊断试剂中的应用 - Google Patents

诊断试剂盒及LMWK-Fc在制备肝纤维化诊断试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种诊断试剂盒及LMWK‑Fc在制备肝纤维化诊断试剂中的应用，该试剂盒包括包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液、酶结合物试剂、去除非特异反应的稀释液、化学发光底物液、以及核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品。与现有技术相比，本发明提供了一种测定核心岩藻糖基化低分子量激肽原浓度的试剂盒，利用本发明提供的试剂盒，根据夹心法的原理可以准确、灵敏、快速地测定样本中核心岩藻糖基化低分子量激肽原的浓度。本发明研究发现核心岩藻糖基化低分子量激肽原作为肝纤维化的标志物并结合化学发光法检测可以提高肝纤维化的诊断的灵敏度和特异性，提高肝纤维化的诊断的准确性。

Description

诊断试剂盒及LMWK-Fc在制备肝纤维化诊断试剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种诊断试剂盒及LMWK-Fc在制备肝纤维化诊断试剂中的应用。
背景技术
根据《肝纤维化诊断及治疗共识(2019年)》，目前临床常用的肝纤维化的诊断方法分为四类：肝活检组织病理学、肝静脉压力梯度、血液生物化学指标、影像学评估。肝活组织病理学仍然是肝纤维化诊断的“金标准”，由于肝活检属于创伤性检查，限制了其普遍应用。肝静脉压力梯度和影像学评估容易受到仪器设备、操作者的技术和经验等因素的影响，特异性和灵敏度差异大。常用的血清学指标特异性差，易受到其他内科疾病的影响，影响肝纤维化判断的准确性。
糖基化是细胞内普遍存在的一种翻译后修饰，它能够参与多种生理病理过程的调控，核心岩藻糖基化是岩藻糖以α1，6键的形式与N-聚糖最里面的N-乙酰葡萄糖胺连接的一种修饰。核心岩藻糖基化修饰普遍存在于糖蛋白中，蛋白质核心岩藻糖基化水平的异常改变与肝脏疾病密切相关。低分子量激肽原是肝脏分泌的一种与炎症和应激相关的急性期蛋白，具有抑制巯基蛋白酶的功能。体内的低分子量激肽原主要有三种糖基化形式：核心岩藻糖基化低分子量激肽原、非岩藻糖化低分子量激肽原和天线结构岩藻糖基化低分子量激肽原。本发明研究发现，核心岩藻糖基化低分子量激肽原(Core-fucosylated-Low-Molecular-Weight Kininogen，LMWK-Fc)水平在健康人中较低，在肝纤维化和肝硬化人群体中显著升高。通过检测血样中的核心岩藻糖基化低分子量激肽原的水平来诊断肝纤维化，可以改善目前肝纤维化诊断过程诊断准确率较低的问题。
基于此，本发明的首要目的是提供一种LMWK-Fc作为肝纤维化的标志物在制备肝纤维化的诊断产品中的应用。
目前，测定LMWK-Fc的方法主要是质谱和酶联免疫法(ELISA)。质谱价格昂贵，不利于大规模市场推广；ELISA法通常需要用手工对样本进行前处理，比较耗费人力和时间，同时其检测的灵敏度和线性范围也较低，主要用于实验室研究分析，在临床的检测应用上具有一定的局限性，远不能满足临床需求。目前市场上仍缺乏速度快、稳定性好、灵敏度高、特异性强的LMWK-Fc测定试剂，尤其是自动化检测试剂。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种诊断试剂盒及LMWK-Fc在制备肝纤维化诊断试剂中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一为提供一种诊断试剂盒，用于肝纤维化的诊断，所述诊断试剂盒包括包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液、酶结合物试剂、去除非特异反应的稀释液、化学发光底物液、以及核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液包括有包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒由抗低分子量激肽原抗体和磁微粒组成，所述去除非特异反应的稀释液包括有第一表面活性剂，所述酶结合物试剂包括有酶标记物，所述酶标记物由酶和标记物组成。
进一步地，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液、所述酶结合物试剂、所述去除非特异反应的稀释液与化学发光底物液的体积比1:2:4:4，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液的浓度含量为0.05mg/mL～10mg/mL。
进一步地，所述抗低分子量激肽原抗体与所述磁微粒的质量比为1:1000-1:10；所述抗低分子量激肽原抗体的类型选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任意一种。
进一步地，所述磁微粒选自羧基化磁微粒、链霉亲和素磁微粒或甲苯磺酰基磁微粒中的任意一种；所述磁微粒的粒径为0.5μm-5.0μM。
进一步地，所述酶选自碱性磷酸酶或辣根过氧物酶，所述标记物为凝集素，所述凝集素为特异性识别核心岩藻糖基化低分子量激肽原上的核心岩藻糖的凝集素；所述标记物与酶之间的质量比为2:1-1:4；所述化学发光底物液选自AMPPD、AMPPD衍生物、APS-5、鲁米诺、或鲁米诺衍生物中的任意一种。
进一步地，所述抗低分子量激肽原抗体包被的磁微粒混悬液、所述去除非特异反应的稀释液、所述酶结合物试剂还包括缓冲液、稳定剂。
更进一步地，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二盐-磷酸二氢盐液、吗啉乙磺酸、3-吗啉丙磺酸或3-(N-***啉)-2-羟基丙磺酸中的任意一种，所述缓冲液的pH值为6.5-7.5，所述缓冲液的浓度为0.1mmol/L-100mmol/L；
所述第一表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、CE510或CE210中的任意一种或多种；所述第一表面活性剂的浓度为0.1V/V％～2.0V/V％。
更进一步地，所述稳定剂选自离子螯合剂、糖类、无机盐、防腐剂、第二表面活性剂、或血清白蛋白中的任意一种或多种，其中，
所述离子螯合剂的浓度为0.2-50mmol/L，所述离子螯合剂选自EDTA、EDTA-2Na或EDTA-4Na中的任意一种或多种；
所述糖类的浓度为2W/V％～10W/V％，所述糖类选自海藻糖、蔗糖、果糖或乳糖中的任意一种或多种；
所述无机盐的浓度为0.9W/V％～50W/V％，所述无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化锌或硫酸铵中的任意一种或多种；
所述防腐剂的浓度为0.05W/V％～1.0W/V％，所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的任意一种或多种；
所述第二表面活性剂的浓度为0.1V/V％～2.0V/V％，所述第二表面活性剂选自CA-630、TERGITOLTM15-S-40或Tetronic 90R4中的任意一种或多种；
所述血清白蛋白的浓度为1W/V％～5W/V％，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白。
进一步地，核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品包括浓度为0-44％中任意多种浓度值的核心岩藻糖基化低分子量激肽原。
本发明的技术方案之二为提供一种核心岩藻糖基化低分子量激肽原在制备肝纤维化诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明试剂盒中包含包被有低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液、酶结合试剂、去除非特异性反应的稀释液。样本中的低分子量激肽原与低分子量激肽原单克隆抗体包被的磁珠粒结合，形成磁珠-抗体-抗原复合物，使用磁性分离器将磁珠进行分离并去除未和固相磁珠结合的成分。然后加入去除非特异性反应的稀释液，去除附着在磁珠表面的蛋白等干扰物，使用磁性分离器将磁珠进行分离并去除未和固相磁珠结合的成分。然后再加入酶结合物试剂，试剂中的凝集素可以特异地跟核心岩藻糖基化低分子量激肽原(LMWK-Fc)上的核心岩藻糖反应，形成磁珠-抗体-LMWK-Fc-凝集素-酶结合物，使用磁性分离器将磁珠进行分离并去除未和固相磁珠结合的成分。最后，加入化学发光底物，已与固相结合的碱性磷酸酶会促使底物发出光子，其发光强度与样本中核心岩藻糖基化低分子量激肽原水平成正比，可准确、灵敏、快速地测定样本中LMWK-Fc的浓度。
(2)本发明试剂盒独有的去除非特异性反应的稀释液，可以很好地清除非特异性吸附在磁珠表面的蛋白，试剂的特异性、准确度等性能明显提升。
(3)本发明试剂盒将核心岩藻糖基化低分子量激肽原作为肝纤维化的标志物并结合更为先进的化学发光免疫分析法，提高了肝纤维化诊断的灵敏度和特异性，提高肝纤维化诊断的准确性，更好地服务于临床诊断。
(4)本发明试剂盒能借助于全自动化学发光免疫分析仪运行，所有的样本和试剂加样都由仪器运行完成，降低人为因素对试验结果的干扰；同时也大幅度缩短了测试时间，得以更高效、快速地提供临床诊断结果。
(5)本发明试剂盒测定样本时，不需要对待测样本进行预处理，可直接进行检测，减少样本预处理带来的误差，也有利于低值样本的检测灵敏度；其中待测样本可为空白管、EDTA血浆管、肝素血浆、促凝剂血清管和分离胶血清管中的任意一种。
附图说明
图1为LMWK-Fc测定健康人群和肝纤维化人群的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
本实施例所制备得到的试剂盒能与来源于复星诊断的F-i3000系列化学发光测定仪配套使用，其中清洗液、底物液以及相应的清洗和发光读数步骤为测定仪的默认设定，其余步骤由人工设定程序，由测定仪处理完成。
实施例1：
根据RLU与核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品的浓度做出校准曲线，并依照该曲线，根据样本检测后得到的发光RLU计算样本中LMWK-Fc的浓度。
试剂盒包括包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液、酶结合物试剂、去除非特异反应的稀释液、化学发光底物液、以及核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品。
包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液(试剂R1)：由IgG2类型的抗低分子量激肽原抗体、羧基化磁微粒(直径为4.5μm)磁微粒、缓冲液(pH值为7.4)、稳定剂混悬8-24h得到，具体为浓度为0.1mg/mL的磁微粒、1μg/mL的IgG2类型的抗低分子量激肽原抗体、20mM缓冲液(Tris)、1W/V％BSA(牛血清白蛋白)、2mM离子螯合剂(EDTA-2Na)、1W/V％无机盐(氯化钠)、0.5V/V％第二表面活性剂(Tetronic 90R4)、0.5V/V％第二表面活性剂(TERGITOLTM15-S-40)、0.5W/V％糖类(海藻糖)和0.1W/V％防腐剂(叠氮钠)。
酶结合物试剂(试剂R2)：由酶标记物、缓冲液(pH值为6.7)、以及稳定剂在避光条件下反应8-24h得到，酶标记物由质量比为1:1的碱性磷酸酶和凝集素组成，酶标记物的浓度为250ng/mL，其余为20mM缓冲液(MES)、1W/V％BSA(牛血清白蛋白)、15W/V％无机盐(硫酸铵)、0.2W/V％无机盐(氯化锌)、0.5W/V％无机盐(氯化镁)、0.2V/V％表面活性剂(CA-630)、0.5V/V％第二表面活性剂(TERGITOLTM15-S-40)、0.5W/V％糖类(海藻糖)和0.1W/V％防腐剂(叠氮钠)。
去除非特异性反应的稀释液(试剂R3)：由缓冲液(pH值为8.0)、稳定剂、以及表面活性剂组成，具体为20mM缓冲液(Tris)、15W/V％无机盐(硫酸铵)、10W/V％无机盐(氯化钠)、0.1V/V％第二表面活性剂(Tetronic 90R4)、1.5V/V％第一表面活性剂(吐温-20)、0.1V/V％第一表面活性剂(CE510)。
校准曲线的制备：使用浓度为7％、66.2％两个浓度的核心岩藻糖基化低分子量激肽原样本，按照低浓度样本(7％)与高浓度样本(66.2％)体积比例6.76:93.24、16.89:83.11、33.78:66.22、62.5:37.5混合制备得到11％、17％、27％、44％的核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品(0、7％、11％、17％、27％、44％)进行线性分析，线性相关系数R＝0.9992，该试剂盒线性范围为0.1％-44％。
检测方法包括如下步骤：
(1)添加R1：设定程序，吸取25μL样本于反应杯中，并加入25μL试剂R1，于37℃孵育10min，使临床样本中的LMWK与包被于磁珠上的抗LMWK抗体结合，形成磁珠-抗体-抗原的免疫复合物，磁珠上包被的抗LMWK抗体被样本中的LMWK充分结合，随后执行清洗程序，洗去样本中未结合的LMWK和吸附的样本。
(2)添加R3：向反应杯中添加100μL R3试剂，于37℃孵育5min，吸附在磁珠表面的的蛋白完全从磁珠上洗脱下来，随后执行清洗程序，洗去未结合的样品；
(3)添加R2：向反应杯中添加50μL R2试剂，于37℃孵育10min，试剂R2中的凝集素-碱性磷酸酶与核心岩藻糖基化低分子量激肽原特异性结合，形成磁珠-抗体-LMWK-Fc-凝集素-碱性磷酸酶的免疫复合物，随后执行清洗程序，洗去未结合和吸附的样品。
(4)测定样品中的LMWK-Fc浓度：根据仪器预先设定好的发光程序，加入100μL化学发光底物(APS-5)，与磁珠结合的碱性磷酸酶会促使底物发出光子，其发光强度与样本中LMWK-Fc浓度成正比。
(5)给出结果：根据校准曲线，机器会自动计算出样本中LMWK-Fc浓度。
采集5例健康人群的血清样本、5例临床诊断为肝纤维化的血清样本，参照上述检测方法的步骤，设定测量程序，检测各个血清样本中LMWK-Fc发光值，如表1所示；
表1临床样品测定结果
由上表1可知，在反应体系中加入试剂R3后，临床样本的发光值下降约700-800万的信号值，试剂R3去除非特异性反应的作用明显；反应体系中含有R3试剂可以提高试剂的灵敏度，测定健康、病人样本发光值区分度明显提升。
采集80例健康人群的血清样本，80例临床诊断为肝纤维化的血清样本，参照实施例1中的步骤，设定测量程序，检测各个血清样本中的LMWK-Fc含量，如表2所示。
表2临床样本的测定结果
采用统计软件SPSS 25.0对本实施例试剂盒测得的肝纤维化样本和健康人群样本的LMWK-Fc含量用ROC曲线进行特异性和灵敏度分析，绘制ROC曲线，计算曲线下面积(AreaUnder the Curve，AUC)，结果如图1所示。从表2可以看出，LMWK-Fc在肝纤维化人群中的含量明显高于健康人群样本。从图1可以看出，LMWK-Fc试剂盒的曲线下面积(即LMWK-Fc对肝纤维化疾病的识别能力，数值越接近1性能越佳)达0.937(其中，渐进95％置信区间的下限为0.901，上限为0.972；标准错误为0.018，渐进显著性为0，其中，标准错误为按非参数假设，渐进显著性为按原假设:真区域＝0.5)。
实施例2：
测试检出限的标定：
用样本稀释液作为零值样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据0、7％两个校准品的浓度-RLU值进行两点回归拟合得出一次方程，将(M+2SD)的值带入上述方程，计算出相应浓度值，即为检出限，结果为0.1％，表明试剂的最低检出限性能良好，可以满足市场需求。
实施例3：
测试精密度方法如下：取11％、27％这两个核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品，每个浓度重复测试10次，重复性CV均小于3.0％，表明在此反应条件下，试剂的精密度良好，可以保证临床样本的准确度，满足市场需求。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种诊断试剂盒，用于肝纤维化的诊断，其特征在于，所述诊断试剂盒包括包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液、酶结合物试剂、去除非特异反应的稀释液、化学发光底物液、以及核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液包括有包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒由抗低分子量激肽原抗体和磁微粒组成，所述去除非特异反应的稀释液包括有第一表面活性剂，所述酶结合物试剂包括有酶标记物，所述酶标记物由酶和标记物组成。
2.根据权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液、所述酶结合物试剂、所述去除非特异反应的稀释液与化学发光底物液的体积比1:2:4:4，所述包被有抗低分子量激肽原抗体的磁微粒混悬液的浓度含量为0.05mg/mL～10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述抗低分子量激肽原抗体与所述磁微粒的质量比为1:1000-1:10；所述抗低分子量激肽原抗体的类型选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述磁微粒选自羧基化磁微粒、链霉亲和素磁微粒或甲苯磺酰基磁微粒中的任意一种；所述磁微粒的粒径为0.5μm-5.0μM。
5.根据权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述酶选自碱性磷酸酶或辣根过氧物酶，所述标记物为凝集素，所述凝集素为特异性识别核心岩藻糖基化低分子量激肽原上的核心岩藻糖的凝集素；所述标记物与酶之间的质量比为2:1-1:4；所述化学发光底物液选自AMPPD、AMPPD衍生物、APS-5、鲁米诺、或鲁米诺衍生物中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述抗低分子量激肽原抗体包被的磁微粒混悬液、所述去除非特异反应的稀释液、所述酶结合物试剂还包括缓冲液、稳定剂。
7.根据权利要求6所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二盐-磷酸二氢盐液、吗啉乙磺酸、3-吗啉丙磺酸或3-(N-***啉)-2-羟基丙磺酸中的任意一种，所述缓冲液的pH值为6.5-7.5，所述缓冲液的浓度为0.1mmol/L-100mmol/L；
所述第一表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、CE510或CE210中的任意一种或多种；所述第一表面活性剂的浓度为0.1V/V％～2.0V/V％。
8.根据权利要求6所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，所述稳定剂选自离子螯合剂、糖类、无机盐、防腐剂、第二表面活性剂、或血清白蛋白中的任意一种或多种，其中，
所述离子螯合剂的浓度为0.2-50mmol/L，所述离子螯合剂选自EDTA、EDTA-2Na或EDTA-4Na中的任意一种或多种；
所述糖类的浓度为2W/V％～10W/V％，所述糖类选自海藻糖、蔗糖、果糖或乳糖中的任意一种或多种；
所述无机盐的浓度为0.9W/V％～50W/V％，所述无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化锌或硫酸铵中的任意一种或多种；
所述防腐剂的浓度为0.05W/V％～1.0W/V％，所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin 300中的任意一种或多种；
所述第二表面活性剂的浓度为0.1V/V％～2.0V/V％，所述第二表面活性剂选自CA-630、TERGITOLTM15-S-40或Tetronic 90R4中的任意一种或多种；
所述血清白蛋白的浓度为1W/V％～5W/V％，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白。
9.根据权利要求1所述的一种诊断试剂盒，其特征在于，核心岩藻糖基化低分子量激肽原校准品包括浓度为0-44％中任意多种浓度值的核心岩藻糖基化低分子量激肽原。
10.核心岩藻糖基化低分子量激肽原在制备肝纤维化诊断试剂中的应用。
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