CN117074687A - 一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117074687A
CN117074687A CN202310826265.6A CN202310826265A CN117074687A CN 117074687 A CN117074687 A CN 117074687A CN 202310826265 A CN202310826265 A CN 202310826265A CN 117074687 A CN117074687 A CN 117074687A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ifn
gamma
autoantibody
kit
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310826265.6A
Other languages
English (en)
Inventor
叶枫
李征途
王浩如
邱晔
李少强
占扬清
王彦
黎远祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Institute Of Respiratory Health
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Original Assignee
Guangzhou Institute Of Respiratory Health
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Institute Of Respiratory Health, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University filed Critical Guangzhou Institute Of Respiratory Health
Priority to CN202310826265.6A priority Critical patent/CN117074687A/zh
Publication of CN117074687A publication Critical patent/CN117074687A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于检测抗IFN‑γ自身抗体的试剂盒及其应用，涉及生物技术和医学技术领域。该试剂盒包括标准品，标准品包括抗IFN‑γ自身抗体，抗IFN‑γ自身抗体由抗IFN‑γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本中分离得到。该试剂盒通过采用由抗IFN‑γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本中分离得到抗IFN‑γ自身抗体作为标准品，使标准品与待测样本中的抗IFN‑γ自身抗体高度同源，使检测结果更加准确、可靠，为早期干预提供判断依据。

Description

一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学技术领域，特别是涉及一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用。
背景技术
抗IFN-γ自身抗体综合征(AIGA)又称为成人起病免疫缺陷综合征，是由具有中和效应的抗IFN-γ自身抗体所引起的一种新发免疫缺陷病。IFN-γ在机体发挥防御胞内病原体的作用，极为重要；而抗IFN-γ自身抗体通过中和及阻断IFN-γ/IL-12轴，增加宿主对机会病原体的易感性。抗IFN-γ自身抗体综合征相关感染病原谱涉及41种病原体，其中以非结核分枝杆菌或马尔尼菲篮状菌合并或不合并其他机会性感染最为常见。其在马尔尼菲篮状菌、播散型非结核分枝杆菌及曲霉患者中阳性率均超过半数以上。同时，抗IFN-γ自身抗体是双重或多重感染的独立危险因素，也与播散感染密切相关，也可作为评估预后及是否复发感染的指标。
然而，目前检测及诊断抗IFN-γ自身抗体方法较少，已公布的检测方式仅有流式细胞术、Western Blot、ELISA三种方法，其中通过流式细胞术、Western Blot方法对抗IFN-γ自身抗体进行检测，比较繁琐且耗时较多。并且通过研究分析过往731例抗IFN-γ自身抗体综合征患者中，仅有50例患者提供确切检测数值，其中仅11例提供参考值。值得关注的是，所有检测中仅3例患者提供的检测结果为绝对定量，其余均为相对定量(比值比、OD值)或定性。同时，目前已有的可对抗IFN-γ自身抗体进行定量检测的试剂盒，基本都存在稳定性差、可重复性差、或在使用过程中时常出现标曲呈现情况较好但临床样品检测效果不佳的情况，且上述试剂盒的检测结果大多无确定的阳性界限值，只能用于检测抗IFN-γ自身抗体滴度较高的患者，而抗体滴度在临界值上下的患者容易误诊漏诊，各种检测方法检测结果差异较大，缺乏统一的标准，无法达到准确检测AIGA滴度的目的，从而无法早期干预达到较好治疗效果。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒，该试剂盒通过采用由抗IFN-γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本中分离得到抗IFN-γ自身抗体作为标准品，使标准品与待测样本中的抗IFN-γ自身抗体高度同源，使检测结果更加准确、可靠，为早期干预提供判断依据。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒，包括标准品，所述标准品包括抗IFN-γ自身抗体，所述抗IFN-γ自身抗体由抗IFN-γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本中分离得到。
本发明人在对抗IFN-γ自身抗体进行研究的过程中，发现目前市面上已有的试剂盒，之所以无法得到绝对定量的结果，并且出现稳定性差、可重复性差等问题，有部分原因和试剂盒中采用的标准品有关，目前已有试剂盒产品多采用重组抗IFN-γ自身抗体作为标准品，其与待测样本中的抗IFN-γ自身抗体同源性较低，因此，本发明人提出将由IFN-γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本中分离得到抗IFN-γ自身抗体作为标准品，进行曲线拟合，因上述标准品与待测样本中的抗IFN-γ自身抗体高度同源，且与包被在固相载体上的抗原之间的结合能力相似，故试剂盒的检测结果会更加准确、可靠，能够为早期干预提供判断依据。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括抗原，所述抗原为IFN-γ。
在其中一个实施例中，所述抗原固定于固相载体上。
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括：显色剂，洗涤剂，终止剂，所述标准品，和所述固相载体。
在其中一个实施例中，所述试剂盒的最低检出限水平为0.78ng/mL。
本发明人通过将实施例中制备得到的标准品进行不同程度的稀释后，对抗IFN-γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本和阴性样本进行检测，发现当浓度稀释为0.39ng/mL时，则不再能检出抗IFN-γ自身抗体，说明上述试剂盒的最低检出限水平为0.78ng/mL。同时，当上述试剂盒为ELISA检测试剂盒时，OD值不能超过4，当OD值大于4时，存在待测样本中抗IFN-γ自身抗体的实际浓度过大，酶标仪无法检测的可能性，则无法判断其实际浓度。
本发明还提供了一种非诊断目的的抗IFN-γ自身抗体的检测方法，采用所述试剂盒进行检测，该检测方法包括以下步骤：将待测样本和所述抗原混合，孵育，检测OD值，以所述标准品构建标准曲线，根据所述OD值、所述标准曲线，计算得到待测样本中抗IFN-γ自身抗体的滴度。
在其中一个实施例中，所述检测方法还包括：孵育后加入部分显色剂，孵育，加入洗涤剂进行洗涤，加入剩余显色剂，孵育，加入终止剂，检测OD值。
上述检测方法可用于检测待测样本中抗IFN-γ自身抗体的浓度水平，但抗IFN-γ自身抗体的浓度水平高并不代表其一定具有致病性，还要看抗IFN-γ自身抗体的浓度升高是否具有功能性，该功能性指待测样本中不仅存在IFN-γ自身抗体，且具有中和IFN-γ的活性，进而导致宿主免疫抑制。需要同时具有上述功能性，滴度水平升高才能作为疾病诊断的依据。因此，上述检测方法并不能直接得到提供待测样本的人员是否患病，需要结合其他手段方能得到疾病诊断结果。
本发明还提供了一种非诊断目的的抗IFN-γ自身抗体的检测方法，其特征在于，采用所述试剂盒进行检测，该检测方法包括以下步骤：将待测样本和所述抗原混合，孵育，检测OD值，以所述标准品构建标准曲线，根据所述OD值、所述标准曲线，计算得到待测样本中抗IFN-γ自身抗体的滴度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用，该试剂盒通过采用由抗IFN-γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本中分离得到抗IFN-γ自身抗体作为标准品，使标准品与待测样本中的抗IFN-γ自身抗体高度同源，使检测结果更加准确、可靠，对于抗体滴度在临界值上下的待测样本，也具有较高的灵敏度，能够为早期干预提供判断依据。
附图说明
图1为IFN-γ包被浓度为250ng/mL时的标准曲线拟合结果图；
图2为抗IFN-γ自身抗体综合征患者及健康对照的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
来源：
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
实施例
一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒。
一、抗IFN-γ自身抗体的分离提纯。
从患有抗IFN-γ自身抗体综合征的患者的体内，采用EDTA抗凝材料的采血管通过肘窝静脉采血的方式采集血液，经过离心得到血浆。
使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液浸没至琼脂糖凝胶颗粒过滤柱(Cytiva，Superdex200)，以300×g离心1min后，加入400μL上述离心得到的血浆，静置4min，以300×g离心1min后，收集离心收集液，得到上清液。
然后采用抗体亲和层析柱(Cytiva，HiTrap1ml)，装夹填料重组人干扰素γ(Cloud-Clone，1mg)，使用微量泵(Diener)以1.5mL/min泵入pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液10mL。使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液将上清液稀释至1mL，再通过微量泵以1.0mL/min泵入层析柱，静置7min，然后使用微量泵以1.5mL/min泵入pH为2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液，收集前3mL层析液。
再采用抗体亲和层析柱(Cytiva，Ab SpinTrap)，装夹填料Protein G SepharoseHigh Performance(Cytiva)，使用pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液充满层析柱，300×g离心1min以去除预装的体积百分比20％的乙醇溶液，重复上述充满缓冲液并离心的步骤1次。加入上述收集得到的层析液，摇晃混匀，静置4min，以100×g离心1min，除去离心液。然后再用一个新的离心液收集管，添加1M Tris-HCL，pH＝9.0的碱性缓冲液30μL，在层析柱中加入pH＝2.8，含有甘油和EDTA的Tris-HCl缓冲液，以50×g离心1min，得到初提物。
最后使用超滤管(50mL10kDa MWCO，PES，Sartorius)，添加上述初提物后，添加12mL pH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液，以4000×g离心25min，添加12mLpH＝7.4，渗透压在280-315mOsm/kg，不含钙、镁的磷酸缓冲液重复2次离心操作，得到含有抗IFN-γ自身抗体的蛋白液。
二、IFN-γ酶标板包被。
采用酶标板作为固相载体，将抗原IFN-γ固定于酶标板上，具体的包被方法如下所示。
1、孵育：使用包被液将IFN-γ稀释为浓度250ng/mL，每孔加入100μL，在4℃下避光孵育12-16小时；
2、洗涤：配制PBST(含质量百分比为0.05％吐温-20的PBS)，每孔加入350μL，洗涤3次，每次1分钟；
3、封闭：加入体积比为3％的胎牛血清进行封闭，每孔加入200μL，37℃孵育2小时；
4、洗涤：每孔加入350μL PBST进行洗涤，洗涤3次，每次1分钟，得到包被了IFN-γ的酶标板。
三、对本实施例步骤一得到的抗IFN-γ自身抗体进行浓度验证。
1、抗IFN-γ自身抗体稀释：将本实施例步骤一得到的抗IFN-γ自身抗体进行1：640、1：1280、1：2560、1：5120、1：10240、10；20480、1：40960倍比稀释。
2、购买原始浓度为200ng/mL的标准品(重组抗IFN-γ自身抗体)，进行梯度稀释，每孔加入标准品100μL，37℃孵育1小时；标准品的梯度稀释具体按照以下操作：每份标准品加入1.9mL PBS溶解10min后，进行梯度稀释，共7个梯度，则浓度分别为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、0ng/mL(最后一个梯度直接加入PBS)。
3、弃去液体，甩干，不用洗涤。
4、在本实施例中，显色剂包括显色液A和显色液B(即TMB显色溶液)。每孔加入显色液A100μL(临用前配制)，酶标板腹膜，37℃温育1小时。
5、弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1min，在吸水纸上轻拍酶标板(即本实施例步骤二制备得到的包被了IFN-γ的酶标板)，移除孔内所有液体，重复洗板5次。
6、每孔加入显色液B(即TMB显色溶液)100μL，酶标板覆膜，37℃孵育10-20min，至前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止。
7、每孔加入终止液50μL，轻轻晃动酶标板以确保溶液混合均匀。
8、在确保酶标板底无水滴及气泡后，立即使用酶标仪在450nm波长下，检测各孔的光密度OD值。
将上述步骤2中已知浓度的标准品(重组抗IFN-γ自身抗体)梯度稀释后，按照上述步骤3-8检测光密度OD值，得到不同稀释浓度的标准品的对应OD值，进行拟合，得到标准曲线。然后，将本实施例步骤一得到的抗IFN-γ自身抗体作为待测样品，按照上述步骤1梯度稀释，按照上述步骤3-8检测光密度OD值，进而计算得到抗IFN-γ自身抗体的原浓度。
结果如下表所示。
表1各孔的光密度OD值及其对应的原浓度
稀释倍数 原始OD值(Y值) 浓度(X值) 原浓度
1/640 2.491 216.2714 138413.7
1/1280 1.9975 155.0292 198437.3
1/2560 0.84 43.01509 110118.6
1/5120 0.499333 20.34428 104162.7
1/10240 0.346667 12.18933 124818.7
1/20480 0.286333 9.371964 191937.8
1/40960 0.260667 8.250502 90425.5
由上表可知，本实施例步骤一得到的抗IFN-γ自身抗体在1：640—1：40960倍比稀释下，可与包被的IFN-γ结合，且在不同稀释倍数下具有稳定性。上述Y值为酶标仪测量得到的OD值，X值为根据标准曲线方程计算得到的浓度，原浓度指根据本实施例中步骤一制备得到的抗IFN-γ自身抗体倍比稀释前的浓度。
四、确定酶标板包被IFN-γ的浓度。
1、IFN-γ包被。
将原浓度为500μg/mL的IFN-γ使用包被液稀释为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL，每孔加入100μL，使每孔含有100ng、50ng、25ng的IFN-γ，在4℃下避光孵育12-16小时。
洗涤：配制PBST(含质量百分比为0.05％吐温-20的PBS)，每孔加入350μL，洗涤3次，每次1分钟；
封闭：加入体积比为3％的胎牛血清进行封闭，每孔加入200μL，37℃孵育2小时；
洗涤：每孔加入350μL PBST进行洗涤，洗涤3次，每次1分钟，得到包被了IFN-γ的酶标板。
2、OD值检测。
标准品(重组抗IFN-γ自身抗体)稀释：将标准品进行1:1、1:2、1:4、1:16、1:32、1:64、1:128倍比稀释；将稀释后的标准品作为待测样品进行检测。
每孔加入标准品100μL，37℃孵育1小时；
弃去液体，甩干，不用洗涤；
每孔加入显色液A100μL(临用前配制)，酶标板覆膜，37℃温育1小时；
弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1分钟，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗版5次；
每孔加入显色液B(TMB显色溶液)100μL/孔，酶标板覆膜，37℃孵育10-20分钟，至前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止；
每孔加入终止液50μL，轻轻晃动酶标板以确保溶液混合均匀；
在确保酶标板底无水滴及气泡后，立即使用酶标仪在450nm波长检测各孔的光密度值。
3、计算。
常规计算方法为：各标准品及样品O.D.值扣除空白孔O.D.值后作图(七点图)，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标)，O.D.值为横坐标(或对数坐标)，绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算的R2值来定，以R2值越趋近于1为好)。可使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.30，根据样品O.D.值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与O.D.值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。在本实施例步骤四中，稀释后的标准品作为待测样品进行检测，因标准品为商售产品浓度已知，通过不同包被浓度的酶标板检测稀释后的标准品，然后和已知浓度对比，即能确定包被浓度。
4、结果分析。
表2 100ng、50ng、25ng IFN-γ包被酶标板测得不同稀释倍数标准品原始OD值
上表中，不同含量IFN-γ包被酶标板分别做3个复孔，进行平行试验。对上述数据进行标准曲线拟合后，不同IFN-γ包被浓度的拟合情况均较好，拟合情况根据四参数Logistic曲线拟合，方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D计算，其中，A＝5.12483,B＝-0.99063,C＝393.41893,D＝-0.00899,r^2＝0.99981，不同IFN-γ包被浓度的拟合情况均较好，其中IFN-γ浓度为250ng/mL的拟合情况如下表和图1所示，数据个数为8，残差平方和为0.00050。
表3 IFN-γ浓度为250ng/mL的拟合情况
五、通过临床样本验证将本实施例步骤一制备得到的抗IFN-γ自身抗体作为标准品进行ELISA检测的检测范围、检测的可靠性。
1、材料。
BIOFIT Elisa酶标板；Cloud-Clone IFNg；Abcam ELISA Coating Buffer 1X；Solarbio Elisa终止液；gibco PBS；Tween20；显色液A(Cloud-Clone检测溶液A)；显色液B(TMB ELISA Substrate(High Sensitivity))；Solarbio Elisa终止液；将本实施例步骤一制备得到的抗IFN-γ自身抗体作为标准品；将18名抗IFN-γ自身抗体综合征患者及18名健康人的血浆作为样品。上述抗IFN-γ自身抗体综合征患者的评判标准为：通过商售的ELISA试剂盒检测血清中抗IFN-γ自身抗体水平并且经医生判定具有感染症状、抗IFN-γ自身抗体具有中和活性的人员，则定义为抗IFN-γ自身抗体综合征患者。
在本实施例中，经过商售的ELISA试剂盒检测血清中抗IFN-γ自身抗体水平，抗IFN-γ自身抗体水平＞23747.776ng/mL，则判断具有较高的患病风险，再结合医生的临床诊断是否具有感染症状，以及体内抗IFN-γ自身抗体是否具有中和活性来判断提供待测样本的人员是否为抗IFN-γ自身抗体综合征患者。
该血浆的获得方法：从18名抗IFN-γ自身抗体综合征患者及健康人外肘静脉采血，使用EDTA抗凝管采集，然后在24小时内进行离心，获得患者血浆。
2、实验方法。
(1)IFN-γ包被：选择IFN-γ包被浓度为250ng/mL，采用本实施例步骤二的方法进行包被，得到包被IFN-γ的酶标板。
(2)样品检测。
标准品稀释：将本实施例步骤一制备得到的抗IFN-γ自身抗体标准品稀释为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL、0.20ng/mL、0.10ng/mL、0.05ng/mL。
样品稀释：将健康人血浆进行1：600倍，患者血浆进行1：1500倍稀释。剩余OD值检测和计算方法与本实施例的步骤四相同。
(3)数据分析。
数据下机后进行分析，结果如下表所示，当标准品浓度≤0.39ng/mL时，OD值对应的标准品浓度无显著差异，因此，无法测得更低浓度，故该检测方法的最低检出限水平为0.78ng/mL，在0.78ng/mL-200ng/mL的范围内具有较好的检测效果，且抗IFN-γ自身抗体综合征患者及健康对照的检测结果具有差异，如图2所示。
表4不同稀释浓度的标准品检测得到的OD值
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒，其特征在于，包括标准品，所述标准品包括抗IFN-γ自身抗体，所述抗IFN-γ自身抗体由抗IFN-γ自身抗体免疫缺陷疾病阳性样本中分离得到。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗原，所述抗原为IFN-γ。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原固定于固相载体上。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：显色剂，洗涤剂，终止剂，所述标准品，和所述固相载体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的最低检出限水平为0.78ng/mL。
6.一种抗IFN-γ自身抗体的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-5中任一项所述试剂盒进行检测，该检测方法包括以下步骤：将待测样本和所述抗原混合，孵育，检测OD值，以所述标准品构建标准曲线，根据所述OD值、所述标准曲线，计算得到待测样本中抗IFN-γ自身抗体的滴度。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：孵育后加入部分显色剂，孵育，加入洗涤剂进行洗涤，加入剩余显色剂，孵育，加入终止剂，检测OD值。
CN202310826265.6A 2023-07-06 2023-07-06 一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用 Pending CN117074687A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310826265.6A CN117074687A (zh) 2023-07-06 2023-07-06 一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310826265.6A CN117074687A (zh) 2023-07-06 2023-07-06 一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117074687A true CN117074687A (zh) 2023-11-17

Family

ID=88712283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310826265.6A Pending CN117074687A (zh) 2023-07-06 2023-07-06 一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117074687A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101929999A (zh) * 2009-06-19 2010-12-29 上海科新生物技术股份有限公司 一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒
CN103869086A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种血清自身抗体检测试剂盒
CN105092855A (zh) * 2014-05-23 2015-11-25 杭州普望生物技术有限公司 一种用于肝纤维化和肝硬化检测的试剂盒
CN109030836A (zh) * 2018-10-25 2018-12-18 苏州大学附属儿童医院 食物蛋白特异性IgA抗体检测ELISA试剂盒及其应用
CN115651065A (zh) * 2022-12-09 2023-01-31 杭州普望生物技术有限公司 一种用于肝纤维化和肝硬化检测的试剂盒
CN115932278A (zh) * 2022-12-08 2023-04-07 广西医科大学第一附属医院 一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101929999A (zh) * 2009-06-19 2010-12-29 上海科新生物技术股份有限公司 一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒
CN103869086A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种血清自身抗体检测试剂盒
CN105092855A (zh) * 2014-05-23 2015-11-25 杭州普望生物技术有限公司 一种用于肝纤维化和肝硬化检测的试剂盒
CN109030836A (zh) * 2018-10-25 2018-12-18 苏州大学附属儿童医院 食物蛋白特异性IgA抗体检测ELISA试剂盒及其应用
CN115932278A (zh) * 2022-12-08 2023-04-07 广西医科大学第一附属医院 一种抗γ干扰素自身抗体的检测方法
CN115651065A (zh) * 2022-12-09 2023-01-31 杭州普望生物技术有限公司 一种用于肝纤维化和肝硬化检测的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E.VIANI 等: ""Purification of natural human IFN-γ antibodies"", IMMUNOL LETT, vol. 30, no. 1, pages 53, XP023691575, DOI: 10.1016/0165-2478(91)90089-S *
SARAH K. BROWNE等: "Adult-onset immunodeficiency in Thailand and Taiwan", N ENGL J MED., vol. 367, no. 8, 23 August 2012 (2012-08-23), pages 4 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101377492B (zh) 胱抑素c测定试剂盒
Whicher et al. New international reference preparation for proteins in human serum (RPPHS)
JP3551678B2 (ja) ヘモグロビンＡ１ｃの測定法及びキット
CN109596843B (zh) 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂盒
CN101699287B (zh) 匀相溶胶颗粒型胱抑素c测定试剂盒及其制备方法
CN112409462B (zh) 一种SARS-CoV-2特异性抗原和SARS-COV-2免疫球蛋白的检测试剂盒
JP5789520B2 (ja) ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析方法
CA1340973C (en) Immunometric assay kit and method applicable to whole cells
CN114034872A (zh) 用于阿尔茨海默症早期诊断的试剂盒及其应用
CN109324181B (zh) 一种免疫层析用封闭剂组合物、用途、及免疫层析试剂盒的制备方法
CN108627653B (zh) 用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒
CN110716050A (zh) 抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法
CN112194719A (zh) Crt抗原和mage-a1抗原的制备及其应用
CN117074687A (zh) 一种用于检测抗IFN-γ自身抗体的试剂盒及其应用
WO2024001044A1 (zh) 一种与肺癌相关的生物标志物组合、含其的试剂盒及其用途
CN115353566A (zh) 用于检测白细胞介素1-β的抗体组合及其应用
CN110850096B (zh) 生物标记物组及其应用和蛋白芯片、蛋白芯片试剂盒和elisa试剂盒
CN111650381B (zh) 蛋白标志物或其组合在制备急性乳腺炎诊断试剂盒上的应用
CN111596068B (zh) Utrophin在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品
JPH0580053A (ja) ヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法
CN111239403B (zh) 一种β2微球蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒及应用
Purnamawaty et al. Determination of reactive HBsAg cut-off that need confirmatory test
JP3032891B2 (ja) 遊離ヘモグロビン測定用試薬キット及びそれを用いる遊離ヘモグロビンの測定法
CN108431604B (zh) 用于确定免疫抑制患者中体液应答的方法
Martinez et al. Preliminary clinical studies of C-reactive protein quantified by enzyme-linked immunoassay.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination