CN117063943A - 芽孢杆菌w25在提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良中的应用 - Google Patents

芽孢杆菌w25在提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种芽孢杆菌W25在提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良中的应用,属于农业微生物应用技术领域,芽孢杆菌W25于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.20042,其具有在盐环境下促进植物生长的作用,同时可对盐渍化土壤进行改良,提高盐渍化土地的利用率和产能,进而提高作物产量。

Description

芽孢杆菌W25在提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良中的应用
技术领域
本发明涉及农业微生物应用技术领域,具体是芽孢杆菌W25在提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良中的应用。
背景技术
我国土壤盐渍化地区广泛,目前,由于长期灌溉不当、排水不良、气候干旱等因素,造成了土壤肥力降低、农作物减产和生态破坏等问题;盐碱土面积的进一步扩大,严重影响农业生产的发展和粮食安全。
γ-PGA(Poly-γ-Glutamic acid,γ-聚谷氨酸)是由芽孢杆菌利用D-谷氨酸和/或L-谷氨酸通过α-氨基与γ-羧基之间形成的γ-酰胺键聚合形成的无毒无害的高分子聚合物;γ-PGA在农业上有着广泛的应用,如作为植物农药增效剂,其可抑制害虫和病原体的生长;作为保护剂,其可在植物表面形成一层保护膜,提高植物抗旱、抗盐的性能;作为土壤修复剂,利用其丰富的羧基官能团吸附金属离子等。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)W25菌株记载于专利“CN111718870 A”中,其具有产γ-PGA的能力并可降低作物中Cd(镉)的含量、增加植物的Vc含量、增加植物可溶性蛋白的含量、增加土壤微生物丰度、增加土脲酶活性等多种功能。
为了解决我国土壤盐渍化问题,微生物菌剂具有环境友好、投入低、操作简便等优势,利用微生物提高植物耐盐能力和改善土壤质量,提高盐渍化土地利用率和产能,符合现代生态农业和农业可持续发展的要求;为寻找更多能够提高植物耐盐能力和改良盐渍化土壤的微生物菌剂,本发明拟以上述解淀粉芽孢杆菌W25(以下简称为“芽孢杆菌W25”)为试验对象,研究其在农作物生产领域中更广泛的应用。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了芽孢杆菌W25在提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良中的应用,其可以促进盐环境中植物的生长,并可以对盐渍化土壤进行改良。
本发明技术方案如下:
芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)W25在提高植物耐盐性中的应用,所述芽孢杆菌W25于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.20042。
优选的,芽孢杆菌W25用于降低盐环境中植物的Na+含量,提高Ca+、K+含量。
优选的,芽孢杆菌W25用于提高盐环境中植物的IAA、SOD、POD、脯氨酸、Vc、可溶性糖和可溶性蛋白的含量。
优选的,芽孢杆菌W25用于降低盐环境中植物的MDA含量。
所述芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)W25在盐渍化土壤改良中的应用。
优选的,芽孢杆菌W25用于降低盐渍化土壤的速效钠含量,提高盐渍化土壤中γ-PGA、速效磷、速效钾的含量。
优选的,芽孢杆菌W25用于促进盐渍土壤中有益环境因子的产生,降低盐渍化土壤的电导率;其中,所述有益环境因子包括有机质、有机碳、NO3-N、NH4-N等。
优选的,芽孢杆菌W25用于提高盐渍化土壤中微生物多样性和微生物丰度。
优选的,芽孢杆菌W25用于促进盐渍化土壤中微生物的增殖。
优选的,芽孢杆菌W25用于促进盐渍化土壤中假单胞菌属(Pseudomonas)的增殖。
优选的,应用方法是将芽孢杆菌W25制备成菌剂,施加在氯化钠浓度≤300mM的盐环境中,施加量是1~2Kg/亩。
优选的,所述菌剂的制备方法为:将活菌数≥108个/mL的芽孢杆菌W25菌液干燥,得菌剂。
有益效果:
本发明提供了芽孢杆菌W25在提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良中的应用,其可以促进盐环境中植物的生长,并可以对盐渍化土壤进行改良,有效避免农作物在盐环境中的减产问题,提高盐渍化土地的利用率和产能。
附图说明
图1为盐环境和非盐环境下接种W25菌剂培养液中的细胞数(以OD600表示)、pH值和γ-PGA浓度变化;图中:各柱上不同字母代表处理间达到5%显著水平(LSD-test,P<0.05);
图2为盐环境和非盐环境下接种W25菌剂培养液中的K+和Na+浓度变化柱状图以及盐环境下γ-PGA对K+和Na+的吸附量变化折线图;图中:不同字母代表处理间达到5%显著水平(LSD-test,P<0.05);
图3为盐环境和非盐环境下接种W25菌剂对生菜根和叶片中Na/K比值(A图和B图)、Na/Ca比值(C图和D图)、IAA含量(I图和J图)以及对叶片中MDA含量(E图)、脯氨酸含量(F图)、POD活性(G图)、SOD活性(H图)的影响;图中:各柱上不同字母代表处理间达到5%显著水平(LSD-test,P<0.05);
图4为接种W25菌剂对生菜根际土壤微生物群落Alpha多样性的影响;图中:各柱上不同字母代表处理间达到5%显著水平(LSD-test,P<0.05);
图5为接种W25菌剂对生菜根际土壤微生物群落Beta多样性的影响;
图6为接种W25菌剂后土壤中的细菌和真菌分别在门水平、属水平的相对丰度;
图7为生菜干重、土壤理化性质和前20个优势细菌及真菌相对丰度相关性的RDA和spearman相关热图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明:
实验材料来源:
ELISA试剂盒:货号JM-110029P1、JM-09865P2、JM-01183P2、JM-01185P2、JM-06093402,均购自江苏京美生物公司;
FastDNA SPIN试剂盒:货号116560-200,购自安倍医疗器械贸易公司;
电感耦合等离子体发射光谱仪:型号ICP-OES,Optima 2100DV,购自珀金埃尔默仪器有限公司;
Olsen分光光度计:型号ICO-2600,购自中国上海仪器公司;
基本分析仪:型号Flash EA 1112,购自赛默飞世尔科技公司;
分光光度计:型号NanoDrop 1000,购自赛默飞世尔科技公司;
以下实施例中所使用的芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)W25于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.20042。
实施例1
芽孢杆菌W25菌剂的制备:
将W25菌株斜面接种于固体培养基上,30℃培养3d;然后选取饱满、粘稠的W25菌落接种于液体培养基,32℃、180rpm振荡培养20h;将发酵液转移至无菌离心瓶中,5000rpm离心5min,弃上清,收集菌体;用无菌去离子水洗涤菌体并重新悬浮制得菌悬液,使得菌悬液中的活菌数达到108个/mL,将菌悬液干燥制成芽孢杆菌W25菌剂;
其中,所述固体培养基包括如下组分:蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO42.0g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、琼脂20g/L、余量水;
其中,所述液体培养基包括如下组分:蔗糖10.0g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、Na2HPO42.0g/L、KCl 0.191g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、余量水。
实施例2
芽孢杆菌W25菌剂对盐渍土壤滤液中γ-PGA含量和Na+和K+浓度的影响:
(1)将3kg土壤加入9L去离子水,180rpm振荡48h,6000rpm离心15min,收集上清液;将上清液通过微孔滤膜(0.45μm孔径)过滤,灭菌,然后与无菌基本发酵培养基按体积比2:1的比例混合均匀,得混合液;其中,所述无菌基本发酵培养基的组分如下:牛肉膏3.0g,蛋白胨5.0g,葡萄糖10.0g,蒸馏水1.0L,pH7.0。
(2)取200mL步骤(1)中的混合液加入到三角瓶中,并向混合液中添加5g的NaCl作为实验组,使NaCl的终浓度是25g/L,设置3组平行;以不添加NaCl的混合液作为对照组;
(3)分别向步骤(2)中的实验组和对照组中接种实施例1所制备的芽孢杆菌W25菌剂,接种量为0.2g,得培养液;将培养液置于32℃、180rpm条件下培养,分别在0h、48h、96h、144h、192h、240h取样,测定样本中的细胞数(OD600)、pH、γ-PGA含量以及Na+和K+含量;
其中,γ-PGA含量的检测方法参照Wei Zeng等在文章中记载的方法,详见《Anintegrated high-throughput strategy for rapid screening of poly(γ-glutamicacid)-producing bacteria.Appl Microbiol Biotechnol(2013)97:2163–2172》;Na+和K+含量的检测方法为:通过电感耦合等离子体发射光谱仪测定Na+和K+的浓度。
检测结果如图1~2所示:
由图1中的A图可得,接种W25菌剂后的第2天,培养液中的pH有显著升高,但随着培养时间的增加,pH升高幅度较小,且实验组和对照组中的pH值无显著差异;接种W25菌剂后培养液中的OD600持续升高,且在第4天开始趋于平稳,且实验组和对照组中的pH值无显著差异;
由图1中的B图可得,随着培养时间的增加,接种W25菌剂后培养液中的γ-pga含量显著提高,并在第六天达到最大峰值;并且可以看出,在高浓度(2.5%)盐胁迫下的实验组γ-pga浓度始终高于对照组;
由图2可得,随着培养时间的增加,接种W25菌剂后2~6天内培养液中的K+含量显著上升,实验组培养液中的Na+含量显著下降;且与对照组相比,在高浓度(2.5%)盐胁迫条件下的实验组中,W25菌剂能够显著提高培养液中的K+含量,并降低Na+含量。
实施例3
芽孢杆菌W25菌剂在盐环境下生菜种植中的应用:
将W25菌剂应用于生菜盆栽实验,具体方法如下:
花盆中装2.5kg土壤,然后分别加入不同剂量的NaCl,使得各花盆土壤中Na+的终浓度分别为0mM/L、100mM/L、200mM/L和300mM/L,每组设置3个重复,然后将NaCl与土壤充分混合后平衡30天;在花盆中播种饱满的、表面灭菌的生菜种子,发芽后间苗至10株/盆;将W25菌剂用无菌去离子水稀释至1×108个/mL,得W25菌剂的菌悬液,在生菜第三叶期,在根部周围挖沟(1~2cm深),在沟中加入W25菌剂的菌悬液,加液量为50mL/盆,以加入相同剂量的无菌去离子水作为对照组;将盆栽于温室(温度10~22℃,相对湿度30~45%,光照正常)培养45天;培养结束后,采集每盆生菜的根、地上部分(生菜叶)以及根际土进行后续分析;
使用0.01M乙二胺四乙酸钠(EDTA-2Na)和蒸馏水依次清洗生菜根和可食用组织,并将其分为两部分:一部分在105℃条件下失活30min,60℃干燥至恒重,并称重,将干燥的生菜根和可食用组织研磨并消解以测定其中Na、K、Ca的含量;另一部分采用ELISA试剂盒(货号分别为JM-110029P1、JM-09865P2、JM-01183P2、JM-01185P2)分别测定新鲜叶片中的Vc(维生素C)含量、可溶性糖(葡萄糖,果糖,麦芽糖,蔗糖)含量、可溶性蛋白含量、MDA(丙二醛)含量、脯氨酸(proline)含量、SOD(超氧化物歧化酶)活性和POD(过氧化物酶)活性,并测定根和叶片中的IAA(吲哚乙酸)含量;其中,采用2,6-二氯苯酚滴定法(AOAC)测定叶片中的Vc含量,用硫酸-蒽基法比色法(620nm)测定叶片中的可溶性糖含量,在酸性条件下显色反应后用分光光度法(520nm)测定叶片中的脯氨酸含量;
测定结果分别如表1和图3所示:
表1.生菜根和叶片干重及叶片中的Vc、可溶性糖和可溶性蛋白含量
由表1可知,在盐环境和非盐环境下,根和叶片中生物量(干重)均出现增长,可见W25菌剂均可以促进生菜的生长;在100mM、200mM盐胁迫条件下,相比于对照组,接种W25菌剂后能明显提高生菜叶片中的Vc、可溶性蛋白和可溶性糖含量;在高浓度盐胁迫(300mM)条件下,尽管生菜的生长受到了抑制,但相比于对照组,接种W25菌剂后的生菜根部干重显著增加了30.0%,叶片干重增加了59.5%;
由图3中的A~D图可知,当土壤盐浓度为100mM、200mM、300mM时,生菜根和叶片中的Na/K与Na/Ca均出现升高;但与对照组相比,在盐环境下接种W25菌剂后的生菜根和叶片中Na/K与Na/Ca显著降低,这说明接种W25菌剂后在一定程度上减少了盐环境中生菜组织中Na+的含量,提高Ca+、K+含量;
由图3中的E~J图可知,与无盐对照组相比:在200mM和300mM盐浓度条件下接种W25菌剂后显著减少了生菜叶片中的MDA含量,在100mM、200mM和300mM盐浓度条件下接种W25菌剂后显著提高了生菜叶片中的脯氨酸和POD含量,在100mM、200mM盐浓度条件下显著提高了生菜叶片中的SOD含量,在100mM、200mM和300mM盐浓度条件下,生菜叶片和根部的IAA含量出现缓慢降低,但接种W25菌剂后的生菜叶片和根部IAA含量仍高于对照组;以上检测结果在一定程度上反应了芽孢杆菌W25能够有效提高盐环境中生菜的抗氧化能力,减少了叶片中过氧化物质的产生,提高生菜品质。
实施例4
芽孢杆菌W25菌剂对盐渍土壤中酶活性等相关理化性质的影响:
采集实施例3生菜盆栽中的根际土,测定土壤中的脲酶活性、磷酸酶活性、DTPA-5Na(二乙烯三胺五乙酸五钠)含量、pH值(测定pH值时水土体积比为2.5:1),以及测定土壤中NO3-N(硝态氮)、NH4-N(铵态氮)、ANa(Ex-Na,速效钠)、AP(速效磷)和AK(速效钾)的含量;
其中,脲酶活性、磷酸酶活性、DTPA-Na含量的测定方法详见文章《Soil SciCh.Acad,1980;S.Guan等,1986》;
Na、K、P含量测定:采用重铬酸钾硫酸钾氧化法,用1.0M乙酸铵(NH4OAc,pH7.0)测定ANa和AK含量,利用Olsen分光光度计通过ICP-OES法测定AP含量;
NH4-N和NO3-N含量测定:新鲜土壤样品用2M氯化钾溶液(土壤:氯化钾=1:5)提取,用基本分析仪测定NH4-N和NO3-N含量;
IAA含量测定:采用ELISA试剂盒测定,方法同实施例3;
测定结果如下表2所示:
表2.根际土壤酶活性等土壤相关理化性质的检测
由表2可得,相比于对照组,接种W25菌剂可显著提高盐渍土壤中的脲酶活性(提高24~37%)和磷酸酶活性(提高33~59%),且IAA含量显著提高了7~9%,这也与实施例3中生菜组织中的IAA降低情况相呼应;
另外,相比于对照组,接种W25菌剂可显著降低盐渍土壤中速效钠的含量,使土壤中的有机质含量(OM)显著提高4.0~9.1%,阳离子交换量(CEC)显著提高12.1~21.0%,有机碳含量(ESP)显著降低38.1~41.9%,NO3-N、AP和AK含量分别显著提高23.7~26.1%、29.7~49.3%和16.8~37.6%,土壤EC值(电导率)显著降低12.6~19.2%,这表明芽孢杆菌W25可以促进土壤中有益环境因子的产生,且对维持盐渍化土壤中较低的EC值有积极作用,从而降低盐渍化土壤的电导率;土壤电导率是测定土壤水溶性盐的指标,而土壤水溶性盐是表层土壤中可被植物迅速利用的矿质营养的一个重要指标,是判定土壤中盐类离子是否限制作物生长的因素,正常的土壤EC值能够避免植物因高盐环境受到损伤或造成植株根系的死亡。
实施例5:
芽孢杆菌W25菌剂对盐渍土壤中微生物多样性的影响:
使用FastDNA SPIN试剂盒从0.5g实施例3中的新鲜盐渍根际土壤和未加NaCl的对照组土壤中分别提取总DNA,并分别用分光光度计和凝胶电泳法测定总DNA的数量和质量;
将提取得到的总DNA利用细菌通用引物338F和806R进行PCR扩增,其靶向为细菌16s rRNA的V4区,高通量测序在Illumina Hiseq 2000(Illumina Inc.,美国,圣地亚哥)完成;其中,338F的引物序列为:5'-ACTCCTAGGGGGCAGCA-3';806R的引物序列为:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3';
具体检测结果分别如图4~7所示:
图4为接种W25菌剂对生菜根际土壤细菌(A图和B图)和真菌(C图和D图)微生物群落Alpha多样性的影响,可以看出,与对照组相比,在盐环境和非盐环境下,接种W25菌剂均能明显提高细菌的香农指数和辛普森指数;由其中的A图和B图可得,在100mM(S1)、200mM(S2)、300mM(S3)盐浓度条件下,接种W25菌剂相比于对照组能明显提高细菌的香农指数和辛普森指数;由其中的C图和D图可得,在200mM(S2)、300mM(S3)盐浓度条件下,接种W25菌剂相比于对照组能明显提高真菌的香农指数和辛普森指数。
图5为接种W25菌剂对生菜根际土壤微生物群落Beta多样性的影响,基于Bray-Curtis距离相似性的属级细菌(A图)和真菌(B图)群落组成的非度量多维尺度(NMDS)排序;可以看出,在细菌水平上,接种W25菌剂后的生菜根际土壤环境中细菌群落与对照组之间具有显著差异性,这在一定程度上反应了芽孢杆菌W25处理对盐渍化土壤微生物群落结构的改变,且这种改变在不同盐浓度处理中具有趋同性。
图6为细菌(A图)和真菌(B图)在门水平的相对丰度以及细菌(C图)和真菌(D图)在属水平的相对丰度;由其中的A图可以看出,细菌中的Actinobacteria、Proteobacteria和Acidobacteria为优势菌门,占到总细菌群落的70%以上;由其中的B图可以看出,真菌中的Ascomycota为优势菌门;由其中的C图可以看出,在100mM、200mM和300mM盐浓度条件下,相比于对照组,接种W25菌剂后土壤中的假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)的相对丰度均有了不同程度的提高,其中W25菌剂对假单胞菌属(Pseudomonas)的增殖效果尤其显著;由其中的D图可以看出,W25菌剂的添加明显降低了所有样本中镰刀菌(Fusarium)和头孢菌(Cephalosporins)的相对丰度,这两种菌在土壤环境中的丰度与土壤霉菌污染程度呈正相关。
图7为生菜干重、土壤理化性质与前20个优势细菌(A图和C图)及真菌(B图和D图)相对丰度相关性的RDA和spearman相关热图;由A、B图可以看出,未接种W25菌剂的对照组根际土壤样本与EC、NH4 +-N、Ex-Na、ESP等呈正相关,相反,接种W25菌剂后的根际土壤样本与NO3 --N、IAA、AP、AK、CEC、OM、磷酸酶(phosphatase)和脲酶(urease)呈正相关,RDA还表明,生菜干重与土壤AP、AK、OM、CEC、磷酸酶、脲酶、IAA和NO3-N呈正相关,但与土壤Ex-Na(速效钠)和ESP呈负相关;此外,由C、D图可以看出,植物生物量与假单胞菌属、酵母菌科、节杆菌属呈正相关,但与镰刀菌属、头孢菌属和青霉属等真菌丰度呈负相关;图7进一步验证了上述实施例2~4中的实验结果。
综上,本发明发现了芽孢杆菌W25可以应用于提高植物耐盐性和盐渍化土壤改良,有效避免农作物在盐环境中的减产问题,提高盐渍化土地的利用率和产能。

Claims (10)

1.芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)W25在提高植物耐盐性中的应用,所述芽孢杆菌W25于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.20042。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述芽孢杆菌W25用于降低盐环境中植物的Na+含量,提高Ca+、K+含量。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述芽孢杆菌W25用于提高盐环境中植物的IAA、SOD、POD、脯氨酸、Vc、可溶性糖和可溶性蛋白的含量,降低盐环境中植物的MDA含量。
4.权利要求1所述芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)W25在盐渍化土壤改良中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述芽孢杆菌W25用于降低盐渍化土壤的速效钠含量,提高盐渍化土壤中γ-PGA、速效磷、速效钾的含量。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述芽孢杆菌W25用于促进盐渍土壤中有益环境因子的产生,降低盐渍化土壤的电导率;其中,所述有益环境因子包括有机质、有机碳、NO3-N、NH4-N。
7.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述芽孢杆菌W25用于提高盐渍化土壤中微生物多样性和微生物丰度。
8.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述芽孢杆菌W25用于促进盐渍化土壤中假单胞菌属的增殖。
9.如权利要求4所述的应用,其特征在于,应用方法是将芽孢杆菌W25制备成菌剂,施加在氯化钠浓度≤300mM的盐环境中,施加量是1~2Kg/亩。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述菌剂的制备方法为:将活菌数≥108个/mL的芽孢杆菌W25菌液干燥,得菌剂。
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