CN117018176A - 狂犬病疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种狂犬病疫苗组合物，包括狂犬病疫苗抗原、双糖和人血白蛋白。本公开还提供了一种狂犬病疫苗制剂。本公开涉及的剂型为冻干剂或水针剂，该疫苗组合物处方简单，易得，利于狂犬疫苗工艺放大及生产，且处方中不含动物血清，不会对免疫的机体产生不良影响，安全性更高，本稳定剂制成成品后，通过稳定性研究，制品能够保证狂犬疫苗良好的稳定性。

Description

狂犬病疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本公开涉及生产技术领域，特别是利用Vero细胞生产用于预防人类狂犬病的狂犬病疫苗组合物及其制备方法和应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒感染所致的急性、病毒性传染病，临床表现为恐水、恐声、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。狂犬病疫苗是目前预防狂犬病发生唯一有效的药品。临床使用狂犬疫苗时大部分是用于暴露后的免疫，因此要求疫苗在人体中产生较快的免疫应答反应、较低的不良反应，以保障患者安全及用药顺应性。

目前上市销售的狂犬疫苗主要有三类：经动物脑组织培养的灭活疫苗、经鸭胚培养的灭活疫苗和经细胞(人二倍体细胞、鸡胚细胞、地鼠肾原代细胞和Vero传代细胞)培养的灭活疫苗。其中Vero传代细胞是1980年代由法国Merieux研究所率先研究使用生产狂犬病疫苗，其后WHO制定传代细胞生产狂犬病疫苗的规程。20世纪80年代末我国开始进行人用精制Vero细胞培养狂犬病疫苗研制，并于90年代末得到批准生产。目前用于生产人用的传代细胞多为Vero细胞系，Vero细胞系它是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的公认安全的细胞系。

狂犬疫苗一般采用肌肉注射给药，通常有水针剂和冻干粉针剂，因抗原多为蛋白或多糖类物质，疫苗保护剂处方对其稳定性和效价有着巨大的影响。在生物制品中，辅料成分不可再被单纯看做无活性的物质。

而目前上市的狂犬病疫苗的质量良莠不齐，主要为疫苗效稳定性差，不良反应较多，目前也有文献报道关于狂犬疫苗保护剂成分的研究，但存在冻干前后效价损失较大的问题，冻干保护剂未达到良好的保护作用。

因此，亟需开发一种组成简单、保护效力强、安全性高、副作用少的狂犬病疫苗制剂。

发明内容

本公开的目的在于提供一种组成简单、保护效力强、安全性高、副作用少的人用狂犬病疫苗(Vero细胞)组合物，适用于冻干剂或水针剂，以提高制剂稳定性，降低冻干前后疫苗抗原及效价损失。

为此，在第一方面，提供了一种狂犬病疫苗组合物，该组合物包括狂犬病疫苗抗原、双糖和人血白蛋白。

本文中，双糖也称二糖，由二分子的单糖通过糖苷键形成。在一些实施方式中，所述双糖包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖或乳糖中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述双糖包括麦芽糖或者麦芽糖与第二双糖的组合。在一些实施方式中，所述第二双糖选自蔗糖、海藻糖或乳糖中的一种或多种。

本公开的发明人发现，采用双糖和人血白蛋白作为疫苗稳定剂能够提高疫苗制剂稳定性，并且降低冻干前后疫苗抗原及效价损失。进一步发现，采用含有麦芽糖的双糖将进一步提高疫苗制剂的效价和稳定性，特别是麦芽糖的效价保护效果优于其他双糖。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，双糖的含量为3-8％(w/v)，例如为3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中双糖的含量为4-6％(w/v)。本公开的发明人发现，将双糖的含量控制在上述范围内有利于疫苗溶液制剂的稳定性和冻干制剂的热稳定性和冻干前后效价损失率。

在一些具体实施方式中，所述双糖包括麦芽糖和海藻糖。在另一些具体实施方式中，所述双糖包括麦芽糖和蔗糖。在又一些具体实施方式中，所述双糖包括海藻糖和蔗糖。

在一些实施方式中，所述双糖包括麦芽糖和第二双糖，所述麦芽糖和所述第二双糖的含量比为1：(0.1-10)，例如为1：0.1、1：0.4、1：0.8、1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：4、1：6、1：8、1：10或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述双糖中，所述麦芽糖和所述第二双糖的含量比为1：(0.4-4)，更优选为1：(1-2.5)。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，麦芽糖的含量为1-6％(w/v)，例如为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)或它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，人血白蛋白的含量≤5％(w/v)。在一些优选实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，人血白蛋白的含量≤4％(w/v)。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，人血白蛋白的含量为1-5％(w/v)，例如为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，人血白蛋白的含量为1-4％(w/v)。本公开的发明人发现，将人血白蛋白的含量控制在上述范围内有利于疫苗制剂的稳定性和效价。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，狂犬病疫苗抗原的浓度为8-20IU/mL，例如为8IU/mL、10IU/mL、12IU/mL、14IU/mL、16IU/mL、18IU/mL或它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗抗原为Vero细胞狂犬病疫苗抗原。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物还包括缓冲液。在一些实施方式中，所述缓冲液包括组氨酸溶液、甘氨酸溶液、Tris溶液、枸橼酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液中的一种或多种在一些实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。优选地，所述缓冲液为pH为7.4-7.8的磷酸盐缓冲液。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗组合物中，所述缓冲液的浓度为5-25mM，例如可以为5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或它们之间的任意值。

在一些实施方式中，每100mL所述狂犬病疫苗组合物包括如下组分或由如下组分组成：狂犬病疫苗抗原浓度8-20IU/mL，双糖3-8％(w/v)，人血白蛋白1-5％(w/v)，缓冲液5-25mM，以及余量水。

在一些实施方式中，每100mL所述狂犬病疫苗组合物包括如下组分或由如下组分组成：狂犬病疫苗抗原浓度8-20IU/mL，双糖4-6％(w/v)，人血白蛋白1-4％(w/v)，缓冲液5-25mM，以及余量水。

本公开的疫苗组合物中以双糖和人血白蛋白作为疫苗稳定剂，该稳定剂处方简单，易得，利于狂犬疫苗工艺放大及生产，且处方中不含动物血清，不会对免疫的机体产生不良影响，安全性更高，本稳定剂制成成品后，通过稳定性研究，制品能够保证狂犬疫苗良好的稳定性。

在第二方面，提供了第一方面所述的狂犬病疫苗组合物在制备狂犬病疫苗制剂中的应用。

在一些实施方式中，所述狂犬病疫苗制剂的剂型为冻干剂或溶液剂(水针剂)。

在第三方面，提供了一种狂犬病疫苗制剂的制备方法，其包括将含有所述狂犬病疫苗组合物的疫苗半成品进行冷冻干燥。

在一些实施方式中，所述冷冻干燥包括在温度为-25℃至-30℃、真空度为0.1-0.2mbar的条件下进行升华干燥。在一些实施方式中，所述升华干燥的时间为20-30h。在一些具体实施方式中，所述冷冻干燥包括在温度为-28℃，真空度为0.15mbar的条件下升华干燥25h。

在一些实施方式中，所述冷冻干燥处理包括依次进行地预冻、预抽真空、一次干燥(升华干燥)和解析干燥。

在一些实施方式中，所述预冻的温度为-55℃至-45℃(例如可以是-55℃、-54℃、-53℃、-52℃、-51℃、-50℃、-49℃、-48℃、-47℃、-46℃、-45℃等)，时间为3.5-4.5h(例如可以是3.5h、3.6h、3.7h、3.8h、3.9h、4h、4.1h、4.2h、4.3h、4.4h、4.5h等)。

在一些实施方式中，所述预抽真空后的真空度为0.05-0.15mbar(例如可以是0.05mbar、0.06mbar、0.07mbar、0.08mbar、0.09mbar、0.1mbar、0.11mbar、0.12mbar、0.13mbar、0.14mbar、0.15mbar等)。

在一些实施方式中，所述一次干燥(升华干燥)的温度为-25℃至-30℃(例如可以是-25℃、-26℃、-27℃、-28℃、-29℃、-30℃等)，时间为20-30h(例如可以是20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h等)，真空度为0.1-0.2mbar(例如可以是0.1mbar、0.11mbar、0.12mbar、0.13mbar、0.14mbar、0.15mbar、0.16mbar、0.17mbar、0.18mbar、0.19mbar、0.2mbar等)。

在一些实施方式中，所述解析干燥包括第一解析干燥和第二解析干燥，所述第一解析干燥的温度为0℃至10℃(例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃等)，时间为5-10h(例如可以是5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、9.5h、10h等)；所述第二解析干燥的温度为20℃至30℃(例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，时间为4-8h(例如可以是4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h等)。

本公开的有益效果是：

(1)保护剂组方简单，便于放大生产，无致敏性成分，降低副反应和潜在安全性风险。

(2)保护剂有良好的溶液剂和冻干保护效果，冻干前后效价损失较小，且均具有良好的制剂稳定性。

(3)采用本公开制备的冻干狂犬病疫苗外观较好，复溶时间在30s之内，便于临床使用。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本公开进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开，并不用于构成对本公开的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

实施例1双糖比例对疫苗稳定性影响

1)按照以下表1的配方配制疫苗半成品，调节pH为7.4-7.8，进行溶液剂分装及冻干，检测冻干稳定性及溶液稳定性效果：

以下实施例中狂犬病疫苗原液均为灭活的狂犬病毒Vero细胞原液系用狂犬病毒固定毒(Pitman-Moore株，简称PM株)接种于Vero细胞，经培养、收获、浓缩、灭活病毒、纯化后，加入稳定剂制成。

2)狂犬病疫苗溶液剂制备

将上述半成品分装入2mL中硼硅西林瓶，0.5mL/瓶，压塞、轧盖得狂犬病疫苗溶液剂。

3)狂犬病疫苗冻干剂制备

(1)冻干机清洗、灭菌：用注射用水将冻干机内腔清洗一次，然后通入纯蒸汽121℃灭菌30min，干燥冷却到室温。

(2)分装、进箱：将配制的疫苗半成品分装入2mL中硼硅西林瓶，1.0mL/瓶，并半压瓶塞，西林瓶放置于冻干机板层上，进箱结束后，关闭箱门，启动冻干程序。

(3)预冻：设置在1h内快速降温至在-50℃，-50℃中预冻4h，真空控制0bar。

(4)预抽真空：开启真空泵，-45℃预抽真空至0.1mbar。

(5)一次干燥：调节设置板层温度，调节设置板层温度，控制板层温度-28℃，真空度维持0.15mbar，保温25h。

(6)解析干燥：调节设置板层温度，隔板温度在1h内快速升温至5℃，真空度为0.1mbar，维持8h；然后将隔板温度升温至25℃，真空度为0mbar，保温6h。冻干完成后降低板层真空压紧瓶塞，出箱轧盖封口，获得狂犬病疫苗。

4)疫苗的质量评价

(1)疫苗半成品检测：半成品检测pH值、抗原含量、效价；

(2)疫苗冻干成品检测：参照《中国药典》2020版中“冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)”标准，其检验项目包括外观、水分、抗原含量、效价、异常毒性检查、热稳定性试验。同时测定各冻干保护剂处方成品的复溶时间，评价制剂成品的性质。

pH测定：按《中国药典》2020年版三部通则0631法测定；

抗原含量测定：按《中国药典》2020年版三部通则3429法测定；

效价测定：按《中国药典》2020年版三部通则3503法测定；

冻干水分：按《中国药典》2020年版三部通则0832法测定；

热稳定试验：将疫苗放置在37±2℃的恒温箱中储存0天、28天，到期后采用NIH小鼠体内免疫法进行效价测定，其效价不低于2.5IU/剂剂量为合格；

长期稳定性试验：将疫苗放置在4±2℃的药品保存箱中储存，于0个月、3个月、6个月、12个月和18个月取出，采用NIH小鼠体内免疫法进行效价测定。

疫苗溶液剂及冻干剂的质量标准检测结果及具体试验数据见表2。其中疫苗半成品和冻干后的成品均进行抗原含量和效价的测定，计算冻干过程中的疫苗活性的损失率。

表2的实验结果显示：人血白蛋白含量固定在3％，双糖含量在3％-8％之间时，溶液剂和冻干剂均较稳定，麦芽糖的效价保护效果优于其他双糖，而当双糖含量超过8％时，冻干剂样品外观较差，样品产生一定塌陷，冻干前后效价稳定性较差。

实施例2人血白蛋白比例对疫苗稳定性影响

1)实施例处方信息

按照以下表3的配方配制疫苗半成品，检测其冻干稳定性及溶液稳定性效果：

表3.制剂处方

2)狂犬病疫苗溶液剂制备

将上述半成品分装入2mL中硼硅西林瓶，0.5mL/瓶，压塞、轧盖得狂犬病疫苗溶液剂。

3)狂犬病疫苗冻干剂制备

疫苗冻干剂制备如实施例1。

4)疫苗的质量评价

狂犬病疫苗的质量评价如实施例1。

疫苗溶液剂及冻干剂的质量标准检测结果及具体试验数据见表4。

表4.实施例2检测结果

注：“/”表示未检测

表4的实验数据显示人血白蛋白含量与疫苗的稳定性呈正比关系，人血白蛋白含量越高，制剂越稳定，且人血白蛋白含量低于2％时，冻干外观较差，样品产生塌陷，冻干前后效价稳定性较差。此外，人血白蛋白单独使用对溶液剂保护效力较好，而对冻干剂效力保护稍差，主要原因为处方中无双糖保护剂，固含量较低。

实施例3

1)实施例3处方信息

按照以下表5的配方配制疫苗半成品，检测其冻干稳定性及溶液稳定性效果：

表5.实施例3制剂处方

2)狂犬病疫苗溶液剂制备

将上述半成品分装入2mL中硼硅西林瓶，0.5mL/瓶，压塞、轧盖得狂犬病疫苗溶液剂。

3)狂犬病疫苗冻干剂制备

疫苗冻干剂制备如实施例1。

4)疫苗的质量评价

狂犬病疫苗的质量评价如实施例1。

疫苗溶液剂及冻干剂的质量标准检测结果及具体试验数据见表6。

表6.实施例3检测结果

表6的实验数据显示人血白蛋白含量为2％，麦芽糖含量在2％、6％、10％时，溶液剂疫苗稳定，麦芽糖对狂犬疫苗稳定性有一定积极影响。冻干疫苗的外观与热稳定性与麦芽糖含量相关，人血白蛋白含量2％，麦芽糖含量6％时，冻干外观良好，冻干前后效价损失率较低。

实施例4

1)实施例4处方信息

按照以下表7的配方配制疫苗半成品，检测其冻干稳定性及溶液稳定性效果：

表7.制剂处方

2)狂犬病疫苗溶液剂制备

将上述半成品分装入2mL中硼硅西林瓶，0.5mL/瓶，压塞、轧盖得狂犬病疫苗溶液剂。

3)狂犬病疫苗冻干剂制备

疫苗冻干剂制备如实施例1。

4)疫苗的质量评价

狂犬病疫苗的质量评价如实施例1。

疫苗溶液剂及冻干剂的质量标准检测结果及具体试验数据见表8。

表8.实施例4实验结果

通过与实施例1和实施例4的实验结果对比可知，处方中不含麦芽糖的溶液剂与冻干剂的效价稳定性均不如含有麦芽糖的溶液剂与冻干剂。

本公开的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本公开的技术方案做出的技术变形，均落入本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种狂犬病疫苗组合物，包括狂犬病疫苗抗原、双糖和人血白蛋白。

2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗组合物，其特征在于，所述双糖包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖或乳糖中的一种或多种，

优选地，所述双糖包括麦芽糖或者麦芽糖与第二双糖的组合，

更优选地，所述第二双糖选自蔗糖、海藻糖或乳糖中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的狂犬病疫苗组合物，其特征在于，所述狂犬病疫苗组合物中，双糖的含量为3-8％(w/v)，优选为4-6％(w/v)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的狂犬病疫苗组合物，其特征在于，所述狂犬病疫苗组合物中，人血白蛋白的含量≤5％(w/v)，优选为≤4％(w/v)，

优选地，所述狂犬病疫苗组合物中，人血白蛋白的含量为1-5％(w/v)，优选为1-4％(w/v)；

优选地，所述狂犬病疫苗组合物中，狂犬病疫苗抗原的浓度为8-20IU/mL。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的狂犬病疫苗组合物，其特征在于，所述狂犬病疫苗组合物还包括缓冲液，

优选地，所述缓冲液包括组氨酸溶液、甘氨酸溶液、Tris溶液、枸橼酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液中的一种或多种，优选为磷酸盐缓冲液，进一步优选为pH为7.4-7.8的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的狂犬病疫苗组合物，其特征在于，所述狂犬病疫苗抗原为Vero细胞狂犬病疫苗抗原。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的狂犬病疫苗组合物，其特征在于，每100mL所述狂犬病疫苗组合物包括如下组分或由如下组分组成：

狂犬病疫苗抗原浓度8-20IU/mL，

双糖3-8％(w/v)，优选4-6％(w/v)，

人血白蛋白1-5％(w/v)，优选1-4％(w/v)，

缓冲液5-25mM，以及

余量水。

8.权利要求1-7中任一项所述的狂犬病疫苗组合物在制备狂犬病疫苗制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述狂犬病疫苗制剂的剂型为冻干剂或水针剂。

10.一种狂犬病疫苗冻干制剂的制备方法，其包括将含有权利要求1-7中任一项所述的狂犬病疫苗组合物的疫苗半成品进行冷冻干燥，

优选地，所述冷冻干燥包括在温度为-30至-25℃、真空度为0.1-0.2mbar的条件下进行升华干燥，

更优选地，所述升华干燥的时间为20-30h。