CN117004609A - 抑制TGFβ基因表达的siRNA、装载siRNA的纳米粒子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，主要涉及抑制TGFβ基因表达的siRNA及装载抑制TGFβ基因表达的siRNA的纳米粒子和在抗肿瘤治疗方面的用途。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种siRNA。该siRNA能高效地抑制TGFβ表达，并进一步抑制肿瘤增殖。本发明提供的TGFβsiRNA能高效抑制TGFβ基因的表达，mRNA水平可下调70％以上，蛋白表达的抑制率达到90％，同时所述的TGFβsiRNA能有效抑制肿瘤细增殖。且本发明的DP7‑C/si TGFβ复合物能有效治疗结肠癌等肿瘤，具有很好的应用前景。

Description

抑制TGFβ基因表达的siRNA、装载siRNA的纳米粒子及其用途
技术领域
本发明属于基因治疗领域，主要涉及抑制TGFβ基因表达的siRNA药物以及递送抑制TGFβ基因表达的siRNA的纳米粒子。
背景技术
在过去的几十年中，癌症研究主要集中在恶性细胞和相关基因调控上，而最近，肿瘤微环境(TME)的概念已被广泛接受。肿瘤与其微环境之间的动态相互作用被认为对致癌作用具有显著影响，同时也很大程度影响了肿瘤发生发展的进程以及。除肿瘤细胞外，TME还由多种非恶性细胞组成，如成纤维细胞、间充质干细胞、血淋巴内皮细胞和大量浸润性白细胞。
近年来，越来越多的研究显示，肿瘤细胞处于一种免疫耐受状态，除了PD-L1、CTLA-4免疫检查点外，转化生长因子-β(Transforming growth factorβ,TGFβ)也是一个促进肿瘤耐受的基因。TGFβ是免疫稳态和免疫耐受的重要促进因子，抑制免疫***多种成分的扩张和功能。在肿瘤微环境中，TGFβ对免疫抑制也起着重要作用，能调节许多类型免疫细胞的产生和功能。它通过直接促进Treg细胞的扩张，抑制效应T细胞和抗原递呈树突状细胞(DC细胞)的产生和功能，控制适应性免疫。特别是当肿瘤发生到后期，很多肿瘤细胞已经对TGFβ的作用产生了一定耐受。而大多数肿瘤细胞都会通过自分泌或旁分泌产生TGFβ，导致肿瘤组织中的TGFβ浓度高过生理水平。这时TGFβ往往会促使肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤的浸润和转移，参与肿瘤免疫逃逸，以及促进血管的生产发挥促癌作用。因此，TGFβ有作为肿瘤治疗靶点的潜力。
小核酸药物通过反义原理靶向RNA可使特定疾病基因沉默，达到治疗目的，作为一种治疗策略，具有高特异性、高效性、长效性等优势，大大扩展了可用于治疗的靶点的数量和类型，而高效的递送***是小核酸药物研发和运用的关键。目前，小核酸药物在实际应用过程中也效果往往不及预期，向患者注射小核酸药物后，药物如何在体内存留足够长的时间，如何让治疗性的小核酸精准进入靶向细胞发挥治疗功能，并最大程度的避免误伤正常细胞等方面还面临很大的挑战。小核酸药物效果不及预期还可能是由于以下方面的差异：(1)siRNA靶点选择及序列设计的挑战，如特异性、有效浓度、沉默效率、脱靶效应等；(2)药物输送方式(路径、载体、频率、效率)；(3)肿瘤细胞内的药物的区域化分布；(4)癌症进展阶段；(5)患者免疫***的能力区别；(6)获得性耐药。肿瘤异质性、肿瘤微环境的变化、药物失活、肿瘤细胞药物吸收减少或药物释放增加、肿瘤细胞存活途径的激活和表观遗传变化等等方面也都有可能影响小核酸药物的使用情况。此外，小核酸药物尤其是RNAi药物到达作用位点需要穿过胞膜作用于胞浆或核内的mRNA，递送难度大，尽管化学修饰能够一定程度解决稳定性和免疫原性的问题，但如果不能进入细胞实现胞吞，小核酸药物依然不能发挥药物作用。DP7多肽(VQWRIRVAVIRK)是用计算机辅助设计新型抗菌肽的筛选方法，通过对模板抗菌肽HH2替换了2个氨基酸得到的具有更高的细菌识别特异性与更强的抗菌活性的抗菌肽。抗菌肽纳米化可以使其获得较好稳定性及减少毒性，这为抗菌肽的应用提供一个新研究方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为小核酸抗肿瘤药物提供一种新的有效选择。
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种抑制TGFβ基因表达的siRNA。该siRNA的序列如下：
正义链(SEQ ID No.1):5’-CGGACUACUAUGCUAAAGATT-3’
反义链(SEQ ID No.2):5’-UCUUUAGCAUAGUAGUCCGTT-3’。
本发明还提供了上述抑制TGF-β基因表达的siRNA在制备抗肿瘤药物中的用途。进一步的，所述的肿瘤为黑色素瘤或者结肠癌。
本发明还提供了一种装载了上述的siRNA的纳米粒子。该纳米粒子是由疏水化修饰的多肽装载上述的抑制TGFβ基因表达的siRNA制备而成；所述多肽的序列为VQWRIRVAVIRK，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段。
其中，上述装载siRNA的纳米粒子中所述的多肽VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.3)碳端酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
其中，上述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG或PEG衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为C6-C20中的至少一种。
其中，上述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的PEG衍生物为1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。
其中，上述多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-CO-OH与多肽上的-NH2酰胺化反应生成。优选的，所述疏水化修饰的多肽结构为：
所述的多肽结构中所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG衍生物
进一步的，上述多肽结构中的R为：
中的至少一种。
其中，上述装载siRNA的纳米粒子中所述的疏水化修饰多肽和小核酸按质量比3～6︰1作为原料制备而成。优选的，上述疏水化修饰多肽和小核酸按质量比为5︰1。
进一步的，上述装载siRNA的纳米粒子是由疏水化修饰多肽与siRNA共孵育制得。
其中，上述装载siRNA的纳米粒子是由疏水化修饰多肽与siRNA在水中或液态培养基中共孵育5～15min而得。所述液态培养基为RPMI 1640、DMEM双无培养基或Optim培养基中的至少一种。
具体的，本发明方法包括以下步骤：
a、称取适量DP7-C粉末，加入灭菌水溶解，自发形成胶束
b、将TGFβ靶点基因的siRNA按照质量比为(DP7-C:siRNA或ASO＝3:1～5:1)室温孵育15-20min，即得到DP7-C/siRNA复合物。
本发明还提供了上述的抑制TGFβ基因表达的siRNA或上述的装载siRNA的纳米粒子在制备***的药物中的应用。
进一步的，所述的肿瘤为肺癌、肝癌、***癌、膀胱癌、黑色素瘤或者结肠癌中的至少一种。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，是由上述的抑制TGFβ基因表达的siRNA或上述的装载siRNA的纳米粒子添加药学上可接受的成分制备而成。进一步的上述药物还可以含有药学上可以接受的辅助性成分。
其中，上述的***的药物为原位瘤内注射治疗药物。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一个效果很好的，针对TGFβ基因的siRNA分子。本发明TGFβsiRNA能高效抑制TGFβ基因的表达，mRNA水平显著下调，可达70％以上，蛋白表达得到明显抑制，抑制率可达到90％，有显著的抑制肿瘤的功能。本发明还进一步地使用了抗菌肽衍生物DP7-C作为siRNA递送载体。本发明还针对TGFβ基因提供了基于DP7-C的小核酸递送***，原位递送TGFβsiRNA可以用于原位皮下瘤等肿瘤的治疗。本发明涉及到的DP7-C胶束除了高效的siRNA传输能力，其在体内外均表现出较高的安全性，是良好的基因传输载体。本发明为小核酸药物用于肿瘤治疗的新药研发提供了一种新的选择。
附图说明
图1：TGFβ是肿瘤免疫治疗的候选靶点：A.免疫组化染色TGFβ在结肠肠癌及黑色素瘤中的表达结果；B.临床数据库分析TGFβ对肿瘤中免疫细胞浸润程度的相关性。
图2：qPCR筛选敲减效率高的TGFβsiRNA。
图3：DP7-C/siTGFβ复合物在CT26细胞中的干扰效果及促进肿瘤细胞凋亡的检测：A.TGFβ的RNA表达检测结果；B.TGFβ的蛋白表达检测结果；C.DP7-C/siTGFβ刺激DC细胞成熟的流式检测；D.CT26细胞迁移光镜图；E.平板克隆实验的白光拍照及统计结果
图4：DP7-C/siTGFβ复合物用于CT26小鼠皮下瘤的治疗：A.肿瘤原位递送siRNA药物后，各组肿瘤拍照结果；B.各组肿瘤体积统计结果；C.各组肿瘤重量统计结果；D.效应性T细胞流式统计结果。
图5：DP7-C/siTGFβ复合纳米粒抗肿瘤机制研究：A.肿瘤组织中凋亡细胞荧光拍照结果；B.肿瘤组织中KI67组化结果；C.肿瘤组织中CD31组化结果。
图6：重要脏器HE染色结果。
具体实施方式
转化生长因子-β(TGF-β)是一个促进肿瘤耐受的基因。TGFβ是免疫稳态和免疫耐受的重要促进因子，抑制免疫***多种成分的扩张和功能。在肿瘤微环境中，TGFβ对免疫抑制也起着重要作用，能调节许多类型免疫细胞的产生和功能。我们认为肿瘤细胞的TGFβ基因可以作为一个潜在靶点。
本发明通过前期的大量工作，设计并筛选出一个效果很好的，针对TGFβ基因(TGFβ1)的siRNA分子，经过大量的前期优选，获得了一个具有高效沉默效率的TGFβsiRNA序列:
正义链:5’-GCAACAUGUUGGUCAUUAUTT-3’
反义链:5’-AUAAUGACCAACAUGUUGCTT-3’。
发明TGFβsiRNA能高效抑制TGFβ基因的表达，使其mRNA水平显著下调，蛋白表达得到明显抑制，有显著的抑制肿瘤的功能。
由于小核酸药物后药物如何在体内存留足够长的时间，如何让治疗性的小核酸精准进入靶向细胞发挥治疗功能，并最大程度的避免误伤正常细胞等方面还面临很大的挑战。因此，需要为此siRNA搭配适当的递送***，以保证其发挥自身的作用。
为此，本发明进一步地使用了抗菌肽衍生物DP7-C作为本发明针对TGFβ基因的siRNA分子的递送***，制得了新的纳米药物。DP7-C制备简单，在水溶液中能自组装成纳米胶束，在水溶液中呈正电，有较好的单分散性和Zeta电位，冻干再溶解也很稳定。
所述DP7-C的多肽结构为：
其中的R为：
基于该DP7-C递送***，递送靶向巨噬细胞的TGFβsiRNA可用于实体瘤的治疗。这些实体瘤的种类包括肺癌、肝癌、***癌、膀胱癌、黑色素瘤或者结肠癌等种。
本发明涉及到的DP7-C胶束除了高效的siRNA传输能力，其在体内外也均表现出较高的安全性。在本发明的实例中，装载有本发明TGFβsiRNA的DP7-C胶束，成功实现对肿瘤细胞的高效siRNA***性地导入，并有效抑制多种肿瘤模型的生长，得到一种新型的TGFβsiRNA药物。
以下将结合附图和实施例详细说明本发明，应当说明的是，实施例是对本发明的技术方案的进一步说明，并不表明本发明仅限于这些实施例。
本发明实施例使用的主要试剂：
(1)小干扰RNA:siRNA(上海吉玛公司合成)。
(2)丁二酰化胆固醇修饰的抗菌肽DP7(DP7-C)为自行合成。
(3)TGFβ抗体(ab179695，abcam)
(4)TUNEL检测试剂盒(A113-01，诺维赞)
本发明实施例所涉及到的细胞系和实验动物：
(1)小鼠黑色素瘤细胞系B16F10,购买于ATCC。
(2)小鼠结肠癌细胞系CT26,购买于ATCC。
(3)C57BL/6J雌鼠，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1TGFβ表达量与多种免疫细胞浸润程度呈高度相关性
我们收集结直肠癌和黑色素瘤病人的肿瘤标本，用4％甲醛固定48小时后包埋切片，并进行TGFβ靶点的组化染色。结果如图1A所示，TGFβ在结直肠癌和黑色素瘤病人中高表达，表明其可作为肿瘤免疫治疗的敲减靶点。通过后继的生物信息学((http://timer.cistrome.org/))分析，还发现TGFβ的表达量与多种免疫细胞浸润程度呈高度相关性(图1B)。表明其可作为多种肿瘤免疫治疗的敲减靶点。
实施例2抑制TGFβ的siRNA筛选
趋化因子受体TGFβ存在于免疫细胞表面，能引导免疫细胞到达炎症和肿瘤部位，表达TGFβ的癌细胞会产生免疫抑制的微环境。本发明推断治疗性阻断TGFβ信号可以抑制炎症细胞聚集、浸润，从而逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态并且激活抗肿瘤CD8+T细胞应答。
本发明中针对TGFβ基因，通过设计和筛选得到的靶向抑制TGFβ基因的siRNA(siTGFβ)，以期得到具有很好抑制和抗肿瘤效果的siTGFβ。
在实验前期，我们通过软件设计并前期优选后，选出并合成了三条针对TGFβ基因的siRNA。首先，分别将合成的靶向TGFβ基因的三条siRNA与DP7-C形成DP7-C/siTGFβ复合物。
按照前期实验得到的siTGFβ与DP7-C C的优选配比，将siTGFβ用DEPC水溶解为1μg/μl,吸取2μg siTGFβ于200μl培养基中混匀，再加入10μg DP7-C，室温孵育10分钟后轻轻加入细胞中。通过细胞转染及qPCR实验比较，我们选出了敲减效率最高的siRNA 2进行后续体内体外抗肿瘤实验(图2)。siRNA2的序列如下：
正义链:5’-CGGACUACUAUGCUAAAGATT-3’
反义链:5’-UCUUUAGCAUAGUAGUCCGTT-3’。
我们进一步验证了优选的siRNA 2(后继实验中标为siTGFβ)对TGFβmRNA和蛋白的敲减效率，结果如图3A和3B所示，DP7-C/siTGFβ处理组显著下调了CT26细胞中TGFβ基因的mRNA表达水平(图3A)和蛋白表达水平(图3B)。
实施例3DP7-C/siTGFβ复合物的功能试验
TGFβ是免疫稳态和免疫耐受的重要促进因子，抑制免疫***多种成分的功能。在肿瘤微环境中，TGFβ对免疫抑制也起着重要作用，能调节许多类型免疫细胞的产生和功能。TGFβ能调控癌细胞的增殖、分化、凋亡、上皮-间充质转化和转移，抑制效应T细胞和抗原递呈树突状细胞(DC细胞)的产生和功能，控制适应性免疫。因此对TGFβ进行干预为癌症患者提供了一种可行的治疗途径。因此，本项目中我们靶向TGFβ基因，进一步验证DP7-C/siTGFβ复合纳米粒的有效性。
1、促进DC细胞成熟实验
提取小鼠骨髓来源的树突细胞，加入20ng/mL的细胞因子rmGM-CSF诱导骨髓细胞向DC方向分化。培养至第6天时，将siTGFβ用DEPC水溶解为1μg/μl,吸取2μg si-TGFβ于200μl培养基中混匀，再加入10μg DP7-C，室温孵育10分钟后轻轻加入DC细胞中。同时设立未处理组、DP7-C/siScramble组。48小时后收集DC，用CD11c、CD80、CD86流式抗体标记检测各组成熟DC比例。结果显示DP7-C/siTGFβ能有效促进DC细胞成熟(图3C)
2、抑制肿瘤细胞增殖和迁移实验
将DP7-C(10ug)/siTGFβ(2ug)在室温孵育10分钟后轻轻加入CT26细胞中。48小时后，消化细胞，将2×105个CT26细胞加入Transwell小室，孔板下室加入600μl含15％FBS的培养基。常规培养24h后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，4％甲醛固定30分钟，将小室适当风干。用0.1％结晶紫染色30-60min，用PBS洗3遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。40倍显微镜下随机计数五个视野。结果显示DP7-C/siTGFβ能有效抑制肿瘤细胞迁移(图3D)。
将生长状态良好的CT26细胞按照1×103个/孔接种于6孔板中，培养过夜。次日，将培养基更换为新鲜的双有培养基，实验设置空白对照组(Untreated组)载体递送无关siRNA组(DP7-C/siScramble组,10ug/2ug)和载体递送siTGFβ组(DP7-C/siTGFβ组,10ug/2ug)共3个组。将上述分组试剂加入到CT26细胞中，连续培养2周。然后，弃去上清液，用PBS小心漂洗。每孔加入适量4％多聚甲醛固定液固定细胞10分钟左右。弃固定液，加入结晶紫染液染色10-15分钟，用流动的水缓慢小心冲洗去染液，在空气中晾干拍照。结果显示DP7-C/siTGFβ能有效抑制肿瘤细胞增殖(图3E)。
实施例4原位注射DP7-C/siTGFβ复合物治疗CT26小鼠结肠癌皮下瘤模型
将6-8周龄左右的C57BL/6J雌鼠经过检疫一周后饲养于SPF实验动物房中，在肿瘤细胞接种前一天观察小鼠状态，并将右大腿根部的毛发剔除干净。收集常规培养的CT26肿瘤细胞并计数，无血清的DMEM基础培养基重悬细胞使得细胞浓度为1×106个/mL。于SPF动物房中超净台内进行小鼠右大腿根部皮下接种，每只100μl肿瘤细胞悬液(1×105个细胞/只)，小鼠接种完毕后随机分为2组，并做好分组标记。
接种第二天开始每天观察小鼠状态及肿瘤生长情况。待小鼠皮下瘤长至40mm3时，将优选的siTGFβ用DEPC水溶解为1ug/ul,吸取12ug siTGFβ与60μg DP7-C混合，室温孵育10分钟后，加入DEPC水定容至100ul。在瘤内原位注射DP7-C/siTGFβ(60ug/12ug)复合物后。每隔三天注射一次并在注射前记录肿瘤体积。给药六次后，观察到显著地抑制了CT26皮下瘤生长的效果。结果如图4所示，跟其他两组相比，小鼠经DP7-C/siTGFβ处理后显著抑制了结直肠癌的生长(n＝5每组，图4A)。与NS组2011.802±780.364mm3,DP7-C/siScramble1745.234±530.769mm3相比，DP7-C/siTGFβ治疗组肿瘤体积显著降低至690.451±326.260mm3(图4B)。此外，同时，跟NS组7.370±3.32g DP7-C/siScramble组4.178±0.73相比，DP7-C/siTGFβ治疗组肿瘤重量显著降低至2.776±0.344g(图4C)。
治疗结束后，检测了各组小鼠肿瘤中CD8+T的比例。结果如图4D所示，DP7-C/siTGFβ治疗后CD8+的T细胞比例明显提高，这表明沉默TGFβ表达后增强了抗肿瘤免疫反应。
此外，TUNEL法检测肿瘤组织切片上结果显示，与其他两组相比，DP7-C/siTGFβ处理组的肿瘤组织中显示出强烈的凋亡信号(图5A)。KI67和CD31免疫组化结果显示DP7-C/siTGFβ处理组的肿瘤组织中肿瘤细胞增殖减弱，血管生成减弱(图5B-C)。
总的来说，这些结果表明DP7-C多肽纳米载体能够显著抑制皮下瘤的增殖，在原位给药时对肿瘤具有良好的治疗能力。
实施例5瘤内注射递送DP7-C/siTGFβ复合物的安全性评价
目前，安全是开发siRNA药物的重要考察指标。DP7-C/siTGFβ治疗结束后处死小鼠，解剖小鼠并取出主要脏器浸泡于4％多聚甲醛中固定以便保存组织形态。石蜡包埋、切片后，进行HE染色并在光镜下观察小鼠主要脏器组织及细胞形态学的是否有变化，以评估DP7-C/siTGFβ是否对小鼠主要脏器具有毒副作用。
结果表明，各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织结构清晰，组织细胞形态正常，未见明显病理改变(图6)。HE染色结果显示DP7-C/siTGFβ原位注射不会引起明显毒副作用和异常。

Claims (13)

1.抑制TGFβ基因表达的siRNA，其特征在于所述siRNA序列如下：
正义链:5’-GCAACAUGUUGGUCAUUAUTT-3’
反义链:5’-AUAAUGACCAACAUGUUGCTT-3’。
2.装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由疏水化修饰的多肽装载权利要求1所述的抑制TGFβ基因表达的siRNA制备而成；所述多肽的序列为VQWRIRVAVIRK，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段；优选的，所述的多肽VQWRIRVAVIRK碳端酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
3.根据权利要求2所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG或PEG衍生物；进一步的，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为C6-C20中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的PEG衍生物为1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-CO-OH与多肽上的-NH2酰胺化反应生成。
6.根据权利要求4所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的疏水化修饰的多肽的结构为：
所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG衍生物。
7.根据权利要求6所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的多肽结构中的R为：
中的至少一种。
8.根据权利要求2所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由所述的疏水化修饰的多肽和小核酸按质量比3～6︰1作为原料制备而成；优选的，所述的疏水化修饰多肽和小核酸的质量比为5︰1。
9.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由疏水化修饰的多肽与siRNA共孵育制得。
10.根据权利要求9所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由疏水化修饰多肽与siRNA在水中或液态培养基中共孵育5～15min而得；进一步的，所述液态培养基为RPMI1640、DMEM双无培养基或Optim培养基中的至少一种。
11.权利要求1所述的抑制TGFβ基因表达的siRNA或权利要求2～10任一项所述的装载siRNA的纳米粒子在制备***的药物中的应用。
12.抗肿瘤药物，其特征在于由权利要求1所述的抑制TGFβ基因表达的siRNA或权利要求2～10任一项所述的装载siRNA的纳米粒子添加药学上可接受的成分制备而成。
13.根据权利要求11所述的应用或者权利要求12所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述的肿瘤为肺癌、肝癌、***癌、膀胱癌、黑色素瘤或者结肠癌中的至少一种。
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