CN116987644A - 一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌及应用 - Google Patents

一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明是一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，所述发酵粘液乳杆菌为发酵粘液乳杆菌TG017，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCCNO：M 2023513】，保藏时间为【2023年4月10日】，地址位于武汉大学保藏中心。本发明的发酵粘液乳杆菌具有抗氧化的作用，可以显著清除自由基、抗脂质过氧化以及产生抗氧化酶。

Description

一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌及其后生元的应用。
背景技术
研究发现，自由基一般通过与活性较强的含氧物质结合，完成氧化过程，从而给人体内部造成损伤的。因此，如果想要恢复身体机能正常运作，降低自由基的危害，就需要清除体内自由基。我们知道自由基的危害之一就是人体功能退化和衰老，但它的危害远不仅此。自由基极具活性，会破坏细胞，让人体极易受到病菌侵害，削弱人体抵抗力，比如关节炎、心脑血管疾病、各种炎症乃至癌症。我们需要借助吸收更多的酶和抗氧化物来增强我们对自由基的防御能力，修补自由基对身体造成的损伤。
脂质过氧化是指多不饱和脂肪酸和脂质的氧化变质，其可能导致机体细胞膜的流动性以及渗透性发生改变、损伤DNA以及蛋白质，进而影响细胞正常功能。研究表明人类的许多疾病，如肿瘤、血管硬化及衰老、神经退行性现象等都与脂质过氧化作用有关。脂质过氧化可通过产生的自由基损伤细胞，诱导细胞凋亡，同时其细胞毒性又可影响多种酶的活性及ATP的合成。正常情况下，生物体中天然的抗氧化剂防御***中的抗氧化酶可以与饮食或者药物中的抗氧化剂协同作用，清除过氧化物。
后生元是益生菌经加工处理后的益生菌代谢物成分统称，包括菌体与代谢产物，是对宿主健康有益的无生命微生物和或其成分的微生态制剂除。具益生功效外，后生元还具有益生菌无法比拟的优点：一方面，后生元更稳定，与活的益生菌相比，具有更长的保质期；另一方面，后生元安全性更高，对一些特殊人群如新生儿、敏感人群同样适应，而益生菌对这些敏感人群存在一定风险。后生元也不受抗生素的干扰抑制，而益生菌却难以与抗生素同时使用，且有传递耐药基因风险；此外，后生元具有更广泛的作用靶向性且更易于被肠道吸收，提高利用率。因此，后生元应用范围非常广，可以用于食品、营养品、保健食品、生活品、化妆品、饲料等多个行业中。
然而，目前尚未发现发酵粘液乳杆菌具有良好的抗脂质过氧化能力。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌及应用，该发酵粘液乳杆菌具有抗氧化的作用，可以显著清除自由基、抗脂质过氧化以及产生抗氧化酶。
本发明的另一个目的是提供一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌及应用，该发酵粘液乳杆菌应用为后生元，发酵粘液乳杆菌后生元对DPPH自由基都具有较强的清除能力并且具有良好的抗脂质过氧化能力，在细胞层面的验证液发现此菌具有非常高的抗氧化酶活力，并且具有良好的应用安全性和功能适应性。
为达到此目的，本发明采用如下技术方案：
一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)，所述发酵粘液乳杆菌为发酵粘液乳杆菌TG017，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M 2023513】，保藏时间为【2023年4月10日】，地址位于武汉大学保藏中心。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017是从国内健康人体粪便样中筛选获得，菌落呈乳白色，不透明、圆形凸起、表面光滑和边缘整齐，最适生长温度为37℃、最适pH为6和厌氧环境。
所述发酵粘液乳杆菌TG017的基因序列为：
GTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGGTTTCACATCAGAATTAAAAAAACCGCCTGGCCTCTCTTTTCGCCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGGCACCTACGTA。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017具有高产胞外多糖的能力，产量为14.02g/L。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有清除DPPH自由基的能力，无细胞提取物清除率为29.28％，胞外多糖的清除率达62.29％。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有很高的抗氧化酶活力，其胞外多糖谷胱甘肽-过氧化物酶活力达到2890.27U/mgprot，上清液超氧化物歧化酶(SOD)酶活力达到940.26U/mgprot。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有抗脂质过氧化能力，无细胞提取物抑制率为22.5％，胞外多糖的抑制率达15.51％。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017胞外多糖具有良好的细胞抗炎效果。
进一步，所述发酵粘液乳杆菌TG017应用于食品，所述食品包含有发酵粘液乳杆菌TG017，以发酵粘液乳杆菌TG017为材料进行制备。
所述发酵粘液乳杆菌TG017应用于药物，所述药物的剂型可以为粉剂、栓剂、凝胶、口服液、硬胶囊、软胶囊的任意一种。
进一步，所述发酵粘液乳杆菌TG017制备成后生元进行进一步应用。
与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明的发酵粘液乳杆菌TG017的后生元与活的益生菌相比，更稳定，具有更长的保质期，不受抗生素的干扰抑制。具有良好的应用安全性和功能适应性。
本发明的发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有清除DPPH自由基提高抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶活、超氧化物歧化酶(SOD)酶活抗脂质过氧化的能力和抗炎能力。
本发明所述的一株发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)的后生元具有抗氧化能力，该发酵粘液乳杆菌命名为发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillusfermentum)TG017，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M2023513】，保藏时间为【2023年4月10日】，地址位于武汉大学保藏中心。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实现的发酵粘液乳杆菌TG017的平板表型。
图2为本发明实现的发酵粘液乳杆菌TG017的***发育树。
图3为本发明实现的发酵粘液乳杆菌TG017胞外多糖Molisch反应结果图。
图4为本发明实现的发酵粘液乳杆菌TG017的DPPH清除率效果图。
图5为本发明实现的发酵粘液乳杆菌TG017的抗脂质过氧化能力效果图。
图6为一氧化氮含量标准曲线结果图。
图7为本发明实现的发酵粘液乳杆菌TG017在细胞中的抗氧化应激能力效果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明所实现的为一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)，所述发酵粘液乳杆菌为发酵粘液乳杆菌TG017，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M 2023513】，保藏时间为【2023年4月10日】，地址位于武汉大学保藏中心。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017是从国内健康人体粪便样中筛选获得，菌落呈乳白色，不透明、圆形凸起、表面光滑和边缘整齐，最适生长温度为37℃、最适pH为6和厌氧环境。
所述发酵粘液乳杆菌TG017的基因序列为：
GTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGGTTTCACATCAGAATTAAAAAAACCGCCTGGCCTCTCTTTTCGCCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGGCACCTACGTA。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017具有高产胞外多糖的能力，产量为14.02g/L。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有清除DPPH自由基的能力，无细胞提取物清除率为29.28％，胞外多糖的清除率达62.29％。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有很高的抗氧化酶活力，其胞外多糖谷胱甘肽-过氧化物酶活力达到2890.27U/mgprot，上清液超氧化物歧化酶(SOD)酶活力达到940.26U/mgprot。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有抗脂质过氧化能力，无细胞提取物抑制率为22.5％，胞外多糖的抑制率达15.51％。
上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017胞外多糖具有良好的细胞抗炎效果。
实例1：人源益生菌株的筛选。
以来源于福建厦门地区的健康人体粪便为样本，将样本接种于人体肠道菌群血清培养瓶中富集培养，于1、3、6天吸取富集培养液，使用生理盐水梯度稀释涂布在MRS琼脂平板(MRS培养基配方：酪蛋白酶消化物10g/L；牛肉膏粉10g/L；柠檬酸三铵4g/L；乙酸钠5g/L；七水合硫酸镁0.2g/L；四水合硫酸锰0.05g/L；磷酸氢二钾2g/L；葡萄糖20g/L；吐温-801.08g/L；最终pH5.7±0.2，115℃灭菌25min)，于37℃厌氧培养箱中培养48h后，挑取单菌落在MRS琼脂平板上进行3轮划线纯化，得到发酵粘液乳杆菌如图1所示。
实例2：菌株的鉴定。
菌株形态学鉴定：将纯化后的菌种接种至MRS固体培养基平板，厌氧条件下37℃恒温箱中培养24h。
将单菌落接种至MRS液体培养基中，于37℃，200rpm摇床培养24-48h后，利用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组DNA。
以提取获得的基因组DNA为模板，使用16S rDNA全长引物对，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACTT-3'，发酵粘液乳杆菌株(limosilactobacillus fermentum)的亲缘关系如图2***发育树图所示，该株发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillus fermentum)命名为发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillusfermentum TG017)。
实例3：发酵粘液乳杆菌TG017胞外多糖的提取。
将发酵粘液乳杆菌TG017接入MRS液体培养基中，放入摇床37℃，200rpm培养至细菌生长平台期。将培养好的菌悬液离心10000xg，5min取上清，使用0.22μm超滤膜过滤，将过滤后的培养液静置保温65℃，30min，急速冷却至4℃。将胞外多糖培养液十倍浓缩。向浓缩液中加入三氯乙酸(TCA)，既TCA终浓度为10％，混匀后4℃静置过夜，离心10000xg 5min，收集上清。向浓缩液中添加80mL无水乙醇，至无水乙醇终浓度为80％，过夜沉淀胞外多糖，离心10000xg、5min，弃上清，使用30mL 75％乙醇洗涤沉淀2次，每次洗涤后再次离心，配平离心10000xg、5min，弃上清。将离心管开盖放置45℃干燥箱烘干至恒重。
发酵粘液乳杆菌TG017的胞外多糖产糖量为14.02g/L。
胞外多糖鉴定Molisch反应：在试管中加入1ml待测溶液。在试管中滴入2滴(约0.1ml)Molisch Reagent(配制Molisch Reagent：将Molisch Reagent A与MolischReagent B按5g：100m的比例混合并充分溶解即可)，充分摇匀试管并将试管倾斜，沿管壁缓慢加入浓硫酸，试管切勿晃动。待硫酸层沉于试管底部，与待测溶液分成两层，观察液面交界外有无紫色环出现。
Molisch反应被用于检测胞外多糖中的还原糖，当液面交界处有明显紫环出现，表明该胞外多糖提取成功。如图3所示，发酵粘液乳杆菌TG017的胞外多糖粗体物中有大量还原糖存在。
实例4：实验所需菌液后生元溶液制备。
胞外多糖溶液配置(EPS)：称取0.1g胞外多糖提取物，溶解在10ml无菌水中，0.22μL微孔滤膜过滤。
无细胞提取物制备(CFE)：将发酵粘液乳杆菌TG017接入MRS液体培养基中，放入摇床37℃，200rpm培养至细菌生长平台期。将培养好的菌悬液离心10000xg，5min取上清，使用0.22μm超滤膜过滤。
菌液上清制备：将发酵粘液乳杆菌TG017接入MRS液体培养基中，放入摇床过夜培养37℃，200rpm。将培养好的菌悬液离心8000rpm，5min取上清。
实例5：菌液上清及胞外多糖清除DPPH自由基的能力。
DPPH样品溶液配制：精密称取20.0mg的DPPH粉末，置于250mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，混匀，即得0.2mmol/L的DPPH溶液，4℃保存(3.5h内使用)。取1ml无细胞提取物，加入1ml浓度为0.2mmol/L的DPPH，混匀，室温下静置30min后，以无水乙醇做空白对照，在517nm处测吸光度变化。
在波长517nm处测定各样品溶液吸光度为A1；以1.0mL的DPPH溶液与1.0mL无水乙醇的混合液作为阴性对照测定吸光度A2；以1.0mL的无水乙醇溶液加入1.0mL不同浓度的各供试品溶液的混合液作为空白对照，测定其吸光度A0。根据(抑制率(％)＝(1-(A1-A0)/A2)×100％)公式计算清除率。
DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物抗氧化效果显著。如图4所示，发酵粘液乳杆菌TG017的无细胞提取物对DPPH自由基的清除率达到29.28％，其胞外多糖对DPPH自由基的清除率达到62.49％，表明该菌株具有优质的抗氧化效果，后生元能高效的清除自由基。
实例6：菌液上清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性实验。
将发酵粘液乳杆菌TG017从-80℃冰箱取出，在MRS琼脂平板上划线活化，于37℃厌氧培养箱培养至生长出单菌落，利用接种环蘸取MRS琼脂上的单菌落，接入MRS液体培养基中，放入摇床37℃，200rpm培养至细菌生长平台期。将培养好的菌悬液离心10000xg，5min取上清，使用0.22μm超滤膜过滤，用GSH-Px试剂盒(购自Elabscience公司)检测抗氧化结果。
结果如表1，发酵粘液乳杆菌TG017经培养后，其无细胞提取物的抗氧化酶活力达到70.55U/mL，抗氧化效果显著。
表1 TG017的无细胞提取物抗氧化酶酶活力
实例7：菌液上清超氧化物歧化酶(SOD)活性实验。
如表2所示，WST-1法：WST-1可以和黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲臜染料，SOD能催化超氧化物阴离子产生歧化反应。反应步骤可以被SOD抑制，SOD的活性与甲臜染料的生成量呈负相关，通过计算WST-1产物的比色分析即可计算SOD的活力。结果如表3，发酵粘液乳杆菌TG017经培养后，其上清液的抗氧化酶活力达到940.26U/mL，抗氧化效果显著。
表2 WST-1实验
SOD抑制率的计算公式：SOD抑制率(％)＝[(ΔA1-ΔA2)/ΔA1]×100％；
SOD活力计算：SOD活力(U/mL)＝i÷50％×(V1/V2)；
其中，ΔA1：对照孔OD值-对照空白孔OD值；ΔA2：测定孔OD值-对照空白孔OD值；i：SOD抑制率(％)；V1：反应液总体积(240μL)；V2：加入样本的体积(20μL)。
表3TG017上清液抗氧化酶酶活力
实例8：菌液上清及胞外多糖抗脂质过氧化能力。
(1)亚油酸乳化液制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。
(2)0.5mL的PBS溶液(pH 7.4)中加入1mL亚油酸的乳化液，1mL FeSO4(1％)，再加入0.5mL益生菌的发酵上清液或胞外多糖溶液，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2mL TCA(4％)，2mL TBA(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为A；对照组以0.5mL蒸馏水代替样品即为A0。
抑制率(％)＝(A0－A)/A0×100％。
(注：A为样品组吸光度；A0为对照组吸光度。)
脂质过氧化(Lipid peroxidation)是指多不饱和脂肪酸和脂质的氧化变质，其可能导致机体细胞膜的流动性以及渗透性发生改变、损伤DNA以及蛋白质，进而影响细胞正常功能。研究表明人类的许多疾病，如肿瘤、血管硬化及衰老、神经退行性现象等都与脂质过氧化作用有关。如图5所示，发酵粘液乳杆菌TG017通过测定无细胞提取物及胞外多糖对亚油酸脂质过氧化的影响，来评定的抗脂质过氧化能力，CFE对脂质过氧化的抑制率为22.50％，EPS对脂质过氧化的抑制率为15.51％，其后生元均有高效的抗脂质过氧化能力。
实例9：胞外多糖在细胞中的抗氧化应激实验。
称取50mg胞外多糖溶于50ml超纯水中制得1mg/ml的胞外多糖溶液，0.22μL微孔滤膜过滤。LPS溶于超纯水中制得10μg/ml的LPS溶液，0.22μL微孔滤膜过滤。
RAW 264.7细胞培养，将培养板置于37℃，5％ CO2培养箱中培育24h。待细胞充分贴壁后，弃掉旧的培养基，使用PBS缓冲液清洗细胞一遍，而后在每孔中加入100μl含终浓度为500μg/ml的胞外多糖的DMEM培养基，将培养板置于37℃，5％ CO2培养箱中培育2h，之后向各孔中加入10μl，10μg/ml的LPS继续培育22h，取50μl细胞上清于新的96孔板中，使用Griess试剂盒检测细胞上清的NO浓度。
氧化应激(Oxidative Stress，OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。同时指机体在内外环境有害刺激下，体内产生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)和活性氮自由基(Reactive Ntrogen Species，RNS)所引起的细胞和组织的生理和病理反应。由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病(老年痴呆)、糖尿病等疾病最重要的危险因素。
图6所示，为一氧化碳的标准曲线，NO是作为氧化应激的一个重要的指标，抑制细胞内NO的产生且认定为能达到抗氧化应急的作用，如图7所示，发酵粘液乳杆菌TG017对NO的抑制能力达到89.45％。
实例10：胞外多糖促进细胞中的GSH-Px活性实验。
RAW 264.7细胞在培养瓶中长至密度约为80％～90％时，用胰酶将细胞消化下来离心(250rpm，3min)，收集细胞进行6孔板铺板，每孔加入细胞悬液2mL，细胞密度约为1×106cell每孔(5×105cell/mL)，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培育24h。
待细胞充分贴壁后，弃掉旧的培养基，使用PBS缓冲液清洗细胞两遍，而后在每孔中加入2mL含500μg/ml的胞外多糖的DMEM培养基，将培养板置于37℃，5％ CO2培养箱中培育2h，之后向各孔中加入200μl，10μg/ml的LPS继续培育22h，GSH-Px(购自Elabscience公司)试剂盒检测抗氧化结果。
如表4所示，TG017菌株的胞外多糖处理后细胞中GSH-Px提升了2890.27U/mgprot。
表4 TG017菌株的胞外多糖处理后细胞中GSH-Px酶活力
实例11：模拟胃肠环境下菌的存活率。
模拟胃液的配制：准确量16.4mL稀盐酸，加入800mL水及10g胃蛋白酶并完全混合，加水定容至1000mL并完全混合，置于4℃冰箱。用1mol/L HCl调整pH为2.5，充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，备用。
模拟肠液的配制：准确称取磷酸二氢钾6.8g加水500mL。用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8；另取胰蛋白酶10g加水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL。置于4℃冰箱。用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，备用。
活化菌株：平板划线然后接菌悬液200μL接种到10mL的MRS液体培养基中培养过夜，测OD600将菌液稀释OD600＝0.8～1.0，备用，取0.4mL菌体悬液分别接入10mL配制好的pH＝2.5的模拟人工胃液和pH＝8.0的模拟人工肠液中混匀，37℃条件下消化，同时分别吸取0h和3h的消化液20μL涂布，48h后计数检测活菌数，计算存活率。其中，菌株存活率％＝Nt/N0×100％，式中N0表示菌株0h的活菌数(CFU/mL)，Nt表示菌株3h的活菌数(CFU/mL)。如表1，可得，发酵粘液乳杆菌TG017在胃液中存活率可达51.55％，在肠液中存活率高达77％，表明菌株能够良好的在人体消化道中存活且发挥作用。
表3 TG017在胃肠液中的存活率
综上所述，本发明的发酵粘液乳杆菌TG017的后生元与活的益生菌相比，更稳定，具有更长的保质期，不受抗生素的干扰抑制。具有良好的应用安全性和功能适应性。
本发明的发酵粘液乳杆菌TG017后生元具有清除DPPH自由基提高抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶活、超氧化物歧化酶(SOD)酶活抗脂质过氧化的能力和抗炎能力。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，其特征在于所述发酵粘液乳杆菌为发酵粘液乳杆菌TG017，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：【CCTCC NO：M 2023513】，保藏时间为【2023年4月10日】，地址位于武汉大学保藏中心。
2.根据权利要求1所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，其特征在于所述发酵粘液乳杆菌TG017是从国内健康人体粪便样中筛选获得，菌落呈乳白色，不透明、圆形凸起、表面光滑和边缘整齐，最适生长温度为37℃、最适pH为6和厌氧环境。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，其特征在于所述发酵粘液乳杆菌TG017的基因序列为：
GTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGGTTTCACATCAGAATTAAAAAAACCGCCTGGCCTCTCTTTTCGCCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGGCACCTACGTA。
4.根据权利要求3所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，其特征在于上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017具有高产胞外多糖的能力。
5.根据权利要求3所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，其特征在于上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017具有清除DPPH自由基的能力。
6.根据权利要求3所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，其特征在于上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017具有抗氧化酶活力。
7.根据权利要求3所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌，其特征在于上述的一株发酵粘液乳杆菌TG017具有抗脂质过氧化能力。
8.根据权利要求1所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌的应用，其特征在于进一步，所述发酵粘液乳杆菌TG017应用于食品，所述食品包含有发酵粘液乳杆菌TG017，以发酵粘液乳杆菌TG017为材料进行制备。
9.根据权利要求1所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌的应用，其特征在于所述发酵粘液乳杆菌TG017应用于药物，所述药物的剂型可以为粉剂、栓剂、凝胶、口服液、硬胶囊、软胶囊的任意一种。
10.根据权利要求1所述的具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌的应用，其特征在于所述发酵粘液乳杆菌TG017制备成后生元。
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