CN116981684A - 一种纳米颗粒及其检测car阳性表达率的应用 - Google Patents

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Abstract

一种纳米颗粒及其检测CAR阳性表达率的应用，所述纳米颗粒包含(i)包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段；和(ii)靶点蛋白和/或其功能片段。所述纳米颗粒可用于检测CAR阳性表达率，也可用于证明CAR能特异性结合靶蛋白。

Description

一种纳米颗粒及其检测CAR阳性表达率的应用 技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地涉及一种纳米颗粒及其检测CAR阳性表达率的应用。
背景技术
在免疫***中，T细胞需要借助抗原递呈细胞(APC)来杀死异常细胞。APC表面有许多用于识别细胞表面抗原的MHC(主要组织相容性复合体)分子，在APC识别到异常细胞之后，MHC就会和T细胞受体(TCR)结合，把信号传递给T细胞。在CD3、CD4和CD8等分子的帮助下，T细胞才能最终识别异常细胞并将其杀死。但是肿瘤细胞却把自己的这些“指纹”给毁了，导致APC细胞就无法识别它。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是一种基因工程技术制造的人工受体分子，它可以赋予免疫效应细胞(如T淋巴细胞)针对某个靶点抗原表位的特异性，从而增强T淋巴细胞识别抗原信号与活化的功能(Sadelain,M.,R.Brentjens,and I.Riviere.The promise and potential pitfalls of chimeric antigen receptors.Curr Opin Immunol,2009.21(2):p.215-23.)。CAR-T细胞能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。CAR-T细胞疗法本质上是一种过继细胞转移(ACT)，ACT最早被提出是在器官移植过程中，供体的淋巴细胞被输入受体体内的过程，该过程抗原介导移植器官排斥反应的发生，后逐渐发展为治疗恶性肿瘤的疗法(Mitchison,N.A..Studies on the immunological response to foreign tumor transplants in the mouse.I.The role of lymph node cells in conferring immunity by adoptive transfer.The Journal of experimental medicine,1955.102(2):p.157-177.)。
对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性表达率的T细胞。CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，CAR阳性表达率的检测是CAR-T细胞生产过程中的重要质控步骤。
现有技术中主要针对轻链或铰链区的Anti-Fab抗体或Protein L蛋白来检测CAR阳性表达率，但上述方法均存在非特异结合的缺陷，而无法证明CAR能否结合靶抗原。因此，靶点蛋白用于检测CAR阳性表达率具有特异性强的优势而备受业界人士的青睐。然而，大多数靶点蛋白的制备比较困难，所得的靶点蛋白也有可能给CAR阳性表达率的检测带来不良影响。例如，由于靶点蛋白跨膜区的疏水特性，在纯化过程中需要引入去垢剂来溶解靶点蛋白，从而造成制备的靶点蛋白中会含有去垢剂，而去垢剂的存在会导致T细胞发生膜溶解，这使得在去垢剂体系中的靶点蛋白无法用于CAR阳性率的检测。此外，使用靶点蛋白可溶性的胞外loop区检测CAR阳性表达率，虽然靶点蛋白制备难度低，但因为没有跨膜区的结果限制，无法保证其构象与天然构象一致，而存在无法正确识别CAR的缺陷。
为了解决这些问题，需要开发一种CAR靶点蛋白，其既保持了完整的天然构象，且能特异性的结合CAR。
病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)，也称为核心样颗粒(Core-like Particle，CLP)，是由病毒衣壳蛋白(capsid protein,CP)自组装形成的球形或管状蛋白纳米结构，具有与天然病毒衣壳类似的结构，不含基因组、无感染性。VLP主要分为eVLP和非包膜VLP。在VLP来自包膜病毒的情况时，这个过程是通过从宿主细胞出芽，这造成VLP被脂质双分子层包裹(中国专利申请CN101146522A)。美国专利申请US20110189159A1基于发现感兴趣的蛋白质可以作为融合的或未融合的蛋白质被递送到细胞；特别是，用两种Gag融合(感兴趣的Gag-蛋白和Gag-蛋白酶)制成VLP，可以将感兴趣的蛋白作为未融合的蛋白传递给细胞用于治疗。PCT专利申请WO2021022008A1公开的疫苗包含VLP，以及药学上可接受的赋形剂、载体和/或佐剂；其中，VLP包含(a)合成或天然脂质双层，(b)嵌入脂质双层中的锚分子，(c)与锚分子结合的抗原。近年来eVLP在疫苗开发、药物靶向递送、生物医学成像与传感、组织工程等众多领域展现出独特的研究与应用价值。然而，eVLP在CAR阳性表达率的研究却罕有报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本公开提供了一种纳米颗粒及其检测CAR阳性表达率的应用。
具体地，本公开通过以下技术方案来解决本公开所要解决的技术问题。
在本公开的一个方面，涉及一种纳米颗粒，其包含：
(i)包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段；和
(ii)靶点蛋白和/或其功能片段，
其中，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白包含病毒核心蛋白或其功能片段，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白或其功能片段组装形成包膜病毒样颗粒，所述靶点蛋白和/或其功能片段展示在包膜病毒样颗粒上，形成靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述靶点蛋白为CAR靶点蛋白；所述CAR靶点蛋白和/或其功能片段展示在包膜病毒样颗粒上，形成CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述病毒选自逆转录病毒、杆状病毒、线状病毒、冠状病毒、流感病毒、副粘病 毒、呼吸道合胞病毒、沙粒病毒、新城疫病毒、副流感病毒、布尼亚病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒。
在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒选自人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、小鼠白血病病毒和牛白血病病毒。
在一个或多个实施方案中，所述杆状病毒为水疱性口炎病毒。
在一个或多个实施方案中，所述线状病毒为埃博拉病毒。
在一个或多个实施方案中，所述冠状病毒选自新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-Cov、229E、NL63、OC43和HKU1。
在一个或多个实施方案中，所述的病毒核心蛋白选自：逆转录病毒Gag蛋白、杆状病毒基质蛋白M蛋白、线状病毒核心蛋白、冠状病毒M、E和NP蛋白、流感病毒M1蛋白、副粘病毒M蛋白、呼吸道合胞病毒(RSV)M蛋白、沙粒病毒Z蛋白、新城疫病毒M蛋白、副流感病毒M蛋白、布尼亚病毒N蛋白、丙型肝炎病毒核心蛋白C、乙型肝炎病毒核心蛋白C和其组合物。
在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒Gag蛋白选自：人类免疫缺陷病毒Gag蛋白、猴免疫缺陷病毒Gag蛋白、小鼠白血病病毒Gag蛋白和牛白血病病毒Gag蛋白。在一个或多个优选的实施方案中，所述逆转录病毒Gag蛋白为所述人类免疫缺陷病毒Gag蛋白。在一个或多个优选的实施方案中，所述人类免疫缺陷病毒Gag蛋白包含与SEQ ID No.1具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列。在一个或多个优选的实施方案中，所述人类免疫缺陷病毒Gag蛋白的氨基酸序如SEQ ID No.1所示。
在一个或多个实施方案中，所述杆状病毒基质蛋白M蛋白为水疱性口炎病毒M病毒核心蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述线状病毒核心蛋白为埃博拉病毒VP40病毒核心蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述冠状病毒的核心蛋白选自新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-Cov、229E、NL63、OC43和HKU1的核心蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述病毒为从宿主细胞的细胞膜上芽生时获得包膜的病毒。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白包括膜蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述膜蛋白包括跨膜蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜蛋白包括多次跨膜蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白选自CD20、Claudin18.1、Claudin18.2、CD133、GPRC5D、CCR5、CCR8、BCMA、GPCR、CD147、CD19、CD123、CD138、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CAIX、EGFR、EGFRVIII、FOLR1、GPC3、HER2、HGFR、Anti-FMC63Ab、CLL-1、SLAMF7、CD4、CD5、CD8A&CD8B、FAP、IL13RA2、GPC3、GUCY2C、Her3、PSMA、ROR1、SLAMF7、B7-H3、CD147、CEA、MUC16、Nectin-4、VEGFR2、Anti-RTX Ab、B7-H3、CAIX、CD7、CEA、MUC1、NKG2D、PSCA、uPAR、GD2、FR、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、CD44v7/8、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、间皮素、IGFR1、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG、PROGRP或MSLN中任一种。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白包括多次跨膜蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白选自CD20、Claudin18.2、CD133、GPRC5D、CCR5、CCR8、CD19、BCMA、GPC3、CD30、CD22、EGFR、EGFRVIII、HER2或GPCR中任一种。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白为Claudin18.2。在一个或多个优选的实施方案中，所述Claudin18.2的氨基酸序列包含与SEQ ID No.4具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列。在一个或多个优选的实施方案中，所述Claudin18.2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白为CD20。在一个或多个优选的实施方案中，所述CD20的氨基酸序列包含与SEQ ID No.15具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：更优选地，所述CD20的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白和/或其功能片段和/或所述病毒核心蛋白和/或其功能片段与标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端和/或病毒核心蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端与标记物相连接。在一个或多个优选的实施方案中，在Claudin 18.2的C末端或Gag的C末端用标记物进行标记。在另一个或多个优选的实施方案中，在CD20的C末端或Gag的C末端用标记物进行标记。
在一个或多个实施方案中，所述标记物选自可检测标记物、纯化标签、报告标签和其组合物。
在一个或多个实施方案中，所述可检测标记物选自荧光基团、化学发光标记物、电化学发光标记物和其组合物。
在一个或多个实施方案中，所述荧光基团选自FITC、GFP、RFP、YFP、TRITC、PE、FAM、RRX、TR、Cy2、Cy3、Cy5、ECD、PC5.5、PC7、APC、APC-A70、APC-A75、Pac-Blue、Alexa488、mBBr、5-IAF、E-118、DTAF、 罗丹明绿和KrO中的任一种。
在一个或多个实施方案中，所述化学发光标记物为吖啶酯、异鲁米诺、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在一个或多个实施方案中，所述电化学发光标记物为三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺酯。
在一个或多个实施方案中，所述纯化标签选自HIS-Tag、GST-Tag、MBP-Tag、NusA-Tag、FLAG-Tag、SUMO、Avi-Tag、Halo-Tag和SNAP-Tag中的任一种。
在一个或多个实施方案中，所述纯化标签通过二抗检测。
在一个或多个实施方案中，所述报告标签选自c-Myc、HA或荧光素酶中的任一种。
在一个或多个实施方案中，将CAR靶点蛋白展示在eVLP上，同时在CAR靶点蛋白的C末端或Gag的C末端使用标记物进行标记。
在本公开的另一方面，涉及一种带标记物的Claudin 18.2-eVLP，所述Claudin 18.2-eVLP和标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒为Claudin 18.2-eVLP纳米颗粒，所述Claudin18.2和/或其功能片段和/或所述病毒核心蛋白和/或其功能片段与标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述Claudin 18.2和/或其功能片段的N末端和/或C末端和/或病毒核心蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端与标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白为Gag蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述Claudin 18.2的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连。
在本公开的另一方面，涉及一种带标记物的CD20-eVLP，所述CD20-eVLP和标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒为CD20-eVLP纳米颗粒，所述CD20和/或其功能片段和/或所述病毒核心蛋白和/或其功能片段与标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述CD20和/或其功能片段的N末端和/或C末端和/或病毒核心蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端与标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白为Gag蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述CD20的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连。
在一个或多个实施方案中，所述标记物为GPF。
在一个或多个实施方案中，所述GFP的氨基酸序列包含与SEQ ID No.2具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列。在一个或多个优选的实施方案中，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在一个或多个实施方案中，所述Gag蛋白的C末端与标记物GFP相连，记为Gag-GFP，所述Gag-GFP的氨基酸序列包含与SEQ ID No.3具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列。在一个或多个优选的实施方案中，所述Gag-GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
在一个或多个实施方案中，所述Claudin 18.2的C末端与标记物GFP相连，记为Claudin 18.2-GFP，所述Claudin 18.2-GFP的氨基酸序列与SEQ ID No.5具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列。在一个或多个优选的实施方案中，所述Claudin 18.2-GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
在本公开的另一方面，涉及一种纳米颗粒的制备方法，其包括：
(1)重组质粒的构建：
分别构建包含包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段基因的重组质粒和靶点蛋白和/或其功能片段基因的重组质粒；或，构建同时包含包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段基因和靶点蛋白和/或其功能片段基因的重组质粒；和
(2)宿主细胞转染、蛋白表达和颗粒组装：
将步骤(1)构建的包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段重组质粒和靶点蛋白和/或其功能片段重组质粒转染宿主细胞，表达包膜病毒样颗粒骨架蛋白和/或其功能片段和靶点蛋白和/或其功能片段；所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白或其功能片段组装形成包膜病毒样颗粒，所述靶点蛋白和/或其功能片段展示在包膜病毒样颗粒上，形成靶点蛋白-eVLP纳米颗粒；以及，任选地，
(3)纯化靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述GAG的编码核酸序列包含与SEQ ID No.7具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
在一个或多个实施方案中，所述Gag-GFP编码核酸序列包含与SEQ ID No.8具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
在一个或多个实施方案中，所述Claudin 18.2的编码核酸序列包含与SEQ ID No.9具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
在一个或多个实施方案中，所述Claudin 18.2-GFP的编码核酸序列包含与SEQ ID No.10具有至少80％或以上 同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD20的编码核酸序列包含与SEQ ID No.16具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞或真核宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，所述原核宿主细胞选自细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和分枝杆菌。
在一个或多个实施方案中，所述真核宿主细胞选自动物细胞、植物细胞或真菌中的任一种。
在一个或多个实施方案中，所述真核宿主细胞选自酵母、昆虫、禽类、植物、秀丽隐杆线虫和哺乳动物宿主细胞中的任一种。
所述昆虫细胞的非限制性例子有：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)细胞、例如Sf9、Sf21，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，例如High Five细胞，和果蝇S2细胞。
所述真菌(包括酵母)宿主细胞的例子有酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳克鲁维酵母(Kluy veromyces lactis；K.lactis)、假丝酵母属(Candida)物种包括白色假丝酵母(C.albicans)和光滑假丝酵母(C.glabrata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe；S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂耶罗酵母(Yarrowia lipolytica)。
所述哺乳动物细胞的例子有COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞(例如HEK293细胞)、633细胞、Vero、BHK细胞、非洲绿猴细胞、CV1细胞、HeLa细胞、MDCK细胞和Hep-2细胞。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞选自HEK293细胞、633细胞、Vero细胞、BHK细胞、原核细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中的任一种。
在本公开的另一方面，涉及检测CAR阳性表达率的方法，包括将所述的纳米颗粒或所述方法制备的纳米颗粒与CAR修饰的细胞孵育，然后进行检测。
在一个或多个实施方案中，在细胞孵育后、进行检测前洗涤细胞。
在一个或多个优选的实施方案中，所述CAR修饰的细胞选自CAR-like(HEK293)细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-M细胞、CAR-NKT细胞、CAR-Treg细胞及CAR-γδT细胞中的任一种。
在一个或多个实施方案中，涉及检测CAR阳性表达率的方法，包括将前述带标记物的Claudin 18.2-eVLP与CAR修饰的细胞孵育、洗涤后进行检测。
优选地，涉及检测CAR阳性表达率的方法，包括将前述带标记物的Claudin 18.2-eVLP与CAR-T细胞孵育、洗涤后进行检测。
在一个或多个实施方案中，所述Claudin 18.2-eVLP保证了CAR靶点蛋白的天然完整构象，提高了分离出可识别天然膜蛋白结构的抗体的成功率。
在一个或多个实施方案中，涉及检测CAR阳性表达率的方法，包括将前述带标记物的CD20-eVLP与CAR修饰的细胞孵育、洗涤后进行检测。
优选地，涉及检测CAR阳性表达率的方法，包括将前述带标记物的CD20-eVLP与CAR-T细胞孵育、洗涤后进行检测。
在一个或多个实施方案中，所述CD20-eVLP保证了CAR靶点蛋白的天然完整构象，提高了分离出可识别天然膜蛋白结构的抗体的成功率。
在一个或多个实施方案中，所述孵育的温度为2℃-40℃，优选37℃，和/或，所述孵育的时间为15min-2小时，优选1小时；和/或，所述孵育的CO 2的浓度为2％-8％，优选5％。
在一个或多个实施方案中，所述洗涤的次数为1-6次，优选3次。
在一个或多个实施方案中，所述洗涤缓冲液为0.5％-5％BSA，优选2％BSA。
在一个或多个实施方案中，所述检测为流式细胞术检测、免疫检测、ELISA、SPR、BLI中的任一种。
在一个或多个实施方案中，所述包膜病毒样颗粒eVLP骨架蛋白为Gag蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述Claudin 18.2的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，所述CD20的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连接。
在一个或多个实施方案中，利用HIV-1 Gag能够自组装成eVLP的能力，将CAR靶点蛋白展示在膜表面(图1)。优选地，将四次跨膜蛋白Claudin 18.2展示在HIV-1 Gag包膜VLP上，同时在Claudin 18.2的C末端或Gag的C末端用标记物进行标记。利用流式细胞术检测使用Claudin 18.2-eVLP来评估CAR阳性表达率。本公开所产生的Claudin 18.2-eVLP均可以进行靶抗原结合CAR的表达评估。
在本公开的另一方面，涉及一种试剂盒，其含有前述纳米颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述纳米颗粒是CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有前述带标记物的CAR靶点蛋白-eVLP。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有前述带标记物的Claudin 18.2-eVLP。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有前述带标记物的CD20-eVLP。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒为ELISA试剂盒、SPR试剂盒或BLI试剂盒。
在一个或多个实施方案中，所述ELISA试剂盒含有前述CAR靶点蛋白-eVLP、酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
在一个或多个实施方案中，所述SPR试剂盒包含前述CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
在一个或多个实施方案中，所述BLI试剂盒包含前述CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
本公开所述试剂盒既可用于检测CAR阳性表达率，也能证明CAR能特异性结合靶蛋白。
在非限制性实例中，所述试剂盒中可包括用于制备CAR靶点蛋白-eVLP和/或施用CAR靶点蛋白-eVLP的试剂。试剂盒可进一步包括用于在体外和体内评估CAR靶点蛋白-eVLP活性的试剂。在某些方面，试剂盒可以包括用于给药的试剂和/或装置，例如吸入器或喷雾器，试剂盒还可以包括一种或多种缓冲液等。
当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液形式提供时，液体溶液是水溶液，尤其优选无菌水溶液。此外，试剂盒的组分也可以干燥粉末的形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重新构建液体溶液。
应理解，在本公开范围内中，本公开的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为HIV-Gag包膜VLP展示多次跨膜靶抗原的原理示意图。
图2示出了蔗糖密度梯度离心后粗纯样品电泳结果，其中泳道A为R1242粗纯样品，泳道B为RG288粗纯样品，泳道C为RG341粗纯样品。
图3示出了Sepharose 6FF分离后样品的电泳检测结果，其中图A为R1242，图B为RG288，图C为RG341。
图4示出了R1242-210521F1透射电镜检测结果。
图5示出了ELISA方法检测Claudin 18.2-eVLP与其特异抗体IMAB362的结合活性，其中图A为RG288-210503F1和IMAB362结合的ELISA检测结果；图B为RG341-210521F1和IMAB362结合的ELISA检测结果。
图6为IMAB361 CAR-like结构示意图。
图7示出了本公开Claudin18.2-eVLP用于评估IMAB362 CAR-like表达情况：其中图A为当FITC-anti mFab Ab稀释200倍时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况；图B为当FITC-Protein L使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况；图C为当Claudin-18.2 Protein,His Tag TM使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情；图D为当RG288-210503F1使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况；图E为当RG341-210521F1使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况。
图8示出了本公开CD20-eVLP用于评估Ofatumumab CAR-like表达情况：当RG344-210628F1使用浓度为20μg/mL时，其评估Ofatumumab CAR-like表达情况。
具体实施方式
本公开公开了一种eVLP及其检测CAR阳性表达率的应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该eVLP，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本公开内。本公开的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本公开内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本公开技术。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“病毒样颗粒”(VLP)是指在至少一种属性上类似病毒但是已经证明其没有感染性的结构。一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，并且不能复制。另外，病毒样颗粒通常可以通过异源表达来大量生产，而且可以容易地纯化。
术语“包膜VLP”或可替代的“eVLP”是指病毒样颗粒被源于宿主细胞的脂质包膜包裹，形成的包膜病毒样颗粒。
术语“CAR靶点蛋白”是指能与CAR特异性结合的蛋白。
术语“eVLP骨架蛋白”在本公开中可以理解为形成eVLP的骨架结构的蛋白质，所述eVLP的骨架结构可以主要由病毒核心蛋白构成或包括病毒核心蛋白以及其他蛋白。
术语“病毒核心蛋白”是指包膜蛋白，在一些情况下，其还能够驱动出芽和颗粒从宿主细胞的释放。
术语“功能片段”对应于全长的蛋白质具有截短的结构，但仍然保持全长蛋白质的全部或部分功能的片段；例如对于核心蛋白而言，其对应的功能片段可以理解为截短的核心蛋白的片段，其仍具有形成病毒至少部分衣壳或驱动出芽和颗粒从宿主细胞的释放的能力；对于靶点蛋白而言，其对应的功能片段可以理解为截短的靶点蛋白的片段，其仍具备与CAR特异性结合的能力。
术语“嵌合抗原受体”或可替代的“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞质信号传导结构域。
术语“CAR-like(HEK293)”是指嵌合抗原受体(CAR)修饰的HEK293细胞，即用CAR手段编辑HEK293， 在HEK293的表面展示CAR。
术语“CAR-NK”是指嵌合抗原受体(CAR)修饰的NK细胞，其中NK细胞是自然杀伤细胞(natural killer cell)，NK细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。
术语“CAR-M”是指嵌合抗原受体(CAR)修饰的巨噬细胞(CAR macrophages)，即用CAR手段编辑人体巨噬细胞，使其可以直接吞噬肿瘤。
术语“CAR-NKT”是指嵌合抗原受体(CAR)修饰的NKT细胞(Natural killer T cell)，其中NKT细胞是一种细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。CAR-NKT细胞结合NKT细胞原本的优势和CAR疗法的特异性，更好的实现肿瘤杀伤效果。
术语“CAR-Treg”是指嵌合抗原受体(CAR)修饰的调节性T细胞(Tregs)，其中Tregs是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，早期亦称作抑制性T细胞(suppressor T cells)。调节性T细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞(n T-regs)和诱导产生的适应性调节性T细胞(a T-regs或i T-regs)，如Th3、Tr1，另外尚有CD8 Treg、NKT细胞等，与自身免疫性疾病的***密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。
术语“CAR-γδT”是指嵌合抗原受体(CAR)修饰的γδT细胞，其中γδT细胞是介于适应性免疫和固有免疫之间的一类T细胞，占外周血T淋巴细胞的1％-5％，主要分布在黏膜和上皮组织中。γδT细胞识别抗原无MHC限制，不仅可以通过多种方式杀伤肿瘤细胞，而且作为抗原提呈细胞(APC)发挥提呈抗原作用。将γδT细胞改造成CAR-γδT细胞，使其能够精准的识别特异性抗原，高效杀死肿瘤细胞，利用γδT细胞特性或许可以挑战实体瘤的治疗。
术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中该scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫响应的分子。免疫响应可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫响应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。
术语“ELISA”是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是将已知的抗原或抗体结合在固相载体表面，然后利用酶标记(偶联)的抗体或抗原与之孵育，在通过显色物显色，其显色深浅与待测物质的含量成正比，用肉眼即可观察。在ELISA实验中，有三种必需的试剂：已知的抗原或抗体(用于结合到固相载体上)；酶标的抗体或抗原(标记物)；显色剂(用于显色)。常见的ELISA实验有四种：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。
术语“SPR”是表面等离子体共振(Surface plasmon resonance)的简称，其应用SPR原理检测生物传感芯片(biosensor chip)上配位体与分析物之间的相互作用情况，作为一个通用检测平台，被广泛应用在药物筛选、科学研究等领域，用于生物分子间亲和力、结合特异性、浓度定量等分析。
术语“BLI”是生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry)的简称，是基于干涉光谱图的位移变化来检测生物分子间相互作用的一种实验方法。
术语“FACS”是流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated Cell Sorting)的简称，流式细胞仪的工作原理是将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学***(透镜、光阑、滤片和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号，计算机***进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。
术语“HIS-Tag”由6-10个组氨酸残基组成，分子量不到0.84KD，通常***在目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag是目前原核表达最常用的标签，蛋白纯化完之后可以不需切除此标签，也不会对蛋白产生功能影响。同时，蛋白纯化步骤简便，纯化条件温和，对蛋白也不会产生太大影响。
术语“GST-Tag”为谷胱甘肽巯基转移酶标签，相对分子质量较大，约为26KD，***在目的蛋白的C末端或N末端，大肠杆菌中常用在N端。GST(谷胱甘肽巯基转移酶)蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶。一般选择GST标签的目的有两个，一是提高蛋白表达的可溶性，二是提高蛋白的表达量。蛋白表达纯化结束后需根据不同的蛋白应用而确定是否切除标签，标签较大，切除与否需根据下游应用考虑。如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。
术语“MBP-Tag”为麦芽糖结合蛋白标签，氨基酸残基数346，分子量42.5KDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码，构建时可放在N端，用来提高可溶性(尤其是真核蛋白)。MBP的折叠需要DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES两个分子伴侣***的帮助，这可以使这些分子伴侣聚集到目的蛋白的附近帮助其正确折叠。另外，以标签蛋白形式存在的麦芽糖结合蛋白可以减少目的蛋白的降解，提高表达产物的水溶性，也为以后对目的蛋白的纯化提供了基础。麦芽糖结合蛋白能够被多糖树脂吸附，因此在过柱时，能够使融合蛋白与其它蛋白成份分离。
术语“NusA-Tag”为转录终止/抗终止蛋白标签，NusA是大肠杆菌自身的一种蛋白，即转录抗终止因子，氨基 酸残基数495，分子量：54.87KDa，由1999年Davia将NusA从4000种大肠杆菌蛋白库中筛得。NusA不具有独立的纯化标签功能，所以要与其它标签(如His标签)联用。
术语“FLAG-Tag”为8个氨基酸(DYKDDDDK，SEQ ID No.12)的融合多肽，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达***中表达效率更高。
术语“SUMO”为SUMO标签蛋白，是一种小分子泛素相关修饰蛋白，是存在于真核生物中高度保守的参与蛋白质小泛素化相关修饰的一类大蛋白。与GST、MBP或NusA相比，SUMO不仅可以作为重组蛋白表达的融合标签还具备分子伴侣的功能，能促进蛋白的正确折叠，对热和蛋白酶具有耐受性，更有助于保持目的蛋白的稳定性。
术语“Avi-Tag”是一个15个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物。
术语“Halo-Tag”是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag配基有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C端，并在原核和真核***中表达。HaloTag配基是小分子化学物，能够在体外或体内与HaloTag蛋白共价结合。
术语“SNAP-Tag”是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移(O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase)获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团(如荧光素和若丹明)。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。
术语“c-Myc”标签蛋白，是一个含10个氨基酸(EQKLISEEDL，SEQ ID No.13)的小标签，这10个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中,可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。常见的载体有pCMV-MYC、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pCMV-RFP-C-Myc、pCMV-Myc等。
术语“HA”标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA(SEQ ID No.14)，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小，容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。常用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。
术语“荧光素酶”来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。
实施例
实施例1 eVLP骨架质粒的构建
本实施例中使用的eVLP骨架为HIV-1 SF2p 55Gag(GenBank accession no.K02007)蛋白(SEQ ID No.1)，单独的Gag蛋白具备可以自组装成包膜VLP颗粒的能力。
首先，分别构建含有Gag编码基因的重组质粒R1221和Gag-GFP编码基因的重组质粒R1242：由上海生物工程有限公司合成编码SEQ ID No.1和3所示氨基酸序列的多核苷酸SEQ ID No.7和8，5’末端添加限制性内切酶BamHⅠ酶切位点、Kozak序列；3’末端添加终止密码子TAA和限制性内切酶XhoⅠ酶切位点。合成产物用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将目的片段分别与同样经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pcNDA3.1(+)连接，构建重组真核表达载体，即重组质粒R1221和R1242。然后，将重组质粒R1221和R1242分别转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃培养16h后挑取单菌落进行质粒提取，将提取后的质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用。
实施例2 Claudin 18.2重组表达质粒的构建
首先，分别构建含有Claudin 18.2编码基因的重组质粒R1353和Claudin 18.2-GFP编码基因的重组质粒R1303：由上海生物工程有限公司合成编码SEQ ID No.4和5所示氨基酸序列的多核苷酸SEQ ID No.9和10，5’末端添加限制性内切酶BamHⅠ酶切位点、Kozak序列；3’末端添加终止密码子TAA和限制性内切酶XhoⅠ酶切位点。合成产物用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将目的片段分别与同样经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pcNDA3.1(+)连接，构建重组真核表达载体，即重组质粒R1353和R1303。然后，将重组质粒R1353和R1303分别转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃培养16h后挑取单菌落进行质粒提取，将提取后的质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用。
实施例3空白HIV-1 Gag-eVLP及Claudin 18.2-eVLP在HEK293细胞中的表达
3.1空白HIV-1 Gag-eVLP在HEK293细胞中的表达
使用PEI转染试剂将构建好的重组质粒R1242转染HEK293细胞(对应细胞ID为R1242)，进行空白对照eVLP的表达和组装。转染前一天将HEK293细胞按照1×10^6个细胞/mL传代，37℃培养。转染当天进行计数， 调整细胞密度为2×10^6个细胞/mL，活率95％以上。
根据细胞密度计算转染复合物中各组分的用量：质粒剂量与细胞的数量对应关系为1×10^6个细胞对应0.6μg质粒，PEI剂量与质粒剂量的对应关系为：PEI的质量为DNA质量的3倍。
根据上述计算得到的组分用量配置转染复合物：将1.2mg浓度为200μg/mL的重组质粒加入CD 293TGE培养基(Acrobiosystems；货号CM-1156-11)至50mL(A液)，3.6mg浓度为1mg/mL的PEI转染试剂加入CD 293TGE培养基至50ml(B液)，分别混匀后，将B液缓慢加入至A液中，混匀，室温静置10-15min后，将转染混合液缓慢滴加入1000mL HEK293细胞中。37℃，5％CO 2，135rpm培养48h后，收集R1242的培养上清。
3.2 Claudin 18.2-eVLP在HEK293细胞中的表达
使用PEI转染试剂将构建好的重组质粒按照比例R1303:R1221＝2:1、R1353:R1242＝2:1分别转染HEK293细胞(获得对应细胞ID分别为RG288(转染有R1303和R1221)和RG341(转染有R1353和R1242))，进行eVLP的表达和组装。转染前一天将HEK293细胞按照1×10^6个细胞/mL传代，37℃培养。转染当天进行计数，调整细胞密度为2×10^6个细胞/mL，活率95％以上。
根据细胞密度计算转染复合物中各组分的用量：质粒剂量与细胞的数量对应关系为1×10^6个细胞对应0.6μg质粒，PEI剂量与质粒剂量的对应关系为：PEI的质量为DNA质量的3倍。
根据上述计算得到的组分用量配置转染复合物：将1.2mg浓度为200μg/mL的重组质粒加入CD 293TGE培养基至50mL(A液)，3.6mg浓度为1mg/mL的PEI转染试剂加入CD 293TGE培养基至50ml(B液)，分别混匀后，将B液缓慢加入至A液中，混匀室温静置10-15min后，将转染混合液缓慢滴加入1000mL HEK293细胞中。37℃，5％CO 2，135rpm培养48h后，分别收集RG288和RG341的培养上清。
实施例4空白eVLP和Claudin 18.2-eVLP的分离纯化
将收获的R1242、RG288和RG341细胞上清液，分别进行2000rpm，4℃离心20min去除细胞碎片并用0.22μm滤膜过滤，进行蔗糖密度梯度离心，上清经30％蔗糖密度超速离心(2,6000rpm/min，4℃1.5h)，沉淀用PBS重悬，分别得到R1242、RG288和RG341eVLP粗纯样品。分别取样进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示，其中泳道A为R1242粗纯样品，泳道B为RG288粗纯样品，泳道C为RG341粗纯样品。从电泳结果可以清晰的看到Gag(约55kDa)和Gag-GFP(约80kDa)的目标条带，证明上清经30％蔗糖垫密度超速离心后可以收获大量的VLP。为了去除残留的核酸，将R1242、RG288和RG341粗纯样品分别在室温下用酶浓度为200U/mL的Benzonase(ACROBiosystems)处理1小时。核酸去除后的样品分别用 ExplorerTM 100低压液相色谱***(GE Healthcare)进行SEC实验，将Sepharose 6FF树脂装入XK 16/70色谱柱(GE Healthcare)，最终床体积为130mL。使用Blue Dextran 2000(HMW校准试剂盒，GE Healthcare)测定色谱柱的空体积。在eVLP分离之前，用3个柱体积的脱气Milli-Q超纯水清洗柱子，用1个柱体积的PBS，pH 7.4以2mL/min(60cm/h)的速度进行柱平衡。
将上述得到的R1242、RG288和RG341粗纯样品注入上样环中，使用PBS(pH 7.4)等速洗脱，流速为2mL/min(60cm/h)。在280nm和260nm处在线测定吸光度。在整个色谱过程中，使用Frac 950样品收集器(GE Healthcare)收集样品，并取样进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示，其中图A为R1242，图B为RG288，图C为RG341。根据电泳结果可以看出经粗纯样品SEC分离后，均可以获得高纯度样品(箭头所指)。根据电泳结果回收高纯度的样品，即为eVLP，样品ID分别记为R1242-210521F1、RG288-210503F1和RG341-210521F1。
实施例5病毒样颗粒的形态学检测
为了进一步确认实施例4的方法能成功制备eVLP，对R1242-210521F1进行透射电镜形态学检测(委托北京中科百测技术服务有限公司)，结果见图4。可以看出R1242-210521F1在电镜下呈现为直径约150nm的空心球体。电镜照片结果从宏观上证明了实施例4的方法可以成功制备以HIV-1 Gag为骨架蛋白的eVLP。
实施例6 Claudin 18.2-eVLP与抗体IMAB362的活性检测
本实施例中采用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法检测本公开Claudin 18.2-eVLP与其特异抗体IMAB362的结合活性，以此证明Claudin 18.2四次跨膜蛋白以正确的构象成功展示在eVLP上。具体步骤如下：
1、包被：用0.5μg/孔(5μg/ml，100μl/孔)的RG288-210503F1或RG341-210521F1包被96孔板(Corning公司，货号：42592)，在4℃包被过夜(或16h)。RG288-210503F1或RG341-210521F1稀释所用包被缓冲液为15mM Na 2CO 3，35mM NaHCO 3，7.7mM NaN 3，pH9.6。
2、洗涤：用每孔300μl的洗涤缓冲液(TBS，0.05％Tween-20，pH7.4)洗涤孔4次(注：彻底清除洗涤缓冲液很关键)。洗完之后通过抽吸除去残留的溶液，并确保其完全干燥。
3、封闭：在37℃条件下，每孔用300μl封闭缓冲液(TBS，2％BSA，pH7.4)封闭1.5h。
4、洗涤：重复步骤2。
5、添加样品：每孔加入100μl 0.390625-50ng/mL IMAB362抗体，37℃孵育1h。样品提前用稀释缓冲液(含有0.5％BSA的TBS缓冲液，pH7.4)进行稀释。
6、洗涤：重复步骤2。
7、添加检测抗体：向每个孔中加入100μl anti-human IgG抗体(Jackson，货号：109-035-098)，37℃孵育1h。抗体提前用稀释缓冲液(含有0.5％BSA的TBS缓冲液，pH7.4)以1:20000比例进行稀释。
8、洗涤：重复步骤2。
9、添加底物：向各孔中加入200μl底物溶液，37℃孵育20min。避光。底物溶液配置：在10ml底物溶液(50mM Na 2HPO 4·12H 2O，25mM柠檬酸，pH5.5)中加入8μl 3％H 2O 2和100μl 10mg/ml TMB(BBI Life sciences，货号：A600954)。
10、终止反应：向各孔中加入1M硫酸50μl。
11、读取OD值：在450nm处读取OD值，然后OD450-ODBlank为最终的OD值。其中ODBlank对应的孔为步骤5中不添加样品仅添加等体积稀释缓冲液的测定结果，作为空白对照。
ELISA检测结果如图5所示，其中图A为RG288-210503F1和IMAB362结合的ELISA检测结果；图B为RG341-210521F1和IMAB362结合的ELISA检测结果。本公开Claudin 18.2-eVLP RG288-210503F1和RG341-210521F1与IMAB362结合的EC50值分别为1.64ng/mL和1.94ng/mL，表明本公开的Claudin 18.2-eVLP与IMAB362具有很好的结合活性，从而证明Claudin 18.2四次跨膜蛋白以正确的构象成功展示在eVLP上。
实施例7 IMAB362 CAR-like(HEK293)细胞的准备
本实施例中，模仿CAR-T细胞，制备IMAB362 CAR-like(HEK293)细胞，来验证Claudin 18.2-eVLP在评估CAR阳性表达率中的应用。
7.1IMAB362 CAR-like重组质粒的制备
IMAB362 CAR结构如图6所示。其对应的氨基酸序列为6，多核苷酸序列为SEQ ID No.11。质粒构建方法参考实施例1。
7.2IMAB362 CAR-like(HEK293)细胞的制备
IMAB362 CAR重组质粒转染HEK293细胞的工艺参考实施例3。不同的是本实施例中需要通过G418抗性筛选出IMAB362 CAR-like(HEK293)单克隆细胞，标记ID为C633，用于CAR阳性表达率评估实验。
实施例8 Claudin-18.2-eVLP用于CAR阳性表达率评估
本实施例中分别使用抗Fab抗体FITC-anti mFab Ab(Thermo Scientific,Cat.No.31543))、FITC-Protein L(ACROBiosystems,Cat.No.RPL-PF141)、Claudin 18.2胞外loop区蛋白：Claudin-18.2 Protein,His Tag TM(ACROBiosystems,Cat.No.CL2-H51H6)以及本公开的R1242-210521F1、RG288-210503F1和RG341-210521F1评估IMAB362 CAR表达情况。具体步骤如下：
1、在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养C633细胞，置于CO 2培养箱中(37℃，5％CO 2)。
2、收集细胞，用FACS缓冲液(2％BSA)清洗细胞一次。
3、计数细胞数量和活率，将2×10^6活细胞放入每管中。
4、将FITC-anti mFab Ab、FITC-Protein L、Claudin-18.2 Protein,His Tag TM、R1242-210521F1、RG288-210503F1和RG341-210521F1分别用FACS缓冲液(2％BSA)进行梯度稀释，然后将稀释后的样品溶液分别加入到含有细胞的管中。混合均匀，4℃孵育60min。(针对Claudin-18.2 Protein,His Tag TM，孵育后用FACS缓冲液(2％BSA)洗涤细胞1次，加入PE-anti His antibody(Biolegend,Cat.No.362603)，4℃孵育避光60min。)
5、用FACS缓冲液(2％BSA)洗涤细胞3次，最后细胞样品用0.2mLPBS重悬。
6、将细胞悬液转入流管，并用流式细胞仪进行检测(激发波长488nm，发射波长530nm)。
7、使用FCS Express 6Plus和GraphPad Prism 5软件对结果数据进行分析。
结果如图7所示，其中图A为当FITC-anti mFab Ab稀释200倍时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况(阳性率为95.93％)；图B为当FITC-Protein L使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况(阳性率为64.70％)；图C为当Claudin-18.2 Protein,His Tag TM使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况(阳性率为1.17％)，说明仅表达Claudin 18.2的胞外loop区，无法识别IMAB362 CAR-like结构；图D为当RG288-210503F1使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况(阳性率为99.52％)；图E为当RG341-210521F1使用浓度为10μg/mL时，其评估IMAB362 CAR-like表达情况(阳性率为99.60％)(R1242-210521F1为空白对照eVLP)。
从结果中可以看出，本公开Claudin18.2-eVLP上展示的Claudin18.2靶抗原构象正确，可以特异性的结合IMAB362 CAR-like，在通过FACS检测GFP的方法检测CAR阳性表达率情况时，表现出最佳效果。结果表明，本公开的含有绿色荧光蛋白GFP的Claudin 18.2-eVLP非常适用于评估CAR阳性表达率。
实施例9 CD20-eVLP用于CAR阳性表达率评估
为了验证本公开的技术方案可以应用于其他多次跨膜蛋白的制备，进而应用于其他靶向多次跨膜蛋白的CAR阳性率表达评估，本实施例针对另一种多次跨膜蛋白CD20，采用本公开的纳米颗粒，进行了CAR阳性表达率评估。具体步骤如下：
1、人CD20-eVLP的制备：根据实施例2的方法构建含有CD20编码基因的重组质粒，其中，CD20的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，其编码序列如SEQ ID No.16所示；根据实施例3的方法，将含有CD20编码基因的重组质粒与R1424质粒2：1混合转染HEK293细胞并收集培养上清；根据实施例4的方法分离纯化，制备得到的CD20-eVLP样品ID为RG344-210628F1；
2、Ofatumumab CAR-like(HEK293)细胞的准备，制备方法参考实施例7；其中，Ofatumumab CAR的氨基酸序列为SEQ ID No.17，多核苷酸序列为SEQ ID No.18；制备得到的Ofatumumab CAR-like(HEK293)单克隆细胞，标记ID为RC539b，用于CAR阳性表达率评估实验；
3、CD20-eVLP用于CAR阳性表达率评估验证，具体方法参考实施例8。
结果如图8所示，当RG344-210628F1使用浓度为20μg/mL时，其评估Ofatumumab CAR-like(HEK293)表达情况(阳性率为99.48％)(R1242-210521F1为空白对照eVLP)。
从结果中可以看出，本公开CD20-eVLP上展示的CD20靶抗原构象正确，可以特异性的结合Ofatumumab CAR-like细胞克隆，在通过FACS检测GFP的方法检测CAR阳性表达率情况时，表现出>99％的阳性率效果。该结果进一步表明本公开的技术手段可以广泛的适用于多次跨膜蛋白-eVLP的制备，进而应用于CAR阳性率表达评估。

Claims (10)

  1. 一种纳米颗粒，其包含：
    (i)包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段；和
    (ii)靶点蛋白和/或其功能片段，
    其中，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白包含病毒核心蛋白或其功能片段，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白或其功能片段组装形成包膜病毒样颗粒，所述靶点蛋白和/或其功能片段展示在包膜病毒样颗粒上，形成靶点蛋白-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述靶点蛋白是CAR靶点蛋白；所述CAR靶点蛋白和/或其功能片段展示在包膜病毒样颗粒上，形成CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
  2. 权利要求1的纳米颗粒，其中，所述的病毒核心蛋白选自：逆转录病毒Gag蛋白、杆状病毒基质蛋白M蛋白、线状病毒核心蛋白、冠状病毒M、E和NP蛋白、流感病毒M1蛋白、副粘病毒M蛋白、呼吸道合胞病毒(RSV)M蛋白、沙粒病毒Z蛋白、新城疫病毒M蛋白、副流感病毒M蛋白、布尼亚病毒N蛋白、丙型肝炎病毒核心蛋白C、乙型肝炎病毒核心蛋白C和其组合物；
    优选地，所述逆转录病毒Gag蛋白选自：人类免疫缺陷病毒Gag蛋白、猴免疫缺陷病毒Gag蛋白、小鼠白血病病毒Gag蛋白和牛白血病病毒Gag蛋白；更优选地，所述人类免疫缺陷病毒Gag蛋白包含与SEQ ID No.1具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：更优选地，所述人类免疫缺陷病毒Gag蛋白的氨基酸序如SEQ ID No.1所示；
    优选地，所述杆状病毒基质蛋白M蛋白为水疱性口炎病毒M病毒核心蛋白；
    优选地，所述线状病毒核心蛋白为埃博拉病毒VP40病毒核心蛋白；
    优选地，所述冠状病毒核心蛋白选自新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-Cov、229E、NL63、OC43和HKU1的核心蛋白。
  3. 权利要求1或2的纳米颗粒，其中，所述CAR靶点蛋白为膜蛋白，
    优选地，所述膜蛋白包括跨膜蛋白；更优选地，所述跨膜蛋白包括多次跨膜蛋白；
    优选地，所述CAR靶点蛋白选自CD20、Claudin18.1、Claudin18.2、CD133、GPRC5D、CCR5、CCR8、BCMA、GPCR、CD147、CD19、CD123、CD138、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CAIX、EGFR、EGFRVIII、FOLR1、GPC3、HER2、HGFR、Anti-FMC63 Ab、CLL-1、SLAMF7、CD4、CD5、CD8A&CD8B、FAP、IL13RA2、GPC3、GUCY2C、Her3、PSMA、ROR1、SLAMF7、B7-H3、CD147、CEA、MUC16、Nectin-4、VEGFR2、Anti-RTX Ab、B7-H3、CAIX、CD7、CEA、MUC1、NKG2D、PSCA、uPAR、GD2、FR、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、CD44v7/8、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、间皮素、IGFR1、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG、PROGRP或MSLN中任一种；
    优选地，所述CAR靶点蛋白选自CD20、Claudin18.2、CD133、GPRC5D、CCR5、CCR8、CD19、BCMA、GPC3、CD30、CD22、EGFR、EGFRVIII、HER2或GPCR中任一种；
    更优先地，所述CAR靶点蛋白为Claudin18.2；优选地，所述Claudin18.2的氨基酸序列包含与SEQ ID No.4具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：更优选地，所述Claudin18.2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
    更优先地，所述CAR靶点蛋白为CD20；优选地，所述CD20的氨基酸序列包含与SEQ ID No.15具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：更优选地，所述Claudin18.2的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
  4. 权利要求1-3任一项所述的纳米颗粒，其中，所述CAR靶点蛋白和/或其功能片段和/或所述病毒核心蛋白和/或其功能片段与标记物相连接；
    优选地，所述CAR靶点蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端和/或病毒核心蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端与标记物相连接；更优选地，在Claudin 18.2的C末端或Gag的C末端用标记物进行标记；更优选地，在CD20的C末端或Gag的C末端用标记物进行标记；
    优选地，所述标记物选自可检测标记物、纯化标签、报告标签和其组合物；
    优选地，所述可检测标记物选自荧光基团、化学发光标记物、电化学发光标记物和其组合物；
    优选地，所述荧光基团选自FITC、GFP、RFP、YFP、TRITC、PE、FAM、RRX、TR、Cy2、Cy3、Cy5、ECD、PC5.5、PC7、APC、APC-A70、APC-A75、Pac-Blue、Alexa488、mBBr、5-IAF、E-118、DTAF、罗丹明绿和KrO中的任一种；
    优选地，所述化学发光标记物为吖啶酯、异鲁米诺、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；
    优选地，所述电化学发光标记物为三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺酯；
    优选地，所述纯化标签选自HIS-Tag、GST-Tag、MBP-Tag、NusA-Tag、FLAG-Tag、SUMO、Avi-Tag、Halo-Tag和SNAP-Tag中的任一种；
    优选地，所述纯化标签通过二抗检测；
    优选地，所述报告标签选自c-Myc、HA或荧光素酶中的任一种。
  5. 权利要求1-4任一项所述的纳米颗粒，其中，所述CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒选自Claudin 18.2-eVLP纳米颗粒或CD20-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述Claudin 18.2和/或其功能片段和/或所述病毒核心蛋白和/或其功能片段与标记物相连接；
    优选地，所述CD20和/或其功能片段和/或所述病毒核心蛋白和/或其功能片段与标记物相连接；
    优选地，所述Claudin 18.2和/或其功能片段的N末端和/或C末端和/或病毒核心蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端与标记物相连接；
    优选地，所述CD20和/或其功能片段的N末端和/或C末端和/或病毒核心蛋白和/或其功能片段的N末端和/或C末端与标记物相连接；
    优选地，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白为Gag蛋白；
    优选地，所述Claudin 18.2的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连接；
    优选地，所述CD20的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连接；
    优选地，所述标记物为GPF；
    优选地，所述GFP的氨基酸序列包含与SEQ ID No.2具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
    优选地，所述Gag蛋白的C末端与标记物GFP相连(Gag-GFP)，其氨基酸序列包含与SEQ ID No.3具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：更优选地，所述Gag-GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
    优选地，所述Claudin 18.2的C末端与标记物GFP相连(Claudin 18.2-GFP)，其氨基酸序列与SEQ ID No.5具有至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：更优选地，所述Claudin 18.2-GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
  6. 权利要求1-5任一项所述的纳米颗粒的制备方法，其包括：
    (1)重组质粒的构建：
    分别构建包含包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段基因的重组质粒和靶点蛋白和/或其功能片段基因的重组质粒；或，构建同时包含包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段基因和靶点蛋白和/或其功能片段基因的重组质粒；和
    (2)细胞转染、蛋白表达和颗粒组装：
    将步骤(1)构建的包膜病毒样颗粒(eVLP)骨架蛋白和/或其功能片段重组质粒和靶点蛋白和/或其功能片段重组质粒转染细胞，表达包膜病毒样颗粒骨架蛋白和/或其功能片段和靶点蛋白和/或其功能片段；所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白或其功能片段组装形成包膜病毒样颗粒，所述靶点蛋白和/或其功能片段展示在包膜病毒样颗粒上，形成靶点蛋白-eVLP纳米颗粒；以及，任选地，
    (3)纯化靶点蛋白-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述GAG的编码核酸序列包含与SEQ ID No.7具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；
    优选地，所述Gag-GFP编码核酸序列包含与SEQ ID No.8具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；
    优选地，所述Claudin 18.2的编码核酸序列包含与SEQ ID No.9具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；
    优选地，所述Claudin 18.2-GFP的编码核酸序列包含与SEQ ID No.10具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；
    优选地，所述CD20的编码核酸序列包含与SEQ ID No.16具有至少80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列：更优选地，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
  7. 权利要求6的制备方法，所述的细胞选自原核宿主细胞或真核宿主细胞；
    优选地，所述原核宿主细胞为细菌细胞、枯草芽孢杆菌和分枝杆菌中的任一种；优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌；
    优选地，所述真核宿主细胞选自动物细胞、植物细胞或真菌中的任一种；
    优选地，所述真核宿主细胞选自酵母、昆虫、禽类、植物、秀丽隐杆线虫和哺乳动物宿主细胞中的任一种；
    优选地，所述昆虫细胞选自草地夜蛾细胞(例如Sf9、Sf21)、粉纹夜蛾细胞(例如High Five细胞)和果蝇S2细胞中的任一种；
    优选地，所述真菌选自酿酒酵母、乳克鲁维酵母、假丝酵母属物种(例如白色假丝酵母或光滑假丝酵母)、构巢曲霉、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、和解脂耶罗酵母中的任一种；
    优选地，所述哺乳动物细胞选自COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞(例如HEK293细胞)、633细胞、Vero、BHK细胞、非洲绿猴细胞、CV1细胞、HeLa细胞、MDCK细胞和Hep-2细胞中的任一种。
  8. 一种检测CAR阳性表达率的方法，其包括：将权利要求1-5任一项所述的纳米颗粒或权利要求6或7所述方法制备的纳米颗粒与CAR修饰的细胞孵育，然后进行检测；优选地，在细胞孵育后、进行检测前洗涤细胞；
    优选地，所述CAR修饰的细胞选自CAR-like(HEK293)细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-M细胞、CAR-NKT细胞、CAR-Treg细胞及CAR-γδT细胞中的任一种；
    优选地，所述孵育的温度为2℃-40℃，优选37℃，和/或，所述孵育的时间为15min-2小时，优选1小时；和/或，所述孵育的CO 2的浓度为2％-8％，优选5％；
    优选地，所述洗涤的次数为1-6次，优选3次；
    优选地，所述洗涤缓冲液为0.5％-5％BSA，优选2％BSA；
    优选地，所述检测选自流式细胞术检测、免疫检测、ELISA、SPR、BLI中的任一种。
  9. 权利要求8所述的方法，其包括将Claudin 18.2-eVLP纳米颗粒或CD20-eVLP纳米颗粒与CAR修饰的细胞孵育，然后进行检测；
    优选地，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白为Gag蛋白；
    优选地，所述Claudin 18.2的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连接；
    优选地，所述CD20的C末端或所述Gag蛋白的C末端与标记物相连接。
  10. 一种试剂盒，其包含权利要求1-5任一项所述的纳米颗粒或权利要求6或7所述方法制备的纳米颗粒；
    优选地，所述纳米颗粒是CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述试剂盒包含带标记物的CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述试剂盒包含带标记物的Claudin 18.2-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述试剂盒包含带标记物的CD20-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述试剂盒为ELISA试剂盒、SPR试剂盒或BLI试剂盒；
    优选地，所述ELISA试剂盒包含所述CAR靶点蛋白-eVLP、酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液；
    优选地，所述SPR试剂盒包含所述CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒；
    优选地，所述BLI试剂盒包含所述CAR靶点蛋白-eVLP纳米颗粒。
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