CN115058406B - 一种对硝基苄基酯酶突变体、编码基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对硝基苄基酯酶突变体、编码基因，及其在酶催化dl‑薄荷酯手性拆分制备l‑薄荷醇中的应用。本发明的有益效果主要体现在：①本发明酯酶突变体无需添加助溶剂，酶催化活性维持较高水平；②在无助溶剂体系下，突变体酶催化的立体选择性较野生型和F314E突变型显著提高，将该突变体酶通过大肠杆菌过量表达后用于催化反应，并以10～200g/L的dl‑乙酸薄荷酯为底物，进行水解拆分制备l‑薄荷醇，结果表明l‑乙酸薄荷酯底物转化率>93％，产物l‑薄荷醇的eep值>98％，表现出良好的工业应用性能。

Description

一种对硝基苄基酯酶突变体、编码基因及应用
(一)技术领域
本发明涉及对硝基苄基酯酶突变体及其编码基因，以及其在酶催化dl-薄荷酯手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。
(二)背景技术
l-薄荷醇又名5-甲基-2-异丙基-环己醇，具有的独特薄荷香气和清凉效果，具有兴奋、杀菌镇痛、止痒、芳香清凉等功能，在香精香料、日用精细化学品、医疗卫生和化妆品等工业方面表现出非常多的应用。l-薄荷醇每年的市场需求超过4万吨，2019年l-薄荷醇的市场成交额超过276亿元，专家预计2026年将达到385亿元。
l-薄荷醇的生产方法包括植物提取法、化学合成法和生物酶手性拆分法等。目前l-薄荷醇出口最高达到国内生产的60％左右，其中天然提取的l-薄荷醇占了80％，合成的l-薄荷醇所占比例很少。天然提取l-薄荷醇香气浓郁。目前比较认可的天然提取法主要是超临界萃取法，超临界CO2法具有操作过程无水无氧环境、工艺温度低、产率高、操作温度低、操作简单、无毒无害等优点，但是天然提取原料受自然环境，产量因素影响较大，总产量无法满足工业需求。现阶段l-薄荷醇的合成生产主要是化学合成法，并且在不断的优化和成熟。随着生物技术越来越进步，以生物酶法合成l-薄荷醇的技术也被探索并完善。生物催化剂与化学催化剂相比，具有环境友好，可生物降解，高效率，高选择性等优点，且生物催化反应条件温和，反应消耗的能量低，成本少，无毒害，所以生物催化纷纷替代一些化学催化成为当今的研究热点，以高效的形式大大降低生产成本的同时符合绿色的发展方向，因此以成熟的酶法合成工艺路线制备l-薄荷醇未来必将有广阔的市场前景，具有很大的研究意义。
现有一个来源枯草芽孢杆菌的酯酶，在水解dl-乙酸薄荷酯手性拆分制备l-薄荷醇中具备良好的优点，包括反应速率快，底物投料量大等，但是其缺点是酶的立体选择性不高，且需要添加助溶剂如乙醇或丁醇等来提高酶的催化速率和催化的立体选择性。因此需要对该酯酶进行定向改造，提高其应用性能。
随着酶的晶体结构不断被解析，基于生物信息学的计算模拟技术的不断改进，结合酶的性质和催化机理，理性分析并设计改造酶与底物结合的相关作用氨基酸位点，从而筛出优势酶以达到高底物转化率和高产物纯度的可行性显著提高。大量酯酶和脂肪酶经过人工改造，提高了酶热稳定性，提高了酶的催化反应活性，改进了底物特异性以及提高了对映体选择性等。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种立体选择性好的对硝基苄基酯酶突变体及其编码基因，，以及其在酶催化dl-薄荷酯手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种对硝基苄基酯酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型对硝基苄基酯酶经第314位氨基酸经定点饱和突变、第315位氨基酸经迭代饱和突变而得。
优选的，所述对硝基苄基酯酶突变体(F314E-F315T)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.2所示的野生型对硝基苄基酯酶(PNB)来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC No.17904(CN 110373366A)，可对dl-薄荷酯实现高效地手性拆分以制备l-薄荷醇。该酶的优点是其水解速率快，dl-薄荷酯底物投料量高等。但是，该酶催化过程中，需要有机助溶剂且酶催化的底物立体选择性较低。
将野生型对硝基苄基酯酶与底物乙酸薄荷酯进行对接，结果如图2所示，活性口袋周围存在一个Phe314位点与底物存在疏水作用力并影响着活性口袋的形状大小，通过改变该残基，从而达到增大结合口袋体积并且影响残基侧链效应的效果，使得不同底物的异构体与酶结合上造成差异，从而提高酶选择性。接着，将优选突变株F314E对硝基苄基酯酶与底物乙酸薄荷酯进行对接，结果如图3所示，活性口袋周围存在一个Phe315位点与底物存在疏水作用力，通过改变该残基，以达到提高酶选择性的效果。
本发明还涉及所述对硝基苄基酯酶突变体的编码基因。
所述的酯酶突变体PNB-F314E-F315T的编码基因，可以根据其氨基酸序列进行密码子优化后合成的基因序列，亦可从B.subtilis CGMCC No.17904菌株基因组PCR扩增后突变改造的基因序列。优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组表达载体。这些重组载体可以用本领域常规方法将本发明的对硝基苄基酯酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，例如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。
本发明还涉及含有所述编码基因的工程菌。作为一种重组表达载体的应用，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得基因工程菌。宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，主要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的对硝基苄基酯酶突变体基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
本发明还涉及所述对硝基苄基酯酶突变体在酶催化dl-薄荷酯手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。
具体的，所述应用为：构建含有所述突变体编码基因的重组菌，以重组菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶细胞为催化剂，对dl-薄荷酯进行水解，获得l-薄荷醇。
可将该酯酶突变体PNB-F314E-F315T的基因克隆到表达质粒，并转化到宿主细胞中，经过诱导发酵制作成酯酶制剂后，用于催化dl-薄荷酯选择性水解制备l-薄荷醇。所述的表达质粒和宿主细胞，优选pET28a质粒和大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，即构建重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-PNB-F314E-F315T)。
所述水解可在无溶剂条件下进行。
优选的，水解反应体系中，细胞密度为5～30OD(优选20OD)，dl-乙酸薄荷酯用量为1％～20％(w/w)(优选15％)，水解过程控制pH6.5～8.5(优选pH8.0)、温度25℃～40℃(优选30℃)。
所述dl-薄荷酯优选为dl-乙酸薄荷酯。本发明酯酶突变体，在无助溶剂体系下，催化水解1％～20％的dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇，其产物l-薄荷醇的eep值>98％。
本发明的有益效果主要体现在：①本发明酯酶突变体无需添加助溶剂，酶催化活性维持较高水平；②在无助溶剂体系下，突变体酶催化的立体选择性较野生型和F314E突变型显著提高，将该突变体酶通过大肠杆菌过量表达后用于催化反应，并以10～200g/L的dl-乙酸薄荷酯为底物，进行水解拆分制备l-薄荷醇，结果表明l-乙酸薄荷酯底物转化率>93％，产物l-薄荷醇的eep值>98％，表现出良好的工业应用性能。
(四)附图说明
图1为l-薄荷醇、d-薄荷醇、dl-薄荷醇、dl-乙酸薄荷酯的结构示意图。
图2为酯酶PNB的底物结合口袋和相关作用位点示意图。
图3为酯酶PNB-F314E的底物结合口袋和相关作用位点示意图。
图4为dl-乙酸薄荷酯、dl-薄荷醇标准样品的GC色谱图。
图5为酯酶突变体F314E-F315T催化dl-乙酸薄荷酯水解拆分制备l-薄荷醇的催化反应液的GC色谱图。
图6为野生型菌株314位点饱和突变后，各突变株的酶活和底物对映体选择性比较。
图7为F314E突变株315位点饱和突变后，各突变株的酶活和底物对映体选择性比较。
图8为底物投料2％时，F314E-F315C和F314E-F315T突变株的酶活比较。
图9为底物投料6％时，F314E-F315C和F314E-F315T突变株的酶活比较。
图10为底物投料14％时，F314E-F315C和F314E-F315T突变株的酶活比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为蒸馏水。
发酵培养基：酵母粉12.0g/L、蛋白胨15.0g/L、Na2HPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.49g/L、卡那霉素50μg/L、pH7.0，溶剂为蒸馏水。
pH 8.0磷酸缓冲溶液(200mM)：Na2HPO4·12H2O 67.8g/L，NaH2PO4·2H2O 0.82g/L，溶剂为蒸馏水。
实施例1：酯酶PNB基因的诱导表达
将菌株E.coli IEF-PNB从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。按照0.5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为1.0mM的IPTG，调整培养温度24℃，继续发酵8h，得到过量表达酯酶PNB的菌剂。
实施例2：酯酶PNB突变位点的设计和突变体的构建与筛选
为了提高酯酶PNB在无助溶剂体系下的底物立体选择性，采用计算机辅助设计选择PNB的定点突变位点。根据已报道枯草芽孢杆菌来源的酯酶晶体结构(PDB ID：1QE3)，对菌株B.subtilis CGMCC No.17904来源的酯酶PNB进行同源建模。利用蛋白质三维结构分析软件和分子对接软件，进行模拟分析。综合考虑酯酶与底物对接结果、酶的底物结合口袋特点、酶识辨底物立体选择的结构特点、酶的催化机制，最终对氨基酸序列SEQ ID NO.2的第314位点的苯丙氨酸残基功能预测：该位点处于酶催化结合口袋入口处，与底物以疏水作用力相互作用，这也是确定酶的立体选择性的关键位点。酶与底物l-薄荷乙酸酯结合关系如图2所示(与口袋里面的底物以疏水作用力相连的为靠近褐色疏水口袋的314位点苯丙氨酸)。因此，SEQ ID NO.2第314位的氨基酸被优先作为突变分析位点。
根据SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，设计第314位氨基酸的饱和突变引物，见表1所示。以载体pET28a-pnbA为模板，进行PCR扩增整个质粒，经过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小正确的扩增条带。用限制性内切酶DpnI酶消化处理PCR产物1h，消化甲基化的质粒模板。将消化后的PCR产物进行一步克隆法进行连接反应，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，经过菌落PCR验证和测序验证，即获得了目标位点发生突变的酯酶突变体。
表1：基于多序列比对结果的突变引物设计表
实施例3：第314位氨基酸的饱和突变体库的筛选
在SEQ ID NO.2所述第314氨基酸位点通过定点突变获得19种突变体，且在相同催化条件下评价突变酶的催化活性和对底物立体选择性的差异。将平板上的转化子转移到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养至对数生长中期。再按1％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为0.5mM的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵8h，得到诱导表达后的菌剂。
取培养好的含酯酶突变体的菌剂2mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH8.0的200mM磷酸缓冲液中；加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于GC分析。
PNB和19个PNB突变体的酶活和底物立体选择性的分析结果如图6所示。综合考虑底物选择性与酶的催化速率，F314E突变株为优选突变体。
实施例4：酯酶PNB-F314E催化水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇的活性分析
取上述方法制备的酯酶PNB-F314E菌剂12mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于6mL的pH8.0的200mM磷酸缓冲液中；将重悬液分装6管，每管加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于GC分析。
催化液的GC分析结果如表2所示，随着反应时间的延长，dl-乙酸薄荷酯的转化率越来越高。
表2：无助溶剂体系下PNB-F314E酶催化结果
催化液取样的GC分析方法：
1)样品前处理：500μL催化反应液，加入到同等比例的乙酸乙酯混合萃取；12000×g离心1min，取上清有机相用于色谱分析。
2)气相色谱检测条件：色谱柱：安捷伦CYCLODEX-B 60m×0.250mm。升温程序：100℃，保持3min；2.5℃/min升温至145℃，保持1min；1℃/min升温至160℃，保持1min。检测器：FID检测器；产物l-薄荷醇出峰时间约33min，底物薄荷酯出峰时间约35min，dl-乙酸薄荷酯、dl-薄荷醇标准品的GC色谱图如图4所示，从左到右分别为d-薄荷醇、l-薄荷醇、l-乙酸薄荷酯、d-乙酸薄荷酯。
实施例5：酯酶PNB-F314E突变位点的设计和突变体的构建与筛选
为了进一步提高酯酶PNB的底物选择性，利用蛋白质三维结构分析软件和分子对接软件，进行模拟分析。综合考虑酯酶与底物对接结果、酶的底物结合口袋特点、酶识辨底物立体选择的结构特点、酶的催化机制，最终对氨基酸序列SEQ ID NO.3的第315位点的苯丙氨酸残基功能预测：该位点与底物以疏水作用力相互作用，影响酶的立体选择性。酶与底物l-薄荷乙酸酯结合关系如图3所示(口袋外面的棍棒结构为靠近结合口袋的315位点苯丙氨酸)。因此，SEQ ID NO.3第315位的氨基酸被优先作为突变分析位点。
根据SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，设计第315位氨基酸的饱和突变引物，见表3所示。以载体pET28a-pnbA为模板，进行PCR扩增整个质粒，经过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小正确的扩增条带。用限制性内切酶DpnI酶消化处理PCR产物1h，消化甲基化的质粒模板。将消化后的PCR产物进行一步克隆法进行连接反应，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，经过菌落PCR验证和测序验证，即获得了目标位点发生突变的酯酶突变体。
表3：基于多序列比对结果的突变引物设计表
实施例6：第315位氨基酸的饱和突变体库的初筛
在SEQ ID NO.3所述第315氨基酸位点通过定点突变获得19种突变体，且在相同催化条件下评价突变酶的催化活性和对底物立体选择性的差异。将平板上的转化子转移到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养至对数生长中期。再按1％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为0.5mM的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵8h，得到诱导表达后的菌剂。
取培养好的含酯酶突变体的菌剂2mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH8.0的200mM磷酸缓冲液中；加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于GC分析。
PNB-F314E和19个PNB-F314E突变体的酶活和底物立体选择性的分析结果如图7和表4所示。综合考虑底物选择性与酶的催化速率，F314E-F315C突变体和F314E-F315T突变株为优选突变体。
表4：PNB-F314E和19个PNB-F314E突变体的酶活和底物立体选择性比较
实施例7：第315位氨基酸的饱和突变体库的复筛
初筛得到了F314E-F315C和F314E-F315T两种优选突变株，将菌株E.coli IEF-PNB-F314E-F314C和E.coli IEF-PNB-F314E-F314T从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。按照0.5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为1.0mM的IPTG，调整培养温度24℃，继续发酵8h，得到酯酶突变株F314E-F315C和F314E-F315T的菌剂。
分别取酯酶突变株F314E-F315C和F314E-F315T发酵液菌剂48mL，10000×g，5min离心收集细胞，分别将细胞重新悬浮于24mL的pH8.0的200mM磷酸缓冲液中；将两种重悬液各分装24管，每管加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于GC分析。
在相同反应时间和底物投料量的情况下，酯酶突变株F314E-F315C和F314E-F315T的底物立体选择性仅有较小的区别，但是两种突变株对dl-乙酸薄荷酯的转化率有一定的差距。当底物投料量为2％时，酯酶突变株F314E-F315C和F314E-F315T的酶活的分析结果如图8所示；当底物投料量为6％时，酯酶突变株F314E-F315C和F314E-F315T的酶活的分析结果如图9所示；当底物投料量为14％时，酯酶突变株F314E-F315C和F314E-F315T的酶活的分析结果如图10所示。在这三种不同的底物浓度下，酯酶突变株F314E-F315T的反应速率均比酯酶突变株F314E-F315C的反应速率高，因此选择F314E-F315T突变株为复筛最优突变体。
实施例8：突变株F314E-F315T在水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇中的应用
酯酶突变株F314E-F315T的诱导表达。将菌株E.coli IEF-PNB-F314E-F315T从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。按照0.5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为1.0mM的IPTG，调整培养温度24℃，继续发酵8h，得到酯酶突变株F314E-F315T的菌剂。
将种子液按2％的接种量接入到含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，于37℃，200rpm摇床中培养4-6h后按5％的接种量接入到2.5L发酵罐中，在37℃进行发酵培养，当OD600nm达到10左右时，加入乳糖进行目的蛋白诱导表达，诱导温度为24℃，诱导12-16h。当发酵罐转速下降并出现pH上升时，终止发酵，离心收集细胞。
离心重悬菌体后，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液配置成OD为20的全细胞催化体系后倒入160mL于圆底烧瓶，于恒温水浴锅30℃条件下先孵育至稳定温度。待约10min后，水浴中菌液已达到恒定温度且稳定，圆底烧瓶中添加40mL dl-乙酸薄荷酯。立即开启磁力搅拌混合均匀，记录反应开始并计时。在催化反应过程中，用2M NaOH溶液调控反应pH8.0。于不同的时间点取样，反应液用于气相色谱分析，如图5所示，从左到右分别为d-薄荷醇、l-薄荷醇、l-乙酸薄荷酯、d-乙酸薄荷酯。不同反应时间下催化反应结果如表5所示，其中反应9h时，l-乙酸薄荷酯的eep≥98％。
表5：突变株F314E-F315T在不同反应时长下催化结果
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种对硝基苄基酯酶突变体、编码基因及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1470
<212> DNA
<213> B. subtilis
<400> 1
atgactcatc aaatagtaac gactcaatac ggcaaagtaa aaggcacaac ggaaaacggc 60
gtacataagt ggaaaggcat cccctatgcc aagccgcctg tcggacaatg gcgttttaaa 120
gcacctgagc cgcctgaagt gtgggaagat gtgcttgatg ccacagcgta cggctctatt 180
tgcccgcagc cgtctgattt gctgtcactt tcgtatactg agctgccccg ccagtccgag 240
gattgcttgt atgtcaatgt atttgcgcct gacaccccaa gtaaaaatct tcctgtcatg 300
gtgtggattc acggaggcgc tttttatcta ggagcgggca gtgagccatt gtatgacgga 360
tcaaaacttg cggcacaggg agaagtcatt gtcgttacat tgaactatcg gctggggccg 420
tttggctttt tgcacttgtc ttcatttaat gaggcgtatt ctgataacct tgggctttta 480
gaccaagccg ccgcgctgaa atgggtgcga gagaatattt cagcgtttgg cggtgatccc 540
gataacgtaa cagtatttgg agaatccgcc ggcgggatga gcattgccgc gctgcttgct 600
atgcctgcgg caaaaggcct gttccagaaa gcaatcatgg aaagcggcgc ttctcgaacg 660
atgacgaaag aacaagcggc gagcacctcg gcagcctttt tacaggtcct tgggattaac 720
gagggccaac tggataaatt gcatacggtt tctgcggaag atttgctaaa agcggctgat 780
cagcttcgga ttgcagaaaa agaaaatatc tttcagctgt tcttccagcc cgcccttgat 840
ccgaaaacgc tgcctgaaga accagaaaaa gcgatcgcag aaggggctgc ttccggtatt 900
ccgctattaa ttggaacaac ccgtgatgaa ggatatttat ttttcacccc ggattcagac 960
gttcattctc aggaaacgct tgatgcagcg ctcgagtatt tactagggaa gccgctggca 1020
gagaaagttg ccgatttgta tccgcgttct ctggaaagcc aaattcatat gatgactgat 1080
ttattatttt ggcgccctgc cgtcgcctat gcatccgcac agtctcatta cgcccctgtc 1140
tggatgtaca ggttcgattg gcacccgaag aagccgccgt acaataaagc gtttcacgca 1200
ttagagcttc cttttgtctt tggaaatctg gacggattgg aacgaatggc aaaagcggag 1260
attacggatg aggtgaaaca gctttctcac acgatacaat cagcgtggat cacgttcgcc 1320
aaaacaggaa acccaagcac cgaagctgtg aattggcctg cgtatcatga agaaacgaga 1380
gagacgctga ttttagactc agagattacg atcgaaaacg atcccgaatc tgaaaaaagg 1440
cagaagctat tcccttcaaa aggagaataa 1470
<210> 2
<211> 490
<212> PRT
<213> B. subtilis
<400> 2
Met Gly Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly
1 5 10 15
Thr Thr Glu Asn Gly Val His Lys Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys
20 25 30
Pro Pro Val Gly Gln Trp Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu Val
35 40 45
Trp Glu Asp Val Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gly Pro Ile Cys Pro Gln
50 55 60
Pro Ser Asp Leu Leu Ser Leu Ser Tyr Ala Glu Leu Pro Arg Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Cys Leu Tyr Val Asn Val Phe Ala Pro Asp Thr Pro Ser Gln
85 90 95
Asn Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Tyr Leu Gly
100 105 110
Ala Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Ala Ala Gln Gly
115 120 125
Glu Val Ile Val Val Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Pro Phe Gly Phe
130 135 140
Leu His Leu Ser Ser Phe Asp Glu Ala Tyr Ser Asp Asn Leu Gly Leu
145 150 155 160
Leu Asp Gln Val Ala Ala Leu Lys Trp Val Arg Glu Asn Ile Ser Ala
165 170 175
Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Gly Met Ser Ile Ala Ala Leu Leu Ala Met Pro Ala Ala Lys Gly Leu
195 200 205
Phe Gln Lys Ala Ile Met Glu Ser Gly Ala Ser Arg Thr Met Thr Lys
210 215 220
Glu Gln Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Phe Leu Gln Val Leu Gly Ile
225 230 235 240
Asn Glu Gly Gln Leu Asp Lys Leu His Thr Val Ser Ala Glu Asp Leu
245 250 255
Leu Lys Ala Ala Asp Gln Leu Arg Ile Ala Glu Lys Glu Asn Ile Phe
260 265 270
Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp Pro Lys Thr Leu Pro Glu Glu
275 280 285
Pro Glu Lys Ala Ile Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly Ile Pro Leu Leu
290 295 300
Ile Gly Thr Thr Arg Asp Glu Gly Tyr Leu Phe Phe Thr Pro Asp Ser
305 310 315 320
Asp Val His Ser Gln Glu Thr Leu Asp Ala Ala Leu Glu Tyr Leu Leu
325 330 335
Gly Gln Pro Leu Ala Lys Asn Ala Ala Asp Leu Tyr Pro Arg Ser Leu
340 345 350
Glu Ser Gln Ile Gln Met Met Thr Asp Leu Leu Phe Trp Arg Pro Ala
355 360 365
Val Ala Tyr Ala Ser Ala Gln Ser His Tyr Ala Pro Val Trp Met Tyr
370 375 380
Arg Phe Asp Trp His Pro Glu Lys Pro Pro Tyr Asn Lys Ala Phe His
385 390 395 400
Ala Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Arg
405 410 415
Met Ala Gln Ala Glu Ile Thr Asp Glu Val Lys Gln Leu Ser His Thr
420 425 430
Ile Gln Ser Ala Trp Ile Thr Phe Ala Lys Thr Gly Asn Pro Ser Thr
435 440 445
Glu Ala Val Asn Trp Pro Ala Tyr His Glu Glu Thr Arg Glu Thr Leu
450 455 460
Ile Leu Asp Ser Glu Ile Thr Ile Glu Asn Asp Pro Glu Ser Glu Lys
465 470 475 480
Arg Gln Lys Leu Phe Pro Ser Lys Gly Glu
485 490
<210> 3
<211> 490
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
Met Gly Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly
1 5 10 15
Thr Thr Glu Asn Gly Val His Lys Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys
20 25 30
Pro Pro Val Gly Gln Trp Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu Val
35 40 45
Trp Glu Asp Val Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gly Pro Ile Cys Pro Gln
50 55 60
Pro Ser Asp Leu Leu Ser Leu Ser Tyr Ala Glu Leu Pro Arg Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Cys Leu Tyr Val Asn Val Phe Ala Pro Asp Thr Pro Ser Gln
85 90 95
Asn Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Tyr Leu Gly
100 105 110
Ala Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Ala Ala Gln Gly
115 120 125
Glu Val Ile Val Val Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Pro Phe Gly Phe
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Leu His Leu Ser Ser Phe Asp Glu Ala Tyr Ser Asp Asn Leu Gly Leu
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Leu Asp Gln Val Ala Ala Leu Lys Trp Val Arg Glu Asn Ile Ser Ala
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Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Gly Met Ser Ile Ala Ala Leu Leu Ala Met Pro Ala Ala Lys Gly Leu
195 200 205
Phe Gln Lys Ala Ile Met Glu Ser Gly Ala Ser Arg Thr Met Thr Lys
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Glu Gln Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Phe Leu Gln Val Leu Gly Ile
225 230 235 240
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245 250 255
Leu Lys Ala Ala Asp Gln Leu Arg Ile Ala Glu Lys Glu Asn Ile Phe
260 265 270
Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp Pro Lys Thr Leu Pro Glu Glu
275 280 285
Pro Glu Lys Ala Ile Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly Ile Pro Leu Leu
290 295 300
Ile Gly Thr Thr Arg Asp Glu Gly Tyr Leu Glu Phe Thr Pro Asp Ser
305 310 315 320
Asp Val His Ser Gln Glu Thr Leu Asp Ala Ala Leu Glu Tyr Leu Leu
325 330 335
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Glu Ser Gln Ile Gln Met Met Thr Asp Leu Leu Phe Trp Arg Pro Ala
355 360 365
Val Ala Tyr Ala Ser Ala Gln Ser His Tyr Ala Pro Val Trp Met Tyr
370 375 380
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385 390 395 400
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435 440 445
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465 470 475 480
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485 490
<210> 4
<211> 490
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Met Gly Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly
1 5 10 15
Thr Thr Glu Asn Gly Val His Lys Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys
20 25 30
Pro Pro Val Gly Gln Trp Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu Val
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50 55 60
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195 200 205
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Claims (8)

1.一种对硝基苄基酯酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述对硝基苄基酯酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
4.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2所述编码基因的工程菌。
6.权利要求1所述对硝基苄基酯酶突变体在酶催化dl-薄荷酯手性拆分制备l-薄荷醇中的应用，所述dl-薄荷酯为dl-乙酸薄荷酯。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：构建含有所述突变体编码基因的重组菌，以重组菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶细胞为催化剂，对dl-薄荷酯进行水解，获得l-薄荷醇。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，水解反应体系中，细胞密度为5~30 OD，dl-乙酸薄荷酯用量为2%~20%，水解过程控制pH6.5~8.5、温度25℃~40℃。
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