CN116942804A - 多价肺炎球菌多糖结合疫苗的成分及其应用 - Google Patents

多价肺炎球菌多糖结合疫苗的成分及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多价肺炎球菌多糖蛋白质结合物及其免疫原性，具体提供一种免疫原性组合物，含有来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖和载剂，所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F。本发明的免疫原性组合物，能够提高不同血清型多糖的免疫原性，可以有效预防多种不同血清型肺炎球菌引起的侵袭性感染。

Description

多价肺炎球菌多糖结合疫苗的成分及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及通过免疫多价疫苗预防细菌病原体的感染。
背景技术
肺炎链球菌(S.pneumoniae，即肺炎球菌)是一种具有荚膜的革兰氏阳性双球菌。根据其荚膜多糖的组成差异，可区分为近100种血清型，其中荚膜多糖为重要致病因子。肺炎链球菌正常情况下寄生于健康人鼻咽部，当寄生的环境发生变化时，如机体抵抗力下降，麻疹、流感等呼吸道病毒感染，或营养不良、老年体弱等情况下，它可透过黏膜防御体系发生侵袭性感染，如进入下呼吸道引起肺炎，穿过血脑屏障引起细菌性脑膜炎，穿过肺泡上皮细胞、侵袭血管内皮细胞进入血液引起菌血症，还可从鼻咽部移行进入鼻窦，引起鼻窦炎，通过咽鼓管进入中耳，引起中耳炎非侵袭性地持续扩散至呼吸道的其他部位。
肺炎球菌性疾病是全球严重的公共卫生问题之一。据世界卫生组织估计,2005年全球每年大约有160万人死于肺炎球菌疾病，包括70-100万5岁以下的儿童，其中多数生活在发展中国家。可见肺炎球菌一直在严重危害着儿童身体健康。在发达国家，肺炎球菌的疾病主要来自于2岁以下儿童和老年人，各年龄组免疫功能低下者。
根据肺炎球菌感染部位不同，可将肺炎球菌性疾病分为侵袭性肺炎球菌性疾病(IPD)和非侵袭性肺炎球菌性疾病(NIPD)两大类。常见的治疗方法就是抗生物治疗，但在全球范围，肺炎球菌对常用抗菌药物产生耐药性已成为一个日益严重的问题。多年临床实践证明接种肺炎球菌疫苗是预防肺炎球菌疾病最经济有效的途径。
目前已上市的肺炎疫苗包括肺炎多糖疫苗(PPSV)和肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗(PCV)两大类。23价肺炎多糖疫苗(PPSV23)由于其免疫原性低、没有免疫记忆和加强作用，所以不适用于婴幼儿和免疫力低下的人群。已上市的可应用于婴幼儿的肺炎多糖结合疫苗包括PCV7、PCV10和PCV13,但其血清覆盖范围小、免疫保护覆盖率低，并且可能引起免疫抑制作用。例如，针对我国内地肺炎链球菌血清型分布的文献荟萃分析表明，2000～2016年期间PCV10血清型覆盖率为52.3％，PCV13血清型覆盖率为68.4％。另外，也发现疫苗使用后非疫苗血清型疾病的发生率在增加。另外，由于多糖-蛋白结合疫苗所用的载体蛋白也广泛应用于婴幼儿的免疫接种中，因为高剂量或重复使用载体蛋白而引起的免疫抑制作用也是多糖-蛋白结合疫苗在临床应用中潜在的风险。
所以，现有多糖-蛋白结合疫苗的血清型覆盖率尚不理想，开发多价肺炎结合疫苗，覆盖更广的致病性血清型的肺炎球菌，增加非疫苗血清型，提高新型多价疫苗的覆盖保护率和免疫原性，降低载体蛋白免疫抑制作用的风险，有其重要的临床价值。
发明内容
为了解决肺炎球菌多糖疫苗免疫原性差、多糖结合疫苗血清覆盖率低、免疫原性低、免疫抑制等问题，本发明提供适用更广、免疫原性更强且免疫抑制减弱的多价免疫原性组合物。
本发明第一方面提供一种免疫原性组合物，含有来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖和载剂，所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F。
在一个或多个实施方案中，所述血清型包括选自以下的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24种血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并且所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F。优选地，所述血清型包括以下20种血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F，或以下24种血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。
在一个或多个实施方案中，所述载剂选自盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述免疫原性组合物还含有佐剂。
在一个或多个实施方案中，所述佐剂是基于铝的佐剂。
在一个或多个实施方案中，所述佐剂包括选自磷酸铝、硫酸铝、氢氧化铝、单磷酰基脂A、QS21、CpG、MF59、硬脂酰酪氨酸、弗氏佐剂和其他粘膜佐剂中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述组合物中，来自血清型3，6B或12F的荚膜多糖与其他任一荚膜多糖的重量比为10:1至1:10，例如5:1至1:5，优选为2:1。
在一个或多个实施方案中，所述组合物是制剂，来自血清型3，6B和12F的荚膜多糖的浓度各自独立为1～8ug/剂(优选4μg/剂)，其余荚膜多糖的浓度各自独立为0.5～5ug/剂(优选2μg/剂)。进一步地，磷酸铝佐剂的浓度为0.125mg/剂至0.5mg/剂。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含表面活性剂，例如Tween 20或Tween80。优选地，组合物中表面活性剂的浓度为100～300μg/剂，优选70～120μg/剂。
本发明还提供包含多种的多糖-蛋白质缀合物以及药学上可接受辅料的多价免疫原性组合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物含有缀合到载体蛋白的来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖。
在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白至少包含两种载体蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白包括(1)CRM197和(2)TTD或其变体。
在一个或多个实施方案中，TTD是TT的C端结构域。
在一个或多个实施方案中，TTD具有SEQ ID NO:2所示的序列，TTD变体与SEQ IDNO:2具有至少90％序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中，所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F。优选地，所述血清型包括以下20种血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F，或以下24种血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。
在一个或多个实施方案中，在所述多糖蛋白缀合物中，至少来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的一种或多种或全部荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合。
在一个或多个实施方案中，所述血清型包括所述20种血清型，其中来自包括血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F在内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种血清型的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合。
在一个或多个实施方案中，所述血清型包括所述20种血清型，其中来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合；来自血清型1、4、6A、7F、8、9V、10A、11A、14、19A、22F、33F的荚膜多糖分别与载体蛋白CRM197缀合。
在一个或多个实施方案中，所述血清型包括所述24种血清型，其中来自包括血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F在内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种血清型的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合。
在一个或多个实施方案中，所述血清型包括所述24种血清型，其中来自血清型3、5、6A、6B、9N、11A、12F、15B、17F、18C、19A、19F、20、23F、33F的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合；来自血清型1、2、4、7F、8、9V、10A、14、22F的荚膜多糖分别与载体蛋白CRM197缀合。
在一个或多个实施方案中，所述血清型包括所述24种血清型，其中来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合；来自血清型1、2、4、6A，7F、8、9N、9V、10A、11A、14、17F、19A、20、22F、33F的荚膜多糖分别与载体蛋白CRM197缀合。
在一个或多个实施方案中，所述组合物中，来自血清型3，6B或12F的荚膜多糖与其他任一荚膜多糖的重量比为10:1至1:10，例如5:1至1:5，优选为2:1。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含佐剂，如基于铝的佐剂。
在一个或多个实施方案中，所述佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝，优选磷酸铝。
在一个或多个实施方案中，所述组合物中，缀合物与佐剂的重量比为1:10至1:2，优选为54:500至54:125。
在一个或多个实施方案中，所述组合物是制剂，来自血清型3，6B和12F的荚膜多糖的浓度各自独立为1～8ug/剂(优选4μg/剂)，其余荚膜多糖的浓度各自独立为0.5～5ug/剂(优选2μg/剂)，磷酸铝佐剂的浓度为0.125mg/剂至0.5mg/剂。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含表面活性剂，例如Tween 20或Tween80。优选地，组合物中表面活性剂的浓度为100～300μg/剂，优选70～120μg/剂。
在一个或多个实施方案中，所述组合物的pH为5.0-7.0，优选5.0～6.2。
本发明还提供本文第一方面所述免疫原性组合物在制备诱导对肺炎球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答和/或对破伤风毒素的免疫应答的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述药物用于预防或治疗肺炎球菌感染和/或破伤风毒素感染。
本发明还提供诱导对肺炎球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答和/或对破伤风毒素的免疫应答的方法，包括向对象施用免疫有效量的本发明第一方面所述的免疫原性组合物。
本发明还提供一种导致被动免疫的免疫组合物，包括靶向肺炎球菌的杀菌抗体，所述抗体是由本文任一实施方案所述的免疫原性组合物免疫哺乳动物而获得。在一个或多个实施方案中，所述杀菌抗体存在于血清、γ球蛋白部分或纯化的抗体制剂中。
本发明优点：
本发明的免疫原性组合物，可以有效预防24种不同血清型的肺炎球菌的侵袭性感染，对24种血清型都能诱导相对均衡的比较高的免疫原性，其免疫原性与各血清型的结合物含量配比有关。本发明的免疫原性组合物同时含有不同的载体蛋白，而且两种载体蛋白都没有毒性，所以不需要通过脱毒处理。该双载体设计降低了潜在安全及免疫抑制风险。该免疫原性组合物还对对破伤风毒素的感染具有保护力。
附图说明
图1，不同载体的5型肺炎球菌多糖结合物免疫原性比较。
图2，不同佐剂剂量下24价肺炎球菌多糖结合疫苗在小鼠体内的免疫原性比较(与阳性疫苗相同的13种血清型)。
图3，不同佐剂剂量下24价肺炎球菌多糖结合疫苗在小鼠体内的免疫原性比较(阳性疫苗的13种血清型以外的11种血清型)。
图4，在小鼠体内不同pH的24价肺炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性比较。
图5，在小鼠体体内13价相同血清型免疫原性(D35)比较。
图6，在小鼠体内PCV13疫苗以外血清型多糖抗体滴度(D35)比较。
图7，在大兔体内13价相同血清型多糖抗体滴度比较(D35)。
图8，在兔体内13种以外血清型多糖抗体滴度(D35)比较。
图9，24价肺炎球菌多糖结合疫苗对3型肺炎球菌挑战的小鼠保护力生存曲线。
图10，24价肺炎球菌多糖结合疫苗对22F型肺炎球菌的保护力生存曲线。
图11，免疫二剂后与免疫前TT抗体滴度比较。A组为生理盐水；B组为百白破疫苗；C组为24价肺炎球菌多糖结合疫苗。
图12，破伤风毒素挑战后生存率曲线。
具体实施方式
本发明提供一种新型的24价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物以及相应免疫原性组合物和疫苗制剂。本发明的疫苗制剂与上市的13价多糖结合疫苗相比，在一些血清型上诱导的抗体滴度更高；对13种血清型以外的血清型也显示出较好的免疫原性；相比13价多糖结合疫苗和23价多糖疫苗能够在体内诱导更好的免疫保护作用。此外，发明人还发现，在不同缀合物上使用不同载体比单载体疫苗组能诱导更高的抗体滴度。
本发明首先提供一种诱导哺乳动物对肺炎球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答、保护其不受肺炎球菌感染的免疫原性组合物。该免疫原性组合物含有来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖，所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F。优选地，所述血清型包括：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。
存在于免疫原性组合物中的肺炎球菌荚膜多糖可以是游离多糖的形式，或作为缀合物的一个组分，在缀合物中多糖与蛋白质共价相连。除了多糖或多糖蛋白缀合物之外，免疫原性组合物还可以包含药学上可接受的载剂，例如盐水、林格氏溶液或磷酸盐缓冲盐水。
在本发明优选的实施方案中，荚膜多糖与蛋白质共价相连形成缀合物。因而，个体可接受的、并能诱导免疫细胞(例如T-细胞)依赖性应答的任何蛋白质或其片段都适宜与肺炎球菌荚膜多糖缀合。基本上任何蛋白质都能作为缀合蛋白。特别是所选择的蛋白质必须具有至少一个自由氨基，用于与多糖的缀合。优选蛋白质是任何天然或重组细菌蛋白，并且其本身是诱导年轻和成年哺乳动物中T-细胞依赖性应答的免疫原。这样的蛋白质的例子包括，但不限制于，破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素和CRM197或它们的变体。其它缀合蛋白的候选物包括假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素。
在本发明优选的实施方案中，肺炎球菌荚膜多糖与蛋白质共价相连形成缀合物。因而，个体可接受的、并能诱导免疫细胞(例如T-细胞)依赖性应答的任何蛋白质或其片段都适宜与肺炎球菌荚膜多糖缀合。基本上任何蛋白质都能作为缀合蛋白。特别是所选择的蛋白质必须具有至少一个自由氨基，用于与多糖的缀合。优选蛋白质是任何天然或重组细菌蛋白，并且其本身是诱导年轻和成年哺乳动物中T-细胞依赖性应答的免疫原。这样的蛋白质的例子包括，但不限制于，破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素。其它缀合蛋白的候选物包括假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素。
与肺炎球菌荚膜多糖缀合的蛋白质(即载体蛋白)可以是个体可接受的、并能诱导免疫细胞(例如T-细胞)依赖性应答的任何蛋白质或其片段。基本上任何蛋白质都能作为缀合蛋白。特别是所选择的蛋白质必须具有至少一个自由氨基，用于与多糖的缀合。优选蛋白质是任何天然或重组细菌蛋白，并且其本身是诱导年轻和成年哺乳动物中T-细胞依赖性应答的免疫原。这样的蛋白质的例子包括，但不限制于，破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素。其它缀合蛋白的候选物包括假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素。
另外，还可以使用蛋白毒素的非毒性变体，如CRM197。优选这样的突变保留了天然毒素的表位。这些突变后的毒素被称作“交叉反应物质”或CRM。CRM197载体蛋白(NCBI:AMV91693.1，SEQ ID NO:3)是白喉杆菌素的无毒变异体，该蛋白没有毒性，但保留了白喉类毒素(DT)的免疫原性。在公开的文章和专利中可获得其发酵和纯化方法(US5614382)。白喉类毒素无毒变异体蛋白(CRM197)是在临床已证明安全、有效的载体蛋白，已在上市的肺炎球菌多糖结合疫苗中广泛使用。其他白喉毒素变体也适于用作载体蛋白。还可以用这些蛋白质的片段肺炎球菌多糖缀合，其条件是这些片段应足够长，即优选至少10个氨基酸以确定T-细胞表位。
破伤风类毒素蛋白(TT)在公开文献中有很多报道。发明人发现了TT蛋白的变体TTD蛋白。该蛋白没有毒性，但保留了TT蛋白的免疫原性。TTD蛋白位于TT蛋白的重链C-末端，相对分子量50KDa，是毒素的受体结合区域，没有毒性，具有良好的免疫原性，其过敏性低于破伤风类毒素，是潜在的破伤风疫苗抗原成分及载体蛋白。TTD可以通过重组表达纯化得到(Immunobiology,Vol.216,Issue 4，2011,P 485-490)。示例性的TTD表达纯化方法包括：将表达TTD的DNA序列(SEQ ID NO:1)克隆到蛋白表达质粒pET21中，构建重组表达TTD蛋白(SEQ ID NO:2)的工程菌(例如大肠杆菌BL21(DE3))。挑取重组工程菌单克隆菌落在合适的培养基和条件中扩增(例如BL21(DE3)在10mL的LB(Amp)液体培养基中，37体，250rpm培养至OD600至0.8后)，加入诱导剂培养(例如加入0.1mM IPTG，在251，250rpm继续培养4h)，然后从培养物中分离TTD。从培养物中分离蛋白的过程本领域熟知，例如以下步骤：培养液8000rpm，4℃离心，然后用PBS重悬后破碎(例如超声波破碎)细胞，破碎液在8000rpm，4℃离心，收取包含TTD蛋白的上清。从上清中纯化TTD蛋白的方法可使用本领域常用从液体中纯化蛋白的方法，例如通过硫酸铵沉淀、澄清过滤、组合层析如离子交换层析、复合介质层析、和/或亲和层析等层析方法得到，纯度在95％以上。通过质谱测定的分子量与理论分子量一致。
其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(参见例如WO2004/083251)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素。也可以使用细菌外膜蛋白，如外膜复合体c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、来自组A或者组B链球菌的C5a肽酶、或者流感嗜血杆菌蛋白D。其他蛋白质，如卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素的纯化的蛋白质衍生物(PPD)也可以用作载体蛋白。
在不实质性影响TTD活性(例如毒素结合活性)的前提下，本领域技术人员可以对本发明的TTD改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得TTD的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。本文所述TTD变体包括与SEQ ID NO:2所示的TTD具有至少90％(例如至少95％，至少98％，至少99％)序列相同性并保留其毒素结合活性的TTD变体。
发明人发现，使用不同载体蛋白对多种血清型多糖进行缀合，混合后形成的免疫原性组合物具有更好的免疫原性和更低的免疫抑制风险。示例性地，免疫原性组合物中至少包含两种载体蛋白，例如CRM197和TTD或其变体。在优选的实施方案中，本发明的24种肺炎球菌多糖分别与CRM197和TTD载体蛋白通过化学偶联制备得到多糖蛋白缀合物。所得的不同血清型多糖-蛋白结合物具有良好的理化特性，如多糖蛋白比在0.5-3.0之间，游离糖含量在20％以下，其它残留杂质都控制在很低的范围内。
在一些实施方案中，在所述多糖蛋白缀合物中，至少来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的一种或多种或全部荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合。进一步地，包括血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F在内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种血清型分别与载体蛋白TTD或其变体缀合。优选地，来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合；来自血清型1、2、4、6A，7F、8、9N、9V、10A、11A、14、17F、19A、20、22F、33F的荚膜多糖分别与载体蛋白CRM197缀合。
本文中，在多糖蛋白缀合物或免疫原性组合物中，来自不同血清型的荚膜多糖与载体蛋白的比例在0.2-3.0之间，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或上述任意两个数值之间的范围，优选0.5-2.5，0.5-2.0，0.5-1.5，更优选0.6-2.5，0.6-2.0，0.6-1.5。
在本文所述的多糖蛋白缀合物或免疫原性组合物中，来自血清型3，6B或12F的荚膜多糖与其他任一荚膜多糖的重量比为10:1至1:10，例如5:1至1:5，优选为2:1。例如，所述组合物可以是制剂，其中来自血清型3，6B和12F的荚膜多糖的浓度各自独立为1～8ug/剂(优选4优选u剂)，其余荚膜多糖的浓度各自独立为0.5～5ug/剂(优选2优选5剂)，磷酸铝佐剂的浓度为0.125mg/剂至0.5mg/剂。
该免疫原性组合物可用作疫苗，进一步含有佐剂如基于铝的佐剂(氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝)。此外，本文所述的免疫原性组合物还可包含表面活性剂，例如Tween 20或Tween 80。本发明的免疫原性组合物能诱发对肺炎球菌感染的主动和被动保护。对于被动保护，免疫抗体是通过用本发明的免疫原性组合物制成的疫苗来免疫哺乳动物，然后从哺乳动物回收免疫抗体来生产的。本发明还提供了通过给予免疫有效量的本发明的组合物来免疫对象抵抗肺炎球菌感染的方法。
通过本领域技术人员已知的标准技术制备荚膜多糖。在本发明中，从肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F制备荚膜多糖。通过单独的方法制备这些肺炎球菌缀合物并配制成单剂量制剂。
细菌荚膜多糖是细菌菌体的重要组成部分，也是致病菌重要的毒性因子。肺炎球菌细菌荚膜多糖会在细菌培养过程中释放到培养液中。本发明中的肺炎球菌细菌荚膜多糖是通过对不同血清型的肺炎球菌细菌的培养、发酵、纯化而得到。该类技术成熟，在行业内应用多年，有多个公开文章报道或专利报道(US4242501)。在一个实施方案中，在基于大豆的培养基中培养每种肺炎球菌多糖血清型。然后通过离心、沉淀、超滤和柱层析纯化各种多糖(US4686102)。
具体制备荚膜多糖的方法在美国专利US5714354有具体报道。肺炎球菌细菌培养\发酵及多糖制备是一个成熟的工艺(US4686102,US5847112)。简单来说将不同肺炎链球菌菌种接种到含有培养基(例如大豆培养基)的摇瓶中，在37℃二氧化碳培养箱培养过夜，将培养液接种到10升发酵罐，发酵培养6-12小时。培养结束后，加入DOC灭活剂杀菌灭活。离心收获澄清培养液，在澄清培养液液中加入CTAB沉淀剂，得到粗制沉淀复合糖，然后通过一系列沉淀、洗涤、层析纯化后得到精制多糖。
肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法也是本领域常规技术，例如通过无有机溶剂的方法完成的(美国专利US 5714354)。通常精制多糖纯化工艺包括，但不限于，加入NaCl溶液对复合糖的溶解，用NaCl溶液溶解离心后取上清，加入酒精去除杂质和沉糖，多次洗涤沉淀去杂，或可根据不同糖型，利用层析法如离子交换柱、复合型填料纯化得到精制多糖。在具体实施方案中，纯化过程主要包括，将细菌灭活液通过离心分离菌体，收获离心上清液，然后再通过0.22μm滤膜过滤及100KD膜包超滤浓缩，获得肺炎多糖发酵浓缩液。向肺炎多糖发酵浓缩液中加入CTAB溶液，室温搅拌，8000rpm离心，收取多糖复合物沉淀(对于7F、14、33F型多糖，收集上清液)。多糖复合物然后用0.25-0.5M NaCl溶液解离后，再通过沉淀、柱层析、超滤等工艺纯化得到纯化多糖溶液。多糖溶液通过0.22μm膜过滤后，低温保存。
对所得多糖进行质量分析的方法本领域已知，例如通过核磁共振。具体地，制备得到的不同类型肺炎球菌荚膜多糖通过特异性血清进行鉴别血清型、通过核磁共振波谱(Nuclear magnetic resonance，NMR)分析肺炎球菌多糖的化学结构、通过化学显色方法可对多糖中含有的官能团(如鼠李糖、糖醛酸、O-乙酰基等组分)进行含量测定。确定多糖各个理化指标符合欧州药典关于肺炎球菌多糖制定的标准，蛋白及核酸等主要杂质含量均低于1％。
可用许多缀合方法产生本发明的多糖-蛋白质缀合物。在多糖-蛋白结合反应过程中，通常包括多糖活化和蛋白缀合步骤。通过常规方法实现多糖的化学活化和随后缀合到载体蛋白。参见例如美国专利号4,673,574和4,902,506。通过控制多糖的分子量、多糖活化反应、多糖-蛋白的反应比例、反应温度、反应时间及反应液pH值等参数，得到最终多糖蛋白缀合物。所得的多糖蛋白缀合物通过进一步纯化，去除未反应物及杂质，通过质量分析，定量其多糖-蛋白交联度及残留杂质，确保批次的一致性和可比性。
将纯化的多糖化学活化以使得该糖能够与载体蛋白反应。根据多糖的特点，可以选择不同的化学活化方法，常用的多糖活化方法有溴化氰法(US6375846B1)、水解(US4761283)、1-氰基-4-二甲氨基砒啶四氟硼酸酯(CDAP)(EP0720485)、高碘酸氧化法(US4711779)。活化的多糖可经过超滤与其他杂质分离。多糖经过活化后具有与载体蛋白反应的活性。
例如，用高碘酸盐(例如高碘酸钠)或其等同物的选择性氧化反应来氧化先前糖部分的羟基而形成醛基。这形成了活化的肺炎球菌荚膜多糖，其现在能与选择的蛋白质载体共价相连。例如在室温，用约1ml约20mM的高碘酸钠溶液适宜地氧化约10mg的多糖约10-15分钟；或者，加入多糖的0.05-2个当量的高碘酸盐氧化12-24小时。反应时间可随其它数量的高碘酸盐而变化以得到同等的氧化。糖的还原和开环使得还原糖的邻位羟基活化成醛基。多糖活化结束后，可通过超滤浓缩除去反应中的小分子物质。
缀合物的制备是通过对纯化提取的肺炎球菌外膜多糖经过处理得到的多糖片段通过化学偶联方式连接到载体蛋白上。多糖-蛋白结合物可以通过直接化学偶联或通过连接子实施得到，如利用连接子己二酸二酰肼进行偶联。将多糖与蛋白质缀合的各种化学方法是已知的并在文献中有所描述。通常方法有溴化氰法、CDAP法或还原胺化法(US5952454,EP0720485,US4711779)。例如，作为参考文献引入本发明的美国专利4,644,059描述了用己二酸二酰肼(ADH)作为同双功能连接物制备的缀合物。也作为参考文献引入本发明的美国专利4,695,624描述了制备多糖以及用属间间隔基制备缀合物的方法。在Dick、WilliamE.和MichelBeurret的Contrib.Mrcrobil.Immunol.(1989)，Vol.10，pp.48-114中讨论了对各种用于设计缀合物的制备方法和因素的概括性研究，其也作为参考文献引入本发明。通过偶联得到的多糖-蛋白缀合物能诱导比较强的免疫原性，可同时诱导抗多糖和抗蛋白的特异性抗体。
优选的缀合本发明的各种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质缀合物的方法是还原胺化法。在氰基硼氢化物离子或另一种还原剂的存在下，通过将载体蛋白的氨基与肺炎球菌荚膜多糖的醛基偶联使活化的肺炎球菌荚膜多糖与所选择的缀合蛋白缀合。得自还原性氨基化过程的肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物优选能溶于水溶液。这使本发明的肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物成为用作疫苗的优选候选物。缀合的条件可根据多糖的分子量和具体蛋白进行调整。在还原胺化法中，多糖与载体蛋白的比例控制在0.5-3.0之间，反应过程中加入多糖的1.0-2.0当量的氰基硼氢化钠溶液，然后加入2.0当量的硼氢化钠溶液。孵育温度可以是室温，孵育时间例如至少12小时。反应结束后通过超滤换液或层析，去除反应中的杂质或没有反应的底物，最后通过0.22um过滤器无菌过滤，将多糖-蛋白结合物溶液放在2-8℃下保存。
荚膜多糖缀合到载体蛋白后，通过多种技术纯化多糖-蛋白质缀合物。这些技术包括浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱和柱层析。
纯化各复合糖后，将它们混合以配制本发明的免疫原性组合物，其可以用作疫苗。使用本领域公知的方法可以完成本发明的免疫原性组合物的配制。例如，可以用药学上可接受的辅料配制24种各自的肺炎球菌缀合物以制备组合物。此类载体的实例包括，但不限于，水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和葡萄糖溶液。
在一些实施方案中，免疫原性组合物可包含一种或多种佐剂。如本文定义的，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。从而，通常给予佐剂以加强免疫应答并且佐剂是技术人员公知的。用于增强组合物的有效性的合适的佐剂包括但不限于：(1)铝盐，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝，等等；(2)水包油乳液制剂，如MF59、SAF、RibiTM佐剂***(RAS)，(Corixa，Hamilton，MT)；(3)皂苷佐剂，如QuilA或STIMULONTMQS-21；(4)细菌脂多糖(如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)或者其衍生物或类似物)，合成的多核苷酸(如含有CpG基序的寡核苷酸)；(5)细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18，等)，干扰素(例如，γ干扰素)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，共刺激分子B7-1和B7-2，等等；(6)粘膜佐剂，包括蛋白质毒素、重组蛋白亚基和核酸等，包括细菌ADP-核糖基化毒素的脱毒突变体，如野生型或者突变型的霍乱毒素(CT)，百日咳毒素(PT)，或者大肠杆菌不耐热毒素(LT)(参见例如WO93/13302和WO92/19265)；和(7)作为免疫刺激剂以增强组合物的有效性的其他物质。佐剂的用量可由本领域技术人员根据常规技术确定。示例性地，本文的免疫原性组合物中佐剂(例如磷酸铝)浓度为0.125mg/剂至0.5mg/剂。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可以用于保护或者治疗对肺炎球菌感染敏感的哺乳动物(例如人)，这可通过全身或者粘膜途径施用疫苗来完成。以及本文所述免疫原性组合物的用途，用于制备用于提供对抗多种肺炎球菌感染的保护的药物。
本发明的免疫原性组合物可用作增加用于预防和诊断目的的抗体的手段。诊断尤其适用于监视和检测各种由肺炎球菌引起的感染和疾病。本发明的另一个实施方案用免疫原性组合物作为免疫原，用于对有危险患肺炎球菌感染或疾病的个体进行主动的和被动的免疫原性保护。用于被动保护的免疫抗体如下产生：用本发明的任意免疫原性组合物免疫哺乳动物，然后从哺乳动物回收γ-球蛋白部分中的杀菌抗体，或者作为血清或作为特异性抗体。此处所用的本发明的疫苗能诱导用于提供对肺炎球菌感染的保护的抗体。
另外，肺炎球菌荚膜多糖本身可以用作免疫剂，优选与佐剂如基于铝的佐剂缔合为免疫原性组合物。本发明进一步的实施方案是用该免疫原性组合物作为对抗肺炎球菌感染的免疫原性保护。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可通过将肺炎球菌荚膜多糖或缀合物分散到适宜的药学上可接受的辅料而典型地形成。所述辅料包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，例如：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。也可以存在疫苗中常用的添加剂，例如稳定剂如乳糖或山梨糖醇和佐剂如磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、CpG、单磷酰基脂A、QS21、MF59或硬脂酰酪氨酸。
本发明的免疫原性组合物和疫苗的保护或者治疗作用可通过全身或者粘膜途径施用疫苗来完成。这样的施用包括胃肠外给药，例如通过肌内、腹膜内、皮内或者皮下途径注射，或者通过粘膜施用于口/消化道、呼吸或者泌尿生殖道。在一个实施方案中，鼻内施用用于治疗肺炎或者中耳炎。
免疫原性组合物的剂量应是能达到致免疫作用效果的剂量。选择每个疫苗剂量中缀合物的量作为诱导免疫保护而无显著的不利作用的量。此类量可以取决于肺炎球菌血清型而变。通常，每剂将包含0.01μg到100μg多糖或缀合物，例如0.1μg.到10μg，或1μg到5μg。给药剂量通常在每千克体重约0.01μg至约10μg之间的范围。可以给出一系列最佳免疫剂量。单位剂型的疫苗可含有约0.01μg至约100μg相当量的脑膜炎致病菌荚膜多糖或缀合物，例如0.1μg到10μg，或1μg到5μg。
通过包括观察受试者中合适的免疫应答的标准研究确定具体疫苗的组分的最佳量。最初接种后，受试者可以接受足够间隔的一次或几次加强免疫。本发明的免疫原性组合物适于婴儿、儿童、青少年和成人使用。其免疫方案可由有经验的临床医生确定。
在本发明的具体实施方案中，24价疫苗是各自缀合到CRM197的血清型1、2、4、6A，7F、8、9N、9V、10A、11A、14、17F、19A、20、22F和33F的肺炎球菌荚膜多糖和各自缀合到TTD的血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的肺炎球菌荚膜多糖的无菌液体制剂。每剂被配制成含有：除了4μg多糖的3，6B或12F之外，每种糖2μg；约20～80μg CRM197载体蛋白；约10～40μg TTD载体蛋白；0.125mg～0.5mg磷酸铝佐剂。将液体填充到没有防腐剂的单剂量注射器中。摇动后，疫苗是均匀的，白色混悬液可用于肌内施用。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实验方法
1、肺炎球菌荚膜多糖的制备
肺炎球菌细菌培养\发酵及多糖制备是一个成熟的工艺(US4686102,US5847112)。不同血清型的肺炎球菌菌种(美国典型生物资源保藏中心)通过培养制备得到菌种库，将一管菌种库中的肺炎链球菌菌种接种到含有大豆培养基的摇瓶中，在37℃、5～10％CO2培养箱培养过夜，培养完成后，镜检，结果正常则将培养液接种到10L发酵罐，在pH 7.0，温度37℃下发酵培养。培养结束后，加入10％的DOC溶液，灭活，确保肺炎球菌细菌完全灭活。
肺炎球菌荚膜多糖的纯化是通过无有机溶剂的方法完成的(美国专利US5714354)。其制备纯化过程主要包括，将细菌灭活液通过离心分离菌体，收获离心上清液，然后再通过0.22μm滤膜过滤及100KD膜包超滤浓缩，获得肺炎多糖发酵浓缩液。向肺炎多糖发酵浓缩液中加入CTAB溶液，室温搅拌，8000rpm离心，收取多糖复合物沉淀(对于7F、14、33F型多糖，收集上清液)。多糖复合物然后用0.25-0.5M NaCl溶液解离后，再通过沉淀、柱层析、超滤等工艺纯化得到纯化多糖溶液。多糖溶液通过0.22μm膜过滤后，低温保存。
制备得到的不同类型肺炎球菌荚膜多糖通过特异性血清进行鉴别血清型、通过核磁共振波谱(Nuclear magnetic resonance，NMR)分析肺炎球菌多糖的化学结构、通过化学显色方法可对多糖中含有的官能团(如鼠李糖、糖醛酸、O-乙酰基等组分)进行含量测定。确定多糖各个理化指标符合欧州药典关于肺炎球菌多糖制定的标准，蛋白及核酸等主要杂质含量均低于1％。
2、载体蛋白TTD的制备
将表达TTD的DNA序列优化后(SEQ ID NO:1)克隆到蛋白表达质粒pET21中，构建重组表达TTD蛋白(SEQ ID NO:2)的大肠杆菌BL21(DE3)。挑取重组BL21(DE3)单克隆菌落在10mL的LB(Amp)液体培养基中，37℃，250rpm培养至OD600至0.8后，加入0.1mM IPTG，在25℃，250rpm继续培养4h。培养液在8000rpm，4℃离心，收集菌体，然后用PBS重悬后破碎。破碎液在8000rpm，4℃离心，收取上清。TTD蛋白的纯化是通过硫酸铵沉淀、澄清过滤、组合层析方法得到，纯度在95％以上。通过质谱测定的分子量与理论分子量一致，通过分子筛确证TTD蛋白的均一性。TTD的氨基酸序列如下所示：
KNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND(SEQ ID NO:2)
3、白喉杆菌素无毒变异体CRM197蛋白的制备
CRM197载体蛋白是白喉杆菌素无毒变异体(SEQ ID NO:3)，该蛋白没有毒性，但保留了白喉毒素的免疫原性。在公开的文章和专利中都有报道其发酵和纯化方法(US5614382)。通常通过将Corynebacterium diphtheriae菌种接种到培养基中，在37℃下，搅拌20-30小时，然后通过离心去除菌体，保留上清。将发酵上清通过超滤换液后，加入硫酸铵沉淀，收取沉淀物。然后将沉淀物溶解，换液，再通过柱层析，纯化得CRM197蛋白，其纯度在95％以上，用于结合反应。
4、多糖-蛋白结合物的制备
通过细菌多糖与载体蛋白偶联制备多糖-蛋白结合物是提高细菌多糖免疫原性的有效途径。多糖-蛋白结合物广泛应用于细菌性疫苗的制备，如B型流感嗜血杆菌多糖PRP-TT结合疫苗，奈氏脑膜炎细菌A、C、Y、W多糖-载体蛋白结合疫苗。多糖-蛋白结合物的制备主要分为两个步骤：多糖的水解或活化、多糖-蛋白的偶联。多糖活化又可分为不同方法如CNBr法(US 4619828)，水解(US4761283)、高碘酸钠氧化法(US5306492)，活化的多糖然后可以直接与载体蛋白化学偶联(US4356170)或通过小分子连接器与载体蛋白偶联。
肺炎球菌多糖-蛋白结合物的制备主要包括如下步骤：多糖处理、多糖活化、多糖-蛋白的偶联。
肺炎球菌多糖前处理：部分血清型在氧化前，可以通过酸或碱水解方式(US5847112A)以降低分子量或提高多糖氧化结合效率，如血清型1、3、4、6A、6B、8、10A、11A、12F、15B、18C、22F多糖。部分多糖则可以通过高压均质方式降低其分子大小，如血清型2、6B、7F、8、10A、11A、12F、14、15B、19A、19F、33F。
肺炎球菌多糖活化：多糖活化是通过加入高碘酸钠溶液进行的(US4711779)。高碘酸盐加入量通常在多糖的0.05-2个当量氧化时间在12-24小时,多糖活化结束后，通过超滤浓缩除去反应中的小分子物质。
肺炎球菌多糖-蛋白结合物制备：多糖-蛋白的化学偶联是通过还原胺化法进行(US5952454、EP0720485、US4711779)。血清型1、2、4、6A、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、17F、19A、20、22F和33F多糖通过与CRM97偶联制备多糖-蛋白缀合物；3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F多糖通过与TTD偶联制备多糖-蛋白缀合物。在偶联反应中，多糖与载体蛋白的比例控制在0.5-2.5之间，反应过程中加入1.0-2.0当量的氰基硼氢化钠溶液，然后加入2.0当量的硼氢化钠溶液。反应结束后通过超滤换液或层析，去除反应中的杂质或没有反应的底物，最后通过0.22um过滤器无菌过滤，将多糖-蛋白结合物溶液放在2-8°下保存。所有多糖-蛋白结合物通过质量分析，游离多糖含量控制在20％以内，游离蛋白含量在2％以内，多糖-蛋白比在0.5-2.0之间，内毒素及其它杂质含量都控制在安全、可接受范围内。
5、多价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗的配制
肺炎球菌主要致病性的血清型有24种，分别是1,2,3,4,5,6A,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F和33F。将每种多糖-蛋白单价结合物原液通过使用pH 6.0的缓冲溶液稀释后混合，然后加入磷酸铝佐剂搅拌后制备得到。其中各种结合物中的多糖含量为每毫升2～4微克，磷酸铝佐剂含量为0.125～0.5毫克。
6、多糖-蛋白缀合物在动物体内的免疫原性评价
小鼠免疫实验方案：将多价疫苗原液加入磷酸铝佐剂，配制成免疫抗原，选择6-8周龄的Balb/c小鼠进行腹腔免疫，每组8个小鼠，每次免疫剂量为0.5ml，分别在0天、14天、21天进行免疫，已上市相关疫苗(辉瑞的沛儿13，沃森生物的沃安欣作为阳性对照，磷酸铝佐剂为阴性对照。在35天抽血评价其多糖的免疫原性。
大兔免疫实验方案：将多价疫苗原液加入磷酸铝佐剂，配制成免疫抗原，选择2.0～2.5kg的新西兰大白兔进行大腿肌肉免疫，每组8只，每次免疫剂量为0.5ml，同时以PCV13(沛儿13)为阳性疫苗免疫二剂，并在35天抽血评价其多糖的免疫原性。
7、ELISA法评价多糖免疫原性
将肺炎多糖用包被缓冲液稀释，包被到96孔酶标板，100μl/孔，并在37℃孵育后洗板。将小鼠、大兔抗血清通过吸附剂处理后，血清先以1：100稀释，后2.5倍梯度稀释，稀释8个梯度，再加入酶标板中，每孔50μl，孵育过夜。洗板后，将二抗以1：1万稀释后加入酶标板中，每孔100μl，孵育2小时后洗板，然后加入1mg/ml的PNPP-Na显色底物,每孔100μl，孵育2小时后,以50μl/孔加入3M NaOH中止反应，上机读取OD405数值。测定孔OD值与阴性孔OD值比值大于或等于2.1判定为阳性，以稀释最大倍数为阳性的稀释度定为每个血清的抗体滴度，并计算每组免疫动物的抗体滴度几何平均值，利用T-test分析不同组别间的统计学意义。
实施例1：血清型5多糖-CRM197结合物和肺炎多糖-TTD结合物在小鼠的免疫原性比较
将5PS-CRM197结合物、5PS-TTD结合物，加入磷酸铝佐剂后，在0天、14天、28天分别2μg/剂免疫BALB/c小鼠(5只/组)，在21天和35天采血检测抗体滴度。
结果显示(图1)，CRM197载体的结合物D35的滴度水平为866.43，TTD载体的结合物D35的滴度水平为16260.67，以TTD为载体的多糖结合物的免疫原性高于以CRM197为载体的多糖结合物免疫原性，经Mann Whitney test分析差异显著(P＝0.0079)。
实施例2：不同佐剂剂量下24价肺炎球菌多糖结合疫苗在小鼠体内的免疫原性比较
在BALB/c小鼠体内评价磷酸铝佐剂加入量分别为0.5mg/剂、0.25mg/剂、0.125mg/剂的24价肺炎多糖结合疫苗的免疫原性差异。在6～8周龄的BALB/c雌性小鼠随机分组，8只/组，在0天、14天、28天分别0.5ml/剂免疫一剂，在35天采血检测抗体滴度水平，免疫原性数据如图2和图3所示。
结果表明，不同佐剂剂量下24价肺炎球菌多糖结合疫苗对13种血清型(阳性疫苗包含的血清型)的免疫原性与上市的13价结合疫苗相当，而且部分血清型比13价结合疫苗有更高的抗体滴度水平，如6B，18C，23F。同时在13种血清型以外的11种血清型也达到了良好的免疫原性。
实施例3：不同pH条件下24价肺炎球菌多糖结合疫苗在小鼠体内的免疫原性比较
在BALB/c小鼠体内评价不同pH的24价肺炎多糖结合疫苗的免疫原性差异。在6～8周龄的BALB/c雌性小鼠体内评价24价肺炎多糖结合疫苗，小鼠随机分组，8只/组。试验在D0、D14共免疫二次，1剂/次，在D0、D21、采血清，以ELISA检测血清中的多糖抗体滴度水平。
pH范围在5.0～6.2范围内的24价肺炎球菌多糖结合疫苗，免疫二剂后一周(D21)血清抗体滴度比较说明(见图4)，5.0～6.2范围内pH的24价肺炎多糖结合疫苗免疫后，对每种血清型的抗体滴度组间无显著差异(P＞0.05)，都能诱导良好的免疫原性。
实施例4：24价肺炎球菌多糖结合疫苗与阳性疫苗在小鼠体内的免疫原性比较
目前上市的13价肺炎结合疫苗有两种，一种是沛儿13，由美国辉瑞公司生产，使用CRM197作为载体蛋白，另一种是沃安欣，由沃森生物股份公司生产，使用破伤风类毒素(TT)作为载体蛋白。
将24价肺炎结合疫苗与沛儿13、沃安欣及佐剂对照组分别在0，14，28天免疫BALB/c小鼠后，评价在35天的免疫原性，如图5、图6所示。
结果表明：
(1)24价肺炎球菌结合疫苗与基于CRM197载体蛋白的沛儿13比较，D35血清抗体滴度除18C外没有显著差别。血清型18C的免疫原性明显高于沛儿13，另外5，6A、7F，23F的抗体滴度也高于对照组。
(2)24价肺炎球菌结合疫苗与基于TT载体蛋白的沃安欣比较，D35血清抗体滴度，经非参数Kruskal-Wallis test检验，4型、6A型、23F型有显著性差异，免疫原性高于沃安欣。另外，5，7F，9V的抗体滴度也高于对照组。
(3)对于非PCV13疫苗血清型，24价肺炎球菌结合疫苗也能诱导较好的免疫原性(图6)。将24价肺炎球菌结合疫苗(PCV24)与佐剂对照组在35天的抗体滴度用Mann-Whitneytest分析，除10A型外的其它血清型(2、8、9N、11A、15B、17F、20、33F)P＜0.05，有显著性差异，表明PCV24疫苗对PCV13以外的血清型有较好的免疫原性。10A型疫苗组与佐剂对照组比较，没有显著差异(P＝0.3068)，可能是10A型在实验动物小鼠中的本底抗体滴度水平较高所致。
实施例5：24价肺炎球菌多糖结合疫苗与阳性疫苗在大兔体内的免疫原性比较
配制PCV24肺炎球菌多糖结合疫苗免疫大兔(8只/组)，以PCV13(沛儿13)为阳性对照、生理盐水为阴性对照，首次免疫后，间隔三周免疫，在第二次免疫后二周(D35)采血检测血清中各型多糖的抗体滴度(图7和图8)。
与PCV13(沛儿13)相比(图7)，PCV24免疫二剂经T检验分析13种血清型均无显著差异，P＞0.05，PCV24免疫原性可以达到已上市疫苗效果。13种血清型以外的11种血清型(图8)也显示出较好的免疫原性。
实施例6：双载体与单载体的24价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性比较
为了对比24价肺炎球菌多糖结合疫苗中，使用两种载体蛋白与使用一种载体蛋白免疫原性的差异，分别配制两种不同24价肺炎球菌多糖结合疫苗。A组疫苗中血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F、23F共8个型以TTD为载体蛋白，其它16个血清型为CRM197载体蛋白；B组疫苗中24个血清型均使用CRM197做为载体蛋白。
将以上二组疫苗分别免疫新西兰大白兔，每组8只，共免疫二次，间隔三周，在免疫前和第二次免疫后二周采血清检测各型多糖抗体滴度水平，结果见表1：
表1：双载体与单载体24价肺炎多糖结合疫苗免疫二剂后血清抗体滴度水平GMT值比较
从表1可知，在所有24种血清型中，双载体疫苗组比单载体疫苗组能诱导更高的抗体滴度，而且有13种血清型，诱导的抗体滴度有显著性差别(P＜0.05)。说明双载体疫苗可以避免单一载体引起的免疫抑制作用。
实施例7：双载体与单载体的20价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性比较
分别配制两种不同20价(1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F)肺炎球菌多糖结合疫苗。A组疫苗中血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F、23F共8个型以TTD为载体蛋白，其它12个血清型为CRM197载体蛋白；B组疫苗中20个血清型均使用CRM197做为载体蛋白。
将以上二组疫苗分别免疫新西兰大白兔，每组8只，共免疫二次，间隔三周，在免疫前和第二次免疫后二周采血清检测各型多糖抗体滴度水平。
实施例8，双载体与单载体的24价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性比较
分别配制两种不同24价(1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)肺炎球菌多糖结合疫苗。A组疫苗中血清型3、5、6A、6B、9N、11A、12F、15B、17F、18C、19A、19F、20、23F、33F共15个型以TTD为载体蛋白，其它9个血清型为CRM197载体蛋白；B组疫苗中24个血清型均使用CRM197做为载体蛋白。
将以上二组疫苗分别免疫新西兰大白兔，每组8只，共免疫二次，间隔三周，在免疫前和第二次免疫后二周采血清检测各型多糖抗体滴度水平。
实施例9：24价肺炎球菌多糖结合疫苗对3型肺炎球菌的BALB/c小鼠保护力试验
在BALB/c小鼠体内以PCV13(沃森，沃安欣)多糖结合疫苗为阳性对照品、生理盐水为阴性对照品，腹腔免疫三剂后二周，以2×105CFU的3型肺炎链球菌滴鼻感染。观察攻毒后二周内的存活率，分析24价肺炎多糖结合疫苗对3型肺炎球菌攻毒的保护力。
结果(图9)表明，24价肺炎球菌多糖结合疫苗诱导的抗体具有100％的免疫保护作用，其效果优于保护率为89.9％的上市13价肺炎球菌多糖结合疫苗。
实施例10：24价肺炎球菌多糖结合疫苗对22F型肺炎球菌的BALB/c小鼠保护力试验
试验以23价肺炎球菌多糖疫苗(PPV23)为阳性对照品、生理盐水为阴性对照品，在BALB/c小鼠体内腹腔免疫一剂后三周，以1×108CFU的22F型肺炎链球菌腹腔感染。通过攻毒后小鼠的生存情况，分析24价肺炎多糖结合疫苗对22F型肺炎球菌的保护力。
结果(图10)显示，24价疫苗具有100％的存活率，对照品PPV23多糖疫苗30％的存活率，生理盐水20％存活率。经Log-rank(Mantel-Cox)test检验，24价疫苗与对照品相比，具有显著性差异，P＜0.05(P值为0.0027)。
综上，说明24价肺炎球菌多糖结合疫苗对22F型肺炎球菌，与PPV23多糖疫苗比，具有显著的保护效果。
实施例11：24价肺炎球菌多糖结合疫苗对破伤风毒素的保护力试验
24价肺炎球菌多糖结合疫苗包含TTD载体蛋白，通过在小鼠体内破伤风毒素攻毒保护试验评价疫苗的有效性。
在BALB/c小鼠体内，0天、14天腹腔注射免疫24价肺炎球菌多糖结合疫苗，同时以百白破疫苗为阳性对照、生理盐水为阴性对照。第28天采血检测血清中对破伤风类毒素(TT)的抗体滴度水平(图11，A组为生理盐水；B组为百白破疫苗；C组为24价肺炎球菌多糖结合疫苗)，并腹腔注射破伤风毒素(20LD50)，观察二周内的小鼠存活情况(图12)。
由图10可知，B组、C组、D组免疫二剂后与免疫前相比，TT抗体滴度水平均有显著性提高，P＜0.05。B组对于TT抗体滴度高于C组，可能是由于百白破疫苗是由TT组成，24价肺炎球菌多糖结合疫苗使用的是TTD。
由图12可知，生理盐水组破伤风毒素腹腔感染后第1天全部死亡，24价肺炎球菌多糖结合疫苗保护率80％，对照组百白破疫苗保护率100％。说明24价肺炎球菌多糖结合疫苗对破伤风毒素的感染具有保护作用，其效果明显优于阴性对照，略低于阳性疫苗。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海瑞宙生物科技有限公司
上海微宙生物科技有限公司
<120> 多价肺炎球菌多糖结合疫苗的成分及其应用
<130> 220361 1CNCN
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TTD
<400> 1
aaaaaccttg actgctgggt ggataacgaa gaggacatcg acgtcatatt gaaaaaatcg 60
actattttaa atttagacat taacaatgac attatttcgg acatttcagg ctttaactca 120
tcagtaataa cttatcctga cgcacaattg gtccctggaa tcaacggtaa agccatccat 180
ctggtgaaca acgaaagttc cgaagtgatt gtccataaag ctatggacat tgagtataac 240
gatatgttta ataatttcac tgtgagtttt tggctgcgtg tccctaaagt atctgccagt 300
cacttagagc aatatggtac gaacgaatac tcgataattt catctatgaa aaaacatagc 360
ttgtcaatcg gctcaggctg gtccgtctca ctgaagggca ataatcttat ctggaccctg 420
aaggactctg cgggtgaagt acggcagatc acgtttagag atcttccgga taaatttaac 480
gcttatttag cgaacaaatg ggtctttatc actatcacaa atgatcgtct gtcgagcgcc 540
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tatacatcgt atctgtcaat cactttcttg cgggatttct gggggaatcc tcttcggtat 780
gataccgaat actatcttat acctgtggca tctagtagta aggatgtaca gttgaagaac 840
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<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TTD
<400> 2
Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile
20 25 30
Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala
35 40 45
Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn
50 55 60
Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn
65 70 75 80
Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys
85 90 95
Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile
100 105 110
Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser
115 120 125
Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala
130 135 140
Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn
145 150 155 160
Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg
165 170 175
Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala
180 185 190
Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu
195 200 205
Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys
210 215 220
Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu
225 230 235 240
Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn
245 250 255
Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser
260 265 270
Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr
275 280 285
Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg
290 295 300
Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn
305 310 315 320
Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val
325 330 335
Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn
340 345 350
Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro
355 360 365
Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu
370 375 380
Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser
385 390 395 400
Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn
405 410 415
Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp
420 425 430
Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp
435 440 445
Thr Asn Asp
450
<210> 3
<211> 536
<212> PRT
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<220>
<223> CRM197
<400> 3
Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu
1 5 10 15
Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile
20 25 30
Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp
35 40 45
Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala
50 55 60
Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys
85 90 95
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Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe
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Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu
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Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln
165 170 175
Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val
180 185 190
Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp
195 200 205
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Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser
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485 490 495
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500 505 510
Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu
515 520 525
Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535

Claims (10)

1.一种免疫原性组合物，含有来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖和载剂，所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F，
优选地，所述血清型包括选自以下的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24种血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并且所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述血清型包括以下20种血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F，或以下24种血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，
优选地，所述载剂选自盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还含有佐剂，
优选地，所述佐剂包括选自基于铝的佐剂、单磷酰基脂A、QS21、CpG、MF59、硬脂酰酪氨酸、弗氏佐剂和其他粘膜佐剂中的一种或多种。
4.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，来自血清型3，6B或12F的荚膜多糖与其他任一荚膜多糖的重量比为10:1至1:10，例如5:1至1:5，
优选地，所述组合物是制剂，来自血清型3，6B和12F的荚膜多糖的浓度各自独立为1～8ug/剂，其余荚膜多糖的浓度各自独立为0.5～5ug/剂。
5.包含多种的多糖-蛋白质缀合物以及药学上可接受辅料的多价免疫原性组合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物含有缀合到载体蛋白的来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖，
优选地，所述载体蛋白至少包含两种载体蛋白，
优选地，所述血清型至少包括2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F和33F；更优选地，所述血清型包括以下20种血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F，或以下24种血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。
6.如权利要求5所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述载体蛋白包括(1)CRM197和(2)TTD或其变体，
优选地，TTD是TT的C端结构域，
更优选地，TTD具有SEQ ID NO.2所示的序列，TTD变体具有与SEQ ID NO:2有至少90％序列相同性的序列。
7.如权利要求5或6所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，在所述多糖蛋白缀合物中，至少来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的一种或多种或全部荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合，
优选地，
所述血清型包括所述20种血清型，其中来自包括血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F在内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种血清型的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合，或
所述血清型包括所述24种血清型，其中来自包括血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F在内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种血清型的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合，
更优选地，
所述血清型包括所述20种血清型，其中来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合；来自血清型1、4、6A、7F、8、9V、10A、11A、14、19A、22F、33F的荚膜多糖分别与载体蛋白CRM197缀合，或
所述血清型包括所述24种血清型，其中来自血清型3、5、6A、6B、9N、11A、12F、15B、17F、18C、19A、19F、20、23F、33F的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合；来自血清型1、2、4、7F、8、9V、10A、14、22F的荚膜多糖分别与载体蛋白CRM197缀合，或
所述血清型包括所述24种血清型，其中来自血清型3、5、6B、12F、15B、18C、19F和23F的荚膜多糖分别与载体蛋白TTD或其变体缀合；来自血清型1、2、4、6A，7F、8、9N、9V、10A、11A、14、17F、19A、20、22F、33F的荚膜多糖分别与载体蛋白CRM197缀合。
8.如权利要求5或6所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物还具有选自以下的一项或多项特征：
所述组合物中，来自血清型3，6B或12F的荚膜多糖与其他任一荚膜多糖的重量比为10:1至1:10，例如5:1至1:5，
所述组合物是制剂，来自血清型3，6B和12F的荚膜多糖的浓度各自独立为1～8ug/剂，其余荚膜多糖的浓度各自独立为0.5～5ug/剂，
所述组合物还包含佐剂；优选地，所述佐剂包括选自基于铝的佐剂、单磷酰基脂A、QS21、CpG、MF59、硬脂酰酪氨酸、弗氏佐剂和其他粘膜佐剂中的一种或多种，
所述组合物中，缀合物与佐剂的重量比为1:10至1:2，
所述组合物还包含表面活性剂；优选地，组合物中表面活性剂的浓度为100～300μg/剂，
所述组合物的pH为5.0-7.0。
9.权利要求1-8中任一项所述的免疫原性组合物在制备诱导对肺炎球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答和/或对破伤风毒素的免疫应答的药物中的用途，
优选地，所述药物用于预防或治疗肺炎球菌感染和/或破伤风毒素感染。
10.一种导致被动免疫的免疫组合物，包括靶向肺炎球菌的杀菌抗体，所述抗体是由权利要求1-8中任一项所述的免疫原性组合物免疫哺乳动物而获得，
优选地，所述杀菌抗体存在于血清、γ球蛋白部分或纯化的抗体制剂中。
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CN103656632B (zh) * 2012-09-24 2016-01-13 北京科兴中维生物技术有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用
CN110251667A (zh) * 2018-05-11 2019-09-20 武汉博沃生物科技有限公司 一种免疫组合制剂及其制备方法和应用
TW202116352A (zh) * 2019-07-18 2021-05-01 南韓商賽特瑞恩股份有限公司 包含多價肺炎球菌多醣-蛋白共軛物的免疫組成物、醫藥組成物及其用途
AU2020323498A1 (en) * 2019-07-31 2022-03-03 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same

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